益智不同部位化學(xué)成分及清除DPPH自由基活性比較

劉琳　李生茂　張帆　張世鵬 唐友愛

【摘 要】 目的：比較益智不同部位化學(xué)成分及清除DPPH自由基活性。方法：采用UV法和HPLC法對(duì)益智、益智仁和益智殼的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，采用DPPH法評(píng)價(jià)其抗氧化活性。結(jié)果：益智和益智仁的UV、HPLC圖譜較為相似，而與益智殼的差異明顯；益智、益智仁和益智殼清除DPPH自由基的IC50依次為1.098、1.763和0.815mg/mL（相當(dāng)于生藥）。結(jié)論：益智和益智仁化學(xué)成分相似，益智殼化學(xué)成分與二者差異較大；益智、益智仁和益智殼均具有清除DPPH自由基的作用，其中益智殼作用最強(qiáng)。

【關(guān)鍵詞】 益智；不同部位；化學(xué)成分；DPPH

【中圖分類號(hào)】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2018）12-0023-04

Abstract：Objective To compare the chemical constituents and DPPH free radical scavenging activity of different parts of Alpiniae Oxyphyllae Fructus.Methods The chemical constituents of the fruit， seeds and peels were analyzed by UV and HPLC， and the antioxidant effect of all samples was determined by DPPH method. Results Both of the UV and HPLC spectral graphs of fruit and seeds were similar， which have great difference with the peels. The IC50 of the DPPH free radical scavenging was 1.098， 1.763 and 0.815mg/mL（crude drug）. Conclusion The fruit and seeds have similar chemical constituents， which have great difference with the peels. All samples had？DPPH free radical scavenging activity， and the peels had the strongest scavenging capacity.

Keywords：Alpiniae Oxyphyllae Fructus； Different Parts； Chemical Constituents；DPPH

益智為姜科植物益智（Alpinia oxyphylla Miq）的干燥成熟果實(shí)，具有暖腎固精縮尿，溫脾止瀉攝唾的功效[1]。研究顯示益智含有萜類、黃酮類、二苯庚烷類等化學(xué)成分，具有神經(jīng)保護(hù)、提高學(xué)習(xí)記憶、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、抗炎、強(qiáng)心和鎮(zhèn)靜催眠等廣泛的藥理活性[2-6]。多部中國藥典記載益智（完整果實(shí)）需除去外殼（益智殼）種子團(tuán)（益智仁）入藥或進(jìn)一步炮制使用，而占益智果實(shí)重量約30%的外殼則作為廢物丟棄，在一定程度上造成了益智藥材資源的浪費(fèi)[1，7，8]。目前，有關(guān)益智殼與仁的化學(xué)成分的比較研究多集中揮發(fā)油[9-12]、總黃酮、總多糖[12]和寡聚糖[13]等大類成分的含量測(cè)定以及揮發(fā)油[9-11，14]化學(xué)成分的分析。而采用HPLC法對(duì)益智仁與益智殼中整體化學(xué)成分的對(duì)比分析較少，且未見有其抗氧化活性比較研究報(bào)道?；诖耍瑢?shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上[6]，分別采用UV和HPLC對(duì)益智、益智仁和益智殼的化學(xué)成分進(jìn)行對(duì)比分析，并采用DPPH法比較了抗氧化活性的差異，以期為更加合理利用益智藥材資源提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 材料 益智（批號(hào)：140101）藥材購于南充五星金方中藥飲片有限公司，經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院李毅主任中藥師鑒定為姜科植物益智（Alpinia oxyphylla Miq）的干燥成熟果實(shí)，益智藥材剝開，人工分離得到益智仁和益智殼。1，1-二苯基苦基苯肼（批號(hào)：034K1071，sigma公司），甲醇（批號(hào)：201309230，成都市科龍化工試劑廠），水為超純水（自制）。

1.2 儀器 Agilent1220高效液相色譜儀；KQ3200 DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限責(zé)任公司） ；Ohaus Discovery十萬分之一電子分析天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司）；Epoch 微孔板分光光度計(jì)（美國BIOTEK公司）；島津1750紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備 取益智不同部位樣品粗粉約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入20 mL甲醇，稱定質(zhì)量，超聲30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 益智不同部位樣品UV分析 取“2.1”項(xiàng)下方法供試品溶液，加適量甲醇稀釋40倍，于紫外分光光度計(jì)在200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，記錄光譜圖。整體而言，益智仁和益智UV圖譜峰形較為相似，僅為吸收強(qiáng)度有所不同，但兩者與益智殼在260～285 nm則差異明顯，益智殼在該波長(zhǎng)區(qū)間的吸光度更強(qiáng)、變化更緩慢，呈明顯的平臺(tái)。此外，益智、益智仁和益智殼在217 nm處均有一明顯的吸收峰，吸收強(qiáng)度大小依次為益智殼、益智和益智仁。結(jié)果如圖1所示。

2.3 益智不同部位樣品化學(xué)成分HPLC分析

2.3.1 HPLC色譜條件[6] 色譜柱：Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）–0.4%磷酸水（B），梯度洗脫（0～15 min，35%A；15～32 min，35%～70% A；32～48 min，70%～77% A）；流量：0.6 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.3.2 樣品測(cè)定 按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，在同一色譜條件下，益智仁與益智HPLC色譜圖相似性較高，僅存在個(gè)別色譜峰有無及部分色譜峰峰面積大小的差異。益智仁和益智殼HPLC色譜圖則存在較大差異，益智仁HPLC色譜圖中前30 min色譜峰數(shù)量遠(yuǎn)多于益智殼，而在37～39 min，益智殼則出現(xiàn)3個(gè)新的色譜峰。進(jìn)一步通過與對(duì)照品比對(duì)，確認(rèn)了樣品HPLC色譜圖中白楊素、楊芽黃素和圓柚酮的色譜峰。其中，白楊素和楊芽黃素在各樣品中峰面積的大小順序均為：益智殼﹥益智﹥益智仁，圓柚酮在各樣品中峰面積的大小順序?yàn)椋阂嬷侨施円嬷签円嬷菤?，并且在該檢測(cè)條件下，益智仁未檢出楊芽黃素，結(jié)果如圖2所示。

2.3.3 相似度分析 采用由國家藥典委員會(huì)開發(fā)的《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A）》軟件，選取中位數(shù)法自動(dòng)匹配，對(duì)益智不同部位樣品HPLC圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算相似度。結(jié)果顯示，益智仁與益智相似度較高，達(dá)0.990，而與益智殼相似度較低，為0.862，見表1。

2.4 益智不同部位樣品清除DPPH自由基活性比較

2.4.1 DPPH溶液配制 精密稱取DPPH適量，加甲醇配置濃度為170 μmol/L溶液，避光保存。

2.4.2 清除DPPH自由基作用 按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，加甲醇稀釋成不同質(zhì)量濃度（相當(dāng)于生藥量）的供試品溶液。取0.15 mL供試品溶液，與0.15 mL DPPH溶液置96孔板上，混勻后室溫避光放置60 min，517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度Ai，同時(shí)測(cè)定0.15 mL甲醇與0.15 mL DPPH溶液A0，計(jì)算清除率，公式為：清除率=（1-Ai/A0）×100%。以清除率（Y）對(duì)藥物質(zhì)量終濃度（X）進(jìn)行對(duì)數(shù)回歸，求出清除率為50%時(shí)藥物的質(zhì)量濃度（IC50）。結(jié)果見表2。

3 討論

實(shí)驗(yàn)采用UV法對(duì)益智不同部位樣品化學(xué)成分整體特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)益智仁和益智UV圖譜更為相似，僅存吸收強(qiáng)弱的區(qū)別，但與益智殼的UV圖譜部分特征峰的峰形、位置和吸收強(qiáng)度有明顯不同，暗示益智和益智仁與和益智殼中所含化學(xué)成分的種類和含量存在較大差異。進(jìn)一步采用HPLC法分析了益智不同部位的化學(xué)成分組成，直觀發(fā)現(xiàn)益智仁與益智HPLC色譜圖相似性較高，僅存在個(gè)別色譜峰數(shù)量及部分色譜峰峰面積大小不同；而益智仁與益智殼的HPLC色譜圖區(qū)別明顯，前者色譜圖中色譜峰數(shù)量明顯多后者色譜圖中的，這與吳德玲等研究結(jié)果相似[12]。進(jìn)一步通過對(duì)照品與HPLC圖譜中部分色譜峰比對(duì)，發(fā)現(xiàn)益智中白楊素和楊芽黃素等黃酮類成分主要集中在益智殼中，而萜類成分圓柚酮?jiǎng)t主要集中在益智仁中。相似度分析結(jié)果也顯示，益智仁與益智相似度較高，達(dá)到0.990，益智殼與益智和益智仁相似度較低，相似度分別為0.903和0.862，該結(jié)果與直觀分析結(jié)果較為一致。

清除DPPH自由基活性測(cè)定結(jié)果顯示，益智、益智仁和益智殼均具有一定程度的清除DPPH自由基活性，但強(qiáng)弱有所不同，其中以非傳統(tǒng)藥用部位的益智殼清除DPPH自由基活性最強(qiáng)，值得進(jìn)一步的開發(fā)利用。實(shí)驗(yàn)僅比較了益智仁和益智殼甲醇提取物清除DPPH自由基的活性，其清除DPPH自由基的活性成分以及對(duì)其它自由基是否具有清除活性尚有待進(jìn)一步的研究。

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（收稿日期：2018-04-12 編輯：程鵬飛）