二甲雙胍對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷后纖維化的影響

蘇娟

[摘要] 目的 探討二甲雙胍對(duì)大鼠腎臟缺血再灌注后纖維化改變的保護(hù)作用。 方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將24只SD雄性成年大鼠分為假手術(shù)（Sham）組、缺血再灌注（I/R）組和二甲雙胍（Metformin）處理組，每組8只。再灌注12周后，檢測(cè)各組大鼠血清肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）水平，蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson染色觀察腎組織結(jié)構(gòu)變化和纖維化改變；免疫組織化學(xué)觀察α-平滑肌肌動(dòng)蛋（α-SMA）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）分布；Western blot進(jìn)一步檢測(cè)α-SMA和TGF-β1的表達(dá)水平。 結(jié)果 Sham組、I/R組和Metformin組間Cr和BUN比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。與Sham組比較，I/R組和Metformin組大鼠腎臟出現(xiàn)了明顯間質(zhì)纖維化，但是Metformin組與I/R組比較腎臟間質(zhì)纖維化明顯減輕；與Sham組比較，I/R組和Metformin組大鼠腎臟α-SMA和TGF-β1的表達(dá)水平顯著升高，Metformin組與I/R組比較，大鼠腎臟α-SMA和TGF-β1的表達(dá)水平顯著降低；差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 腎臟缺血再灌注損傷可以引起小管間質(zhì)纖維化，二甲雙胍處理可以減輕此病理改變，其作用可能與二甲雙胍能夠抑制α-SMA和TGF-β1表達(dá)相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 缺血再灌注損傷；二甲雙胍；腎；纖維化

[中圖分類號(hào)] R692.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）08（a）-0022-05

[Abstract] Objective To assess the potential effects of Metformin on the development of tubulointerstitial fibrosis after acute renal ischemia-reperfusion. Methods Twenty-four male Sprague Dawley rats were randomly assigned to three groups： Sham group， I/R group and Metformin group （n = 8）. Twelve weeks after reperfusion， levels of serum urea nitrogen （BUN） and creatinine （Cr） were assessed； Hematoxylin-eosin （H&E;） and Masson′s trichrome staining were used to assess renal fibrosis； the expression spot and protein levels of α-smooth muscle actin （α-SMA） and transforming growth factor-β1 （TGF-β1） were analyzed by immunohistochemistry （IHC） and Western blot. Results There was no statistically significant difference in levels of Cr and BUN among Sham group， I/R group and Metformin group （P > 0.05）. Compared with the Sham group， tubulointerstitial fibrosis was more obvious in the I/R group and the Metformin group； however， the level of tubulointerstitial fibrosis in the Metformin group was less than that of the I/R group. Compared with the Sham group， the levels of α-SMA and TGF-β1 were significantly increased in the I/R group and the Metformin group， the expression of α-SMA and TGF-β1 in the Metformin group were significantly decreased compared with those in the I/R group； the differences were statistically significant （P < 0.01）. Conclusion Administration of metformin significantly attenuated tubuleinterstitial fibrosis following I/R in rats， potentially via down-regulating expressions of α-SMA and TGF-β1.

[Key words] Ischemia-reperfusion injury； Metformin； Renal； Fibrosis

缺血再灌注損傷（ischemia/reperfusion injury，I/R）在腎移植、腎部分切除手術(shù)、腎動(dòng)脈狹窄、主動(dòng)脈搭橋手術(shù)、栓塞性疾病、意外或醫(yī)源性損傷等過程中不可避免，是臨床診療過程中常見的一種病理生理改變[1-2]。腎缺血可導(dǎo)致急性再灌注損傷，從而導(dǎo)致腎功能延遲恢復(fù)，并可能導(dǎo)致腎臟纖維化改變，進(jìn)而產(chǎn)生慢性腎功能損害[3-4]。二甲雙胍（Metformin）是一種常用的口服降糖藥，用于治療2型糖尿病。單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）可以通過抑制合成代謝，促進(jìn)分解代謝，增加ATP的合成，并降低ATP的利用，從而滿足缺血組織的能量需求，參與脂肪酸氧化、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、糖酵解、三酰甘油合成和蛋白質(zhì)合成等一系列生物過程[5-9]。二甲雙胍能夠激活A(yù)MPK[10]，并已經(jīng)被證實(shí)能緩解心臟缺血后的炎性反應(yīng)，保護(hù)心臟功能[11]；AMPK激動(dòng)劑被證實(shí)在體外和SD大鼠、犬體內(nèi)均能減輕腎上皮細(xì)胞的缺血再灌注損傷[12-13]；此外，AMPK活化還能夠抑制心臟纖維化和肝纖維化過程[14-15]。但是，目前鮮有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道二甲雙胍對(duì)缺血再灌注損傷造成的腎臟慢性纖維化是否具有保護(hù)作用。本研究采用SD大鼠構(gòu)建腎缺血再灌注損傷慢性纖維化模型，探討二甲雙胍對(duì)腎缺血再灌注損傷導(dǎo)致的慢性纖維化是否具有保護(hù)作用，并探索其中可能涉及的相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

24只健康成年雄性SD大鼠（SPF級(jí)），月齡6～8周，體重200～250 g，平均（235.3±6.5）g，均由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：4200980000106）。通過隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組（Sham組）、對(duì)照組（I/R組）和二甲雙胍處理組（Metformin組），每組各8只。

1.2 儀器與試藥

α-平滑肌肌動(dòng)蛋（α-SMA，19245）購自Cell Signaling Technology公司、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1，sc-130148）和β-肌動(dòng)蛋白（β-actin，sc-47778）單克隆抗體均購自Santa Cruz公司。血清Cr和BUN檢測(cè)采用全自動(dòng)生化分析儀（Olympus，型號(hào)Au2700）。

1.3 動(dòng)物模型的建立

大鼠在動(dòng)物房，配置好飼料、飲水、墊料，做好通風(fēng)，12 h/12 h明暗交替適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，術(shù)前禁食12 h，禁水8 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（4390-14-3，購自Sigma）30 mg/kg麻醉。Sham組：麻醉成功后，經(jīng)腹正中切口進(jìn)入腹腔，先切除右腎，游離左側(cè)腎臟及腎蒂，但不夾閉腎蒂，手術(shù)后縫合關(guān)閉腹壁。I/R組：手術(shù)過程與Sham組相同，在切除右腎之后充分暴露并游離左腎及腎蒂，并將左腎蒂夾閉45 min然后開通恢復(fù)灌流，構(gòu)建缺血再灌注模型。觀察腎臟由暗紅色變?yōu)榧t色則表示復(fù)灌成功。Metformin組：手術(shù)過程同I/R組，從術(shù)后第1天開始連續(xù)經(jīng)腹腔注射二甲雙胍125 μg/（kg·d），連續(xù)給予12周。

1.4 標(biāo)本采集和處理

分別于缺血再灌注模型建立12周后，處死并收集靜脈血和腎臟組織標(biāo)本。麻醉后，經(jīng)下腔靜脈采血，然后處死各組大鼠，收集腎臟組織，一部分迅速置入液氮罐中保存待行蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)；另一部分用4%多聚緩沖甲醛溶液固定后，常規(guī)石蠟包埋，待行HE染色和免疫組化分析。

1.4.1 大鼠腎功能測(cè)定 采用全自動(dòng)生化分析儀（Olympus，型號(hào)Au2700）測(cè)定每組大鼠血清肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）水平。

1.4.2 組織病理形態(tài)學(xué) 取大鼠腎組織，先用多聚甲醛固定，然后脫水、透明、浸蠟、包埋，再切片、脫蠟，行蘇木精-伊紅（HE）染色，然后在400倍光鏡下觀察其病理改變并拍照；石蠟切片脫蠟蒸餾水洗后，蘇木精染液染核5 min，麗春紅酸性復(fù)紅液染5 min，2%冰醋酸水洗后，1%磷鉬酸分化3 min。用苯胺藍(lán)染5 min后，將切片依次放入95%乙醇、無水乙醇、二甲苯中，最后中性樹膠封固。在400倍光鏡下觀察染色情況。腎小管間質(zhì)纖維化程度的評(píng)估，以皮質(zhì)和外髓質(zhì)部受損面積占每高倍鏡（400×）面積的百分比來判斷。

1.4.3 腎臟免疫組織化學(xué) 腎組織切片以新鮮配制的體積分?jǐn)?shù)為3%的H2O2滅活細(xì)胞內(nèi)源性過氧化物酶，然后用血清封閉，根據(jù)測(cè)試指標(biāo)分別滴加α-SMA和TGF-β1抗體以及相應(yīng)生物素化二抗，DAB顯色，封片。

1.4.4 Western blot檢測(cè) 取各組小鼠腎用RIPA組織細(xì)胞裂解液勻漿后裂解，提取細(xì)胞總蛋白SDS-PAGE進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，電轉(zhuǎn)至NC膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后，TBS洗膜。封閉液中按1∶1000加一抗即兔抗鼠α-SMA和TGF-β1單克隆抗體（β-actin作為內(nèi)參），緩慢搖動(dòng)4℃過夜，棄去一抗，TBST洗膜，加羊抗兔IgG二抗，緩慢搖動(dòng)1 h，TBST洗膜。化學(xué)發(fā)光法曝光（ECL顯示法），顯影、定影后，拍照觀察膠片上的條帶，Imag J軟件分析灰度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎功能變化

三組大鼠血清Cr和BUN水平的比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖1。

2.2 組織學(xué)改變

光鏡下可見Sham組中的腎臟結(jié)構(gòu)未見明顯改變，而I/R組中的腎臟明顯破壞，近曲小管的上皮細(xì)胞明顯壞死，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可見管型。而Metformin組的腎臟組織損傷與缺血再灌注組比較相對(duì)較輕，近曲小管近端壞死明顯減少，偶見管型。見圖2（封四）。

Masson染色顯示，與Sham組比較，I/R組和Metformin組大鼠腎臟纖維化病變明顯；而與I/R組比較，Metformin組可以減輕因缺血導(dǎo)致的纖維化改變。各組纖維化程度比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見圖3（封四）、表1。

2.3 免疫組織化學(xué)表現(xiàn)

α-SMA主要表達(dá)于腎小管間質(zhì)區(qū)，而TGF-β1主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)，二者的陽性表達(dá)區(qū)域與腎小管間質(zhì)纖維化病變區(qū)分布一致。I/R組和Metformin組大鼠腎臟α-SMA和TGF-β1水平均明顯高于sham組（P < 0.01）；而與I/R組比較，Metformin組的上述指標(biāo)水平顯著下降（P < 0.01）。見圖4（封四）、表2。

2.4 Western blot檢測(cè)

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，I/R組、Metformin組與Sham組比較，α-SMA的表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；Metformin組與I/R組比較，α-SMA的表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。TGF-β1在I/R組、Metformin組的表達(dá)明顯高于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；TGF-β1在Metformin組的表達(dá)又低于I/R組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖5。

3 討論

I/R是在缺血的基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后，組織器官的損傷反而加重的現(xiàn)象。腎小管內(nèi)皮及上皮細(xì)胞自身具有一定的修復(fù)功能，輕度的急性I/R所導(dǎo)致的腎臟功能及病理損傷是可逆的。但是，隨著腎缺血缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，近期會(huì)導(dǎo)致腎的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，引起急性腎功能不全；遠(yuǎn)期主要表現(xiàn)為腎小管內(nèi)各種膠原纖維表達(dá)增多，導(dǎo)致明顯地間質(zhì)纖維化改變，間質(zhì)纖維化嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致腎單位減少、腎功能不全，最終可能發(fā)展為慢性腎功能衰竭。

有文獻(xiàn)報(bào)道，因I/R導(dǎo)致的腎功能衰竭的患者都會(huì)有不同程度的腎臟結(jié)構(gòu)的改變和功能的損害[16]。在本研究中，術(shù)后12周時(shí)Sham組、I/R組和Metformin組Cr及BUN水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在病理形態(tài)學(xué)上I/R組和Metformin組腎小管仍可見明顯損傷后改變。本研究中，HE染色顯示Sham組中的腎臟結(jié)構(gòu)未見明顯改變，而I/R組中的腎臟結(jié)構(gòu)明顯破壞，但在Metformin組中損傷明顯減輕；Masson染色顯示，在I/R 12周后腎臟出現(xiàn)了明顯的腎小管間質(zhì)纖維化改變；但是，在Metformin組中腎纖維化程度明顯減輕。

二甲雙胍是一種常用的口服降糖藥，近來多項(xiàng)研究證實(shí)，它還具有抗炎、抗腫瘤和抗纖維化的作用[17-20]。α-SMA是肌成纖維細(xì)胞的重要標(biāo)志之一，也是細(xì)胞外基質(zhì)的重要來源。一般情況下，α-SMA僅僅在未缺血缺氧腎臟組織的血管中表達(dá)，但是在各種缺血缺氧損傷后，α-SMA在整個(gè)器官組織中都可以見到表達(dá)明顯增加。TGF-β1是導(dǎo)致纖維化改變的重要因子[21]，是公認(rèn)的促纖維化因子，其通過與受體結(jié)合活化下游基因，其增加產(chǎn)生一系列導(dǎo)致肌成纖維細(xì)胞增多的靶蛋白，引起間質(zhì)纖維化。本研究免疫組化和Western blot結(jié)果均顯示，I/R組和Metformin組大鼠腎臟α-SMA和TGF-β1的表達(dá)水平均顯著高于Sham組；而與I/R組比較，Metformin組的α-SMA和TGF-β1水平顯著下降。

綜上所述，長(zhǎng)時(shí)間腎臟I/R會(huì)導(dǎo)致腎小管嚴(yán)重?fù)p傷，而且這種損傷是不可逆的，遠(yuǎn)期會(huì)引起腎小管間質(zhì)纖維化改變，導(dǎo)致慢性腎功能不全，二甲雙胍可能通過減少促纖維因子α-SMA和TGF-β1的表達(dá)，從而減輕腎小管形態(tài)學(xué)改變、促進(jìn)腎臟功能的恢復(fù)，進(jìn)而抑制腎小管間質(zhì)纖維化改變。二甲雙胍作為一種最常用的降糖藥物，經(jīng)濟(jì)實(shí)用、服用方便、副作用少，很有潛力成為一種減少腎缺血再灌注損傷的治療藥物。

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