中華三脊甲生物學(xué)特性及進(jìn)化分析

劉鵬，廖承清，徐家生，郭青云，戴小華,2，鐘苗

(1.贛南師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院潛葉昆蟲研究組，江西 贛州 341000;2.國家臍橙工程技術(shù)研究中心，江西 贛州 341000)

中華三脊甲Agonitachinensis(Weise)隸屬于鞘翅目Coleoptera葉甲科Chrysomelidae潛甲亞科Anisoderinae三脊甲屬Agonita，該屬主要分布于東洋區(qū)和非洲區(qū)[1]，全世界共有128種[2]，我國有記錄22種，主要分布云南、福建、四川、廣西等地[1]。三脊甲屬幼蟲均為潛食性，成蟲為外食性，國內(nèi)僅3種報道其寄主為竹類，雖然陳世驤 等在《中國動物志 昆蟲綱 鞘翅目 鐵甲科》和《云南生物考查報告》中對中華三脊甲的成蟲形態(tài)特征和分布進(jìn)行了詳細(xì)描述，但對其寄主描述較粗略[1,3]。目前有關(guān)該種的幼蟲和蛹的生物學(xué)方面未見報道。

竹類潛葉害蟲豐富，近年來僅潛葉昆蟲研究組就采集飼養(yǎng)了3目4科十余種，涵蓋雙翅目Diptera潛蠅科Agromyzidae，鱗翅目Lipidoptera小潛蛾科Elachistidae、尖蛾科Cosmopterygidae，鞘翅目吉丁科Buprestidae、葉甲科(平脊甲屬Agoniella、三脊甲屬Agonita、趾鐵甲屬Dactylispa)等。

中華三脊甲目前已有報道寄主僅有簝竹屬(箬竹屬Indocalamus)[1]，作者近年陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其寄主遠(yuǎn)超已報道的類群，除簝竹屬外，還寄生于大節(jié)竹屬大節(jié)竹Indosasacrassiflora、剛竹屬Phyllostachys、簕竹屬Bambusa坭竹Bambusagibba等。大節(jié)竹和剛竹屬具有很高的觀賞性價值，常用于城市園林綠化，剛竹屬還是優(yōu)良的筍用竹，其產(chǎn)值達(dá)全國竹類產(chǎn)值的90%以上[4-5]；坭竹常作為耗材，用于圍籬、農(nóng)具、漁具等，還可用于造紙，具有很高的經(jīng)濟(jì)意義[6]。中華三脊甲成蟲在葉片表面取食，留下明顯的條狀食痕，幼蟲潛食進(jìn)葉片內(nèi)部，取食葉肉，形成白色大斑塊狀潛道，潛食部位基本無光合作用，成蟲與幼蟲取食葉片均影響葉片美觀，降低觀賞性，且易造成葉片脫落，影響植株長勢，蟲害大暴發(fā)時全株1/5以上的葉片被危害，造成極大經(jīng)濟(jì)損失。研究中華三脊甲的生物學(xué)特性可為防治提供一定的理論基礎(chǔ)。

目前國內(nèi)應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對中華三脊甲種群遺傳學(xué)、物種間的親緣關(guān)系和系統(tǒng)進(jìn)化等方面研究較匱乏。作者通過野外采集、實驗室飼養(yǎng)等手段，系統(tǒng)研究其生物學(xué)特性，結(jié)合總DNA提取和COI基因的擴(kuò)增[7]，對其中細(xì)胞色素氧化酶I亞基基因(mtCOI)序列進(jìn)行分析，研究結(jié)果不僅有助于預(yù)防其危害，減少危害發(fā)生，也可為探討三脊甲的進(jìn)化關(guān)系提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料來源 采集被中華三脊甲潛食危害的竹子枝條若干，裝入封口塑料袋，依據(jù)采集的時間、地點等進(jìn)行編號。在實驗室利用EPSON掃描儀采集寄主植物標(biāo)本圖像和有潛道的葉片圖像，對成功羽化的成蟲進(jìn)行記錄、拍照、鑒定并制成針插標(biāo)本，將寄主植物送鑒。標(biāo)本分別采自江西省龍南縣安基山森林公園、龍南縣九連山國家自然保護(hù)區(qū)、貴州省荔波縣茂蘭國家自然保護(hù)區(qū)和云南省景洪縣西雙版納植物園等地。

1.1.2 生物學(xué)習(xí)性觀察 將有活蟲的植物用沾水棉花包住枝條末端，放置實驗室飼養(yǎng)，幼蟲及蛹分袋飼養(yǎng)，記錄各階段發(fā)生時間及持續(xù)時間，在體視顯微鏡下觀察、解剖、拍照各蟲態(tài)的形態(tài)特征。

1.1.3 材料處理 在實驗室從寄主植物潛道中挑選出一部分老熟幼蟲放置-80 ℃冷凍保存；一部分浸泡于無水乙醇中備用；其它老熟幼蟲于實驗室飼養(yǎng)，收取蛹和成蟲浸泡于無水乙醇，放置-80 ℃冷凍保存。共飼養(yǎng)出成蟲54只，分別制成標(biāo)本，應(yīng)用IPM Scope攝像頭和Canon EOS 7D及微距攝像頭進(jìn)行拍照，鏡檢鑒定為中華三脊甲。檢查標(biāo)本均保存于贛南師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院(國家臍橙工程技術(shù)研究中心)蟲害防控實驗室。

1.2 總DNA提取及COI基因的擴(kuò)增和系統(tǒng)發(fā)生分析 使用Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒提取中華三脊甲的線粒體基因組，采用線粒體COI基因的通用引物HCO2198(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′)和LCO1490(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)[8]，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系為50 μL,包括5倍PrimeSTAR Buffer 10 μL，PrimeSTAR酶 0.5 μL，dNTP Mix 4 μL，引物HCO2198 2 μL，引物L(fēng)CO1490 2 μL，無菌水26.5 μL，模板5 μL。PCR程序：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性1 min，45 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，6個循環(huán)，94 ℃變性1 min，51 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃總延伸10 min。利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，并使用Omega質(zhì)粒提取試劑盒切膠回收，送至上海生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，利用GeneStudio修正測序得到的中華三脊甲部分COI序列(GenBank序列號MF133458)，上傳至NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast，與GenBank中已有序列進(jìn)行同源性比對，選擇其中合適的序列結(jié)果用Mega7.0軟件建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)特征

幼蟲 體扁平，黃色半透明，老熟幼蟲體長5.5～6.0 mm。頭部部分外露，約3/4隱藏于前胸內(nèi)，頭殼凹頂形，頭葉部分明顯短于頭長之半，口器向前。胸部無足，與腹部顏色相同，或稍淡；前胸呈半圓形，前緣向前延伸呈弧形，后緣向后彎曲呈弓形；中胸略寬于前胸后緣，中部略窄于兩側(cè)，前側(cè)緣兩邊各具一小刺突，刺突后具一微突；后胸寬略小于中胸，近長方形，側(cè)緣中部各具一突起，大小和中胸相當(dāng)。腹部9節(jié)，各節(jié)連接處明顯呈溝狀，第1～3腹節(jié)寬度大致相同，4～6腹節(jié)寬略小于第3腹節(jié)，第7腹節(jié)后逐漸減小，腹節(jié)最寬處不超過中后胸；除第9腹節(jié)外，每腹節(jié)兩側(cè)各具1對突起，突起部分外側(cè)各具1管狀刺突，第1～5對突起近半圓形，第6～8對接近三角形，除第1對刺突平指兩側(cè)外，其余刺突均略斜指向后方，且角度逐漸增大。第9腹節(jié)分節(jié)明顯，兩側(cè)無突起和刺突，肛門位于第9腹節(jié)腹面，頂端中央略凹陷。幼蟲具有9對氣孔，胸部1對，位于中胸前側(cè)角，錐形長管狀，大而明顯；其余8對分別位于腹部1～8腹節(jié)側(cè)緣基部，不明顯(圖1A)。

蛹 長條形，長6.5～7.5 mm。頭部光禿，中央凹陷。前胸梯形，兩側(cè)弧圓，中央高于頭部，盤區(qū)寬闊，長略勝于寬；中胸略寬于前胸，中部兩側(cè)各具1個圓形凹窩，后緣與后胸結(jié)合處呈弓形；后胸長顯勝于中胸，后緣中部稍向腹部延伸。腹部9節(jié)，兩側(cè)無突起，每節(jié)中部顏色較深，第2～7腹節(jié)背板中央有一些小突起，第7腹節(jié)中部及第8腹節(jié)后緣具少量淡色毛；除第9腹節(jié)外，其余每腹節(jié)側(cè)緣各具氣孔1對，第1對氣孔較短，不清晰，第2～6對氣孔大而明顯，短管狀，顯著突出于側(cè)緣，6對氣孔均位于側(cè)緣中部偏后，第7～8對氣孔細(xì)而小，不甚清晰，位于側(cè)緣端部。從腹面看，頭部口器各部分較為清晰，觸角緊貼身體兩側(cè)，末端伸至前足腿節(jié)末端，3對足及2對翅特征明顯，清晰可辨，各腹節(jié)后緣光亮，稍微隆起，第8腹節(jié)中部內(nèi)凹，幾乎被第9腹節(jié)前緣分為兩半(圖1B)。

成蟲 體長方形，約6.2 mm，較扁闊，棕紅色，具光澤，觸角褐黑，基部兩節(jié)略紅，鞘翅黑色，腹面及足棕黃色。頭部與前胸前緣等闊，頭頂光滑無刻點。前胸闊略勝于長，兩側(cè)邊框顯著，盤區(qū)刻點粗疏，前緣一橫列刻點，中部間斷，基部中央兩側(cè)各有一淺斜凹。鞘翅基較前胸略闊，肩后邊緣較膨，端緣鋸齒明顯，每翅脊線3條，第1，2條完整，第3條大部中斷，僅留基、端兩處，刻點8行，除第3脊線與側(cè)緣中部刻點并成1行，其余均為雙行，足粗短，前足跗節(jié)較寬大，中后足跗節(jié)較小，短于脛節(jié)[1](圖1C)。

2.2 生物學(xué) 經(jīng)野外觀察和實驗室飼養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，中華三脊甲1 a發(fā)生1代，以成蟲越冬，貴州荔波于3月下旬出現(xiàn)，贛南地區(qū)于4月初出現(xiàn)。成蟲產(chǎn)卵半嵌于葉內(nèi)(圖1D)，孵化后的幼蟲可自產(chǎn)卵孔鉆入葉內(nèi)于葉片上下表皮之間取食葉肉，隨著不斷取食，形成潛道，潛食后潛道表面塌陷，似凹凸不平，葉肉部分被取食殆盡，形成白色大斑狀潛道(圖1E)，被取食部分基本無法進(jìn)行光合作用，嚴(yán)重影響整體葉片的光合作用，且導(dǎo)致葉片易脫落，影響植物的整體光合作用及長勢。幼蟲老熟后在潛道內(nèi)完成化蛹，有預(yù)蛹期，8月中、下旬蛹期結(jié)束后在潛道內(nèi)羽化，待體色沉著和身體硬化后才鉆出潛道。成蟲羽化鉆出后留下完整潛道，邊緣無破損，只有產(chǎn)卵孔及成蟲鉆出潛道的孔。成蟲具飛翔能力，活動能力強(qiáng)，受驚后會立即飛走或掉落假死。

寄主：禾本科Gramineae簝竹屬[1]；剛竹屬、大節(jié)竹屬大節(jié)竹、簕竹屬坭竹(新寄主記錄)。

分布：山東、福建、廣東、廣西、貴州、云南[1]；江西(龍南縣安基山森林公園、龍南縣九連山國家自然保護(hù)區(qū)—新記錄地)。

注：A.幼蟲背腹面；B.蛹背腹面；C.成蟲背腹面；D.卵；E.潛道；F-G.雌雄差異(F.中足；G.觸角)(圖中標(biāo)尺均為1 mm)圖1 中華三脊甲各蟲態(tài)及雌雄差異比較

2.3 中華三脊甲進(jìn)化關(guān)系 中華三脊甲COI基因片段長約688 bp，堿基A,T,G,C含量分別為33.6%,38.2%,14.5%,13.7%；A+T含量遠(yuǎn)大于C+G含量，具有明顯的偏向性，符合昆蟲COI基因特點。上傳中華三脊甲COI序列至GenBank，取得基因號MF133458。基于Blast結(jié)果，以星天牛Anoplophorachinensis和桑天牛Apriponagermari作為外群(outgroup)，利用Mega7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育NJ樹(圖2)?；诎l(fā)育樹分析，龜甲屬Cassida和梳龜甲屬Aspidimorpha為1支、溝龜甲屬Chiridopsis和蠟龜甲屬Laccoptera為1支，掌鐵甲屬Platypria、鐵甲屬Hispa和稻鐵甲屬Dicladispa等鐵甲類為1支，中華三脊甲、Anisostena屬和Sumitrosis屬為1支，Microrhopala屬、Baliosus屬和Charidotella屬為1支。

圖2 中華三脊甲與其它龜甲亞科昆蟲的親緣關(guān)系

3 結(jié)論與討論

中華三脊甲為江西省新記錄種，在國內(nèi)山東、福建、廣東、廣西、貴州、云南等地區(qū)分布[1]。值得注意的是，中華三脊甲呈現(xiàn)地區(qū)性變異[1]，江西贛南標(biāo)本前胸背板刻點較稀，中央小區(qū)域無刻點，刻點大而粗；貴州荔波標(biāo)本前胸背板刻點較密，布及整個背板，刻點小。中華三脊甲成蟲在感受到危險時，常會假死并掉落下來，這與棗掌鐵甲類似[9]，是昆蟲的一種自我保護(hù)方式。而棗掌鐵甲Platypriamelli及其它部分潛葉蟲的轉(zhuǎn)移潛道行為[9,10]，在中華三脊甲中并未發(fā)現(xiàn)，這應(yīng)該是由于中華三脊甲幼蟲不具胸足所致，在脫離原潛道后無法固定身體及尋找合適的地點，無法快速轉(zhuǎn)移也使得幼蟲不能適應(yīng)外界多變的環(huán)境以及天敵的存在。中華三脊甲成蟲常產(chǎn)卵在嫩葉上，幼蟲就地取食嫩葉，這與取食桉樹的葉甲Chrysophthartaagricola[11]類似，易造成葉片脫落和枯死，造成經(jīng)濟(jì)損失。

中華三脊甲雌雄有較為明顯的差異，主要表現(xiàn)為：雄蟲中足脛節(jié)較雌蟲細(xì)而彎，略呈鐮刀狀，而雌蟲中足脛節(jié)明顯寬闊且略彎[1]；雄蟲觸角顯較雌蟲為長，雄蟲觸角可達(dá)體長1/3，雌蟲觸角只有體長的1/4左右(圖1F、G)。

從系統(tǒng)發(fā)育樹來看，龜甲屬、梳龜甲屬、溝龜甲屬、蠟龜甲屬為一大支，均屬于龜甲類，掌鐵甲屬、鐵甲屬、稻鐵甲屬為一大支，均屬于鐵甲類，這兩支同源性高，與陳世驤[4]的鐵甲志分類相類似。中華三脊甲與Anisostena屬接近，與Sumitrosis屬較為接近，三者屬脊甲類，成蟲形態(tài)上相似，初步證明分子手段可以輔助形態(tài)學(xué)分類。Anisostena屬和Sumitrosis屬尚無中國分布記錄，這三屬間的親緣關(guān)系有待進(jìn)一步研究。未來可以通過潛葉鐵甲的食性分析，探討取食竹類潛葉害蟲的起源與演化途徑。

志謝：感謝黔南民族師范學(xué)院俞筱押副教授和贛南師范大學(xué)符潮幫助鑒定植物標(biāo)本，感謝潛葉昆蟲組的各位同學(xué)幫忙采集制作標(biāo)本、掃描圖片及整理名錄等工作，感謝江西省安基山森林公園、九連山國家級自然保護(hù)區(qū)、貴州省茂蘭國家級自然保護(hù)區(qū)和中科院西雙版納植物園提供采集便利。