基于疾病基因表達(dá)譜的糖尿病腎病治療藥物預(yù)測

史曉賢 李高文

[摘要] 目的 探討基因表達(dá)譜在篩選糖尿病腎病有效治療藥物中的應(yīng)用效果。 方法 在GEO數(shù)據(jù)庫中搜索與糖尿病腎病相關(guān)的基因芯片，利用d-chip軟件進(jìn)行差異基因的表達(dá)分析，采用基因集富集的方法（GSEA）進(jìn)行相關(guān)信號通路的富集分析，再利用Cmap篩選治療糖尿病腎病的候選藥物，并通過動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行藥效學(xué)評估。 結(jié)果 通過對GSE31022芯片中的合格樣本進(jìn)行差異基因的有效分析，在獲得的540個差異表達(dá)基因中，上調(diào)基因150個，下調(diào)基因390個；通過GSEA分析主要富集到NF-κB信號通路與糖尿病腎病最為密切（P < 0.05），并且篩選出甲砜霉素可能對糖尿病腎病有治療作用（score=1），動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，甲砜霉素組的腎小球硬化及系膜擴(kuò)張明顯改善，基本達(dá)到正常組水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。此外，甲砜霉素組的尿蛋白和CD68、轉(zhuǎn)化生長因子β、纖溶酶原激活物抑制物1及白介素6的mRNA水平低于模型組（P < 0.05）。 結(jié)論 基于糖尿病腎病相關(guān)基因表達(dá)譜作為疾病有效治療藥物的預(yù)測手段，為疾病的治療藥物發(fā)現(xiàn)提供了新思路。

[關(guān)鍵詞] 基因芯片；糖尿病腎病；甲砜霉素；基因表達(dá)譜；富集分析

[中圖分類號] R587.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）08（a）-0018-05

[Abstract] Objective To explore the application effects of gene expression profiling in screening the effective therapeutic drugs for diabetic nephropathy. Methods The gene chips related to diabetic nephropathy in GEO databases were searched and the differential gene expression was analyzed by d-chip software. Enrichment analysis of the relevant signaling pathways was carried out by GSEA， Cmap was then used for the screening of candidate drugs of diabetic nephropathy and pharmacodynamic validation was evaluated in animal experiments. Results Through the analysis of differential genes in qualified samples from the GSE31022 chip， a total of 540 genes were obtained， of which， 150 genes were up-regulated and 390 genes were down-regulated. The main enrichment to NF-κB signaling pathway by GSEA was most closely related to diabetic nephropathy （P < 0.05）， and screening for Thiamphenicol may have a therapeutic effect on diabetic nephropathy （score=1）. The results of animal experiments showed that compared with model group， the mesangial expansion of the diabetic nephropathy mice treated by Thiamphenicol was significantly improved and almost reached the normal level （P < 0.05）. In addition， the levels of urine protein and the mRNA levels of CD68， transforming growth factor β， plasminogen activator inhibitor 1 and interleukin 6 in the Thiamphenicol group were significantly lower than those in model group （P < 0.05）. Conclusion As an effective means of predicting effective therapeutic drugs for diabetic nephropathy， the gene expression profiling based on diabetic nephropathy provides a new idea for the discovery of therapeutic drugs for the disease.

[Key words] Gene chips； Diabetic nephroathy； Thiamphenicol； Gene expression profiling； Enrichment analysis

糖尿病是一種以高血糖為主要特征的慢性代謝性疾病，引發(fā)的各類并發(fā)癥更加深了糖尿病患者的致死率和致殘率[1-4]。其中糖尿病腎病已經(jīng)成為最常見的糖尿病并發(fā)癥之一[5-6]。作為嚴(yán)重危害人類健康的疾病，目前對糖尿病腎病治療仍集中在抗炎、降血糖及血脂和改善血流動力學(xué)等方面，缺乏安全有效的治療藥物[7]。近年來，利用基因表達(dá)譜技術(shù)和關(guān)聯(lián)性圖譜（Cmap）數(shù)據(jù)庫篩選和發(fā)現(xiàn)藥物成為一個新的研究熱點(diǎn)[4，8]。因此，為了快速有效地發(fā)現(xiàn)新的治療糖尿病腎病的有效候選藥物，本研究從GEO數(shù)據(jù)庫中搜索與糖尿病腎病相關(guān)的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集，篩選出樣本數(shù)較多的基因芯片：GSE30122；然后利用R軟件進(jìn)行差異基因的分析，獲得了與糖尿病腎病相關(guān)的差異基因，對差異基因進(jìn)行分析后，顯示甲砜霉素（Thiamphenicol）的負(fù)性富集分?jǐn)?shù)最高，表明甲砜霉素具有潛在的改善糖尿病腎病的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 GEO數(shù)據(jù)集的獲取

從GEO數(shù)據(jù)庫中搜索與糖尿病腎病相關(guān)的基因芯片，從中篩選并下載了基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集，采用GPL571芯片平臺。

1.2 糖尿病腎病的相關(guān)差異表達(dá)基因分析

采用R軟件對GSE31022芯片中的合格樣本進(jìn)行差異基因的有效分析，具體操作參考d-chip說明[9]，進(jìn)行顯著性分析的P值< 0.05和差異基因倍數(shù)≥1.2倍。

1.3 相關(guān)基因集的富集分析

從NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫中獲得與糖尿病腎病相關(guān)的數(shù)據(jù)集進(jìn)行GSEA基因集富集分析。然后從GSEA網(wǎng)站的數(shù)據(jù)庫中選取Canonical pathways、KEGG gene sets、GO gene sets、GO biological process四個基因集作為陽性參照基因集。按照default weighted enrichment statistic的方法重復(fù)分析1000次，P < 0.05的通路/過程定義為顯著富集分析通路[10]。

1.4 篩選糖尿病腎病的治療藥物

通過Cmap數(shù)據(jù)庫進(jìn)行糖尿病腎病的有效治療藥物的篩選，首先通過R軟件進(jìn)行基因集的富集分析，獲得上調(diào)或者下調(diào)的相關(guān)基因，然后將基因名轉(zhuǎn)換成為“Affymetrix gene chip Human GenomeU133A Array”的標(biāo)準(zhǔn)探針，轉(zhuǎn)換成query signature格式的文件，最后在Cmap網(wǎng)站分別上傳差異基因文件。

1.5 利用動物模型評估甲砜霉素對糖尿病腎病的作用

1.5.1 動物 本研究選用8周齡的2型糖尿病小鼠為腎病模型（db/db），選取同窩野生型的5周齡的正常小鼠（db/m）8只為正常組，另設(shè)甲砜霉素組和模型組，共計(jì)三組，以上小鼠均購自南京模式動物所，實(shí)驗(yàn)動物合格證編號：SYHG（蘇）2017-0005。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)在SPF級的動物房，動物自由攝食和飲水。腹腔給藥（10 mg/kg），每天給藥1次，連續(xù)給藥13周，最后1周收集24 h尿液，并檢測尿白蛋白含量。

1.5.2 實(shí)驗(yàn)器材 血糖儀（羅氏卓越型）；尿蛋白定量試劑盒（長風(fēng)生物科技有限公司）；紫外可見分光光度計(jì)（貝克曼）；搖床（蘇州高科）；圖像采集系統(tǒng)（高科生物公司）；酶標(biāo)儀（GE公司）；電泳槽、電泳儀、凝膠圖像分析管理系統(tǒng)、熒光定量PCR儀均購于杭州寶誠生物技術(shù)有限公司。

1.5.3 藥物和試劑 動物飼料：高脂飼料（南京吉凱飼料有限公司）；甲砜霉素（上海天平制藥有限公司）；PCR引物（上海生工生物公司）；尿蛋白測量試劑盒、mRNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、糖原染色試劑盒均購于全式金生物公司。

1.6 組織病理學(xué)檢查

PAS染色：將取下的新鮮腎組織放入4%的多聚甲醛中過夜，石蠟包埋，切成5 μm，脫蠟，漂洗后，按照糖原染色的方法染色，在正置顯微鏡下觀察腎組織的病理狀況，記錄數(shù)據(jù)。

1.7 相關(guān)炎癥因子的基因水平檢測

將新鮮腎臟組織0.5 g置于1.5 mL滅菌過的EP管中，分別加入1 mL的Trizol，提取mRNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過qPCR進(jìn)行定量分析CD68、白介素6（IL-6）、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）、纖溶酶原激活物抑制物1（PAI-1）在各個組的腎組織中的基因水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示：符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，使用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GEO數(shù)據(jù)集信息

9個糖尿病腎病和13個正常樣本共22個樣本全部合格。

2.2 糖尿病腎病相關(guān)差異基因篩選

用糖尿病樣本對比正常樣本，獲得共同差異表達(dá)基因540個，其中上調(diào)基因150個，下調(diào)基因390個，差異基因熱圖也提示糖尿病腎病組織樣本和正常組腎病組織的樣本聚類分界明確（圖1，封三）。

2.3 糖尿病腎病的通路富集分析

NF-κB等35條信號通路與糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，其中NF-κB信號通路差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖2（封三）。

2.4 Cmap數(shù)據(jù)庫分析

結(jié)合富集分?jǐn)?shù)和P值兩項(xiàng)參數(shù)對所獲的藥物進(jìn)行差異排序（圖3），最終篩選出甲砜霉素的負(fù)性富集分?jǐn)?shù)最高，提示可能會成為糖尿病腎病的有效治療藥物或者輔助治療藥物。

2.5 甲砜霉素可以有效緩解糖尿病腎病

2.5.1 糖尿病腎病小鼠實(shí)驗(yàn) 糖尿病小鼠的給藥劑量和給藥時間見圖4A，結(jié)果顯示甲砜霉素組小鼠的尿白蛋白排出量明顯低于模型組（P < 0.05），基本達(dá)到了正常小鼠的水平（圖4B）。此外腎臟組織糖原染色分析發(fā)現(xiàn)，相比于模型組，甲砜霉素組的腎小球硬化和腎系膜擴(kuò)張得到了有效的改善，基本恢復(fù)正常（圖4C、D）。

2.5.2 腎臟組織中的炎癥因子表達(dá)水平 糖尿病腎病小鼠在給予甲砜霉素治療后，腎組織中CD68、TGF-β、PAI-1、IL-6等炎癥因子的mRNA水平相比模型組都顯著降低（P < 0.05或P < 0.01），基本接近正常值（圖5）。

3 討論

糖尿病腎病是一種腎臟長期處于高糖環(huán)境下所導(dǎo)致的疾病，其發(fā)病機(jī)制涉及各種復(fù)雜的病理環(huán)境[11-14]。近年來，雖然有許多學(xué)者對糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制做了大量的報道[15-16]，但其機(jī)制依然沒有闡明?；虮磉_(dá)數(shù)據(jù)庫是一個基于基因表達(dá)譜的藥物發(fā)現(xiàn)平臺，其有效地揭示了藥物、疾病和基因三者之間的聯(lián)系，并且在“老藥新用”及新藥發(fā)現(xiàn)方面具有非常重要的應(yīng)用價值[17]。此外，基于疾病與基因表達(dá)譜的關(guān)聯(lián)來發(fā)現(xiàn)藥物的模式能夠極大縮短藥物研發(fā)時間周期，具有非常重要的社會和經(jīng)濟(jì)意義[18-19]。本研究采用基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫的藥物篩選平臺，最終獲得甲砜霉素等可能是糖尿病腎病的有效候選藥物。在篩選到的候選藥物中，甘氨酸-組氨酸-賴氨酸等氨基酸的代謝對肝、腎功能具有一定的保護(hù)作用[20]。此外，利用篩選到的候選藥物——甲砜霉素通過體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步去評估其對糖尿病腎病的作用。本研究檢測尿蛋白含量，結(jié)果顯示甲砜霉素組小鼠的尿白蛋白排出量明顯低于模型組，基本達(dá)到了正常小鼠的水平，提示甲砜霉素可以有效緩解和改善糖尿病腎病所引起的尿白蛋白增多，有助于糖尿病小鼠腎功能的改善。此外腎臟的病理切片染色發(fā)現(xiàn)，相比于模型組，甲砜霉素組的腎小球硬化及腎系膜擴(kuò)張程度明顯得到了有效的改善，基本也恢復(fù)正常，并且CD68、TGF-β、PAI-1、IL-6炎癥因子的mRNA的水平也顯著降低，提示甲砜霉素也能夠緩解糖尿病腎病的炎癥，但其確切的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

因此，本研究所建立的基于疾病與其相關(guān)基因表達(dá)譜的方法可以篩選出治療糖尿病腎病的藥物，相關(guān)的文獻(xiàn)分析也驗(yàn)證了該方法的可行性[17-19]。本研究僅從體內(nèi)動物水平初步提示其具有緩解糖尿病腎病的作用，但具體的機(jī)制以及其臨床療效等有待進(jìn)一步的探討。

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