Notch1 siRNA影響Notch-Wnt信號(hào)通路對(duì)人成骨肉瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

郝俊龍，楊 凱，王亞鵬，王 旭，齊 進(jìn)，王拴科，汪 靜

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨腫瘤科，甘肅 蘭州 730030

骨肉瘤是最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤，其發(fā)病率約占所有骨骼系統(tǒng)腫瘤的15%，高致殘率和高復(fù)發(fā)率是骨肉瘤發(fā)病的臨床特點(diǎn)［1-2］。由于大劑量化療藥物的不良反應(yīng)、耐藥性、早期肺部轉(zhuǎn)移及局部病變復(fù)發(fā)等眾多問題，骨肉瘤患者生存率沒有獲得進(jìn)一步提高［3］。因此，尋找一種療效好、可行性大及不良反應(yīng)小的臨床治療骨肉瘤的新方法是目前研究的熱點(diǎn)。

迄今為止，骨肉瘤發(fā)生的分子機(jī)制仍不清楚。有研究報(bào)道，RIPK4蛋白與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移有著密不可分的關(guān)系［4-5］。另外有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展與Notch1信號(hào)通路過度活化有密切聯(lián)系［6］。Notch通路在骨肉瘤的發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡、耐藥及預(yù)后等諸多方面均有不同程度的影響，甚至在某些方面Notch通路還起著主導(dǎo)作用。另外，Wnt信號(hào)通路則是調(diào)控細(xì)胞增殖分化的重要信號(hào)通路，在骨組織生長(zhǎng)發(fā)育中同樣發(fā)揮著關(guān)鍵作用。已有研究證實(shí)，Wnt信號(hào)通路與Notch通路之間有著緊密的聯(lián)系［7］。然而，揭示W(wǎng)nt-Notch信號(hào)通路相互作用在成骨細(xì)胞生物學(xué)行為中的功能的研究不多。

本課題將明確Notch1蛋白對(duì)骨肉瘤增殖的影響并初步探討其通過調(diào)節(jié)Notch及Wnt信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤作用的可能機(jī)制，為臨床治療骨肉瘤提供新的理論依據(jù)和治療思路，為臨床提高治療骨肉瘤的治愈率做出貢獻(xiàn)。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

收集蘭州大學(xué)第二醫(yī)院病理科2014年—2016年的骨肉瘤標(biāo)本19例，其中男性13例，女性6例，年齡6～72歲，中位年齡19歲。手術(shù)過程中切取新鮮骨肉瘤組織及相應(yīng)的癌旁組織，收集后置于-80 ℃低溫冰箱保存。全部標(biāo)本均由兩位高年資病理醫(yī)師經(jīng)病理診斷證實(shí)，所有病例的臨床資料完整，術(shù)前均未接受放化療。本研究獲得蘭州大學(xué)第二醫(yī)院和甘肅省腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有患者均知情同意。

1.2 細(xì)胞及主要試劑

人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63與U-2 OS購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清購自美國(guó)Hyclone公司；Notch1 siRNA、control siRNA及siRNA轉(zhuǎn)染試劑購自美國(guó)Santa Cruz公司；RNAiso Plus、prime Script RT Master Mix及SYBR Premix Ex TapTMⅡ購自日本TaKaRa公司；RIPK4兔抗人多克隆抗體、兔抗人Notch1、Hes1、DLL1、β-catenin及Cyclin D1單克隆抗體購自英國(guó)Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色

按照ⅤP-9003免疫組織化學(xué)試劑盒說明書進(jìn)行嚴(yán)格操作。將臨床腫瘤組織切片進(jìn)行抗原修復(fù)后，加入Notch1一抗，置于冰箱4 ℃過夜。加入二抗后水浴20 min，PBS沖洗。在顯微鏡下顯色后用蘇木精復(fù)染、分化、脫水、透明后用中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察，細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色或棕色著色為陽性細(xì)胞。陽性判定以陽性細(xì)胞數(shù)及染色強(qiáng)度綜合判定［8］。陽性細(xì)胞數(shù)：≤5%計(jì)0分，6%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，≥51%計(jì)3分；染色強(qiáng)度不著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)400倍視野，兩者相加，≤3分為陰性，＞3分為陽性。

1.3.2 靶向Notch1 siRNA轉(zhuǎn)染人骨肉瘤MG-63、U-2 OS細(xì)胞

當(dāng)人骨肉瘤MG-63、U-2 OS細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，以1×105的密度接種到6孔板中，置于培養(yǎng)箱內(nèi)溫育24 h，觀察其融合達(dá)到70%～80%。按照轉(zhuǎn)染試劑說明書提供的方法，將2 μg/mL攜帶綠色熒光的control siRNA加入上述6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。細(xì)胞培養(yǎng)6 h后，更換成完全培養(yǎng)液；繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h，在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)含有綠色熒光的MG-63、U2-OS細(xì)胞數(shù)。

轉(zhuǎn)染48 h后，熒光顯微鏡下檢測(cè)綠色熒光表達(dá)，選取3個(gè)視野，觀察拍照，分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野中總細(xì)胞的數(shù)量和熒光細(xì)胞的數(shù)量，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率（轉(zhuǎn)染效率=熒光細(xì)胞總數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%）。

1.3.3 四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測(cè)Notch1 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)MG-63、U-2 OS細(xì)胞增殖的影響

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人骨肉瘤細(xì)胞制成懸液后，接種到96孔板中，密度為5 000個(gè)/孔，每孔加入100 μL的PBS。細(xì)胞在各自條件下培養(yǎng)24、48和72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，待培養(yǎng)細(xì)胞鋪滿孔底，給每孔加入0.5%MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后傾去培養(yǎng)基，并用PBS漂洗，重復(fù)3次，每孔加入二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）150 μL。將孔板放在搖床上振搖10 min，用酶聯(lián)檢測(cè)儀在490 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定每個(gè)孔的吸光度（D）值。同時(shí)一定要設(shè)置調(diào)零孔和對(duì)照孔。以時(shí)間為橫軸，D值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Notch1 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)MG-63、U-2 OS細(xì)胞凋亡的影響

按照FITC Annexin Ⅴ凋亡檢測(cè)試劑盒Ⅰ（購自美國(guó)BD公司）檢測(cè)方法進(jìn)行。用胰酶將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞消化，并收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液。使用4 ℃冰箱中冷藏的PBS漂洗細(xì)胞3次，再用1×結(jié)合緩沖液制成1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。往Falcon試管中加入100 μL細(xì)胞懸液。接著加入5 μL FITC AnnexinⅤ，輕輕混勻，室溫(20～25 ℃)條件下，避光反應(yīng)15 min。再加入10 μL的PI染料，振蕩混勻，室溫避光處靜置15 min。最后分別在各組管中加入1×結(jié)合緩沖液400 μL。1 h內(nèi)利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fl uorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)檢測(cè)骨肉瘤組織中Notch1 mRNA及Notch1 siRNA轉(zhuǎn)染MG-63、U-2 OS細(xì)胞后Notch1-Wnt通路相關(guān)蛋白mRNA水平

按照試劑盒說明書用RNAiso Plus細(xì)胞裂解液提取骨肉瘤組織及Notch1 siRNA轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞中總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將cDNA產(chǎn)物進(jìn)行RTFQ-PCR循環(huán)。RIPK4、Notch1、Hes1及DLL1的PCR引物由日本TaKaRa公司設(shè)計(jì)合成并純化（表1）。

表 1 PCR引物Tab. 1 PCR primer

進(jìn)行RTFQ-PCR后，開始瓊脂糖凝膠電泳。應(yīng)用凝膠成像軟件測(cè)定RIPK4、Notch1、Hes1、DLL1、β-catenin及Cyclin D1的表達(dá)。計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量，以GADPH、β-actin為內(nèi)參照校正每個(gè)樣本的循環(huán)閾值CT得到△CT，實(shí)驗(yàn)組目的基因相對(duì)表達(dá)量以2-△△CT計(jì)算表示，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western bolt）檢測(cè)骨肉瘤組織中Notch1 mRNA及Notch1 siRNA轉(zhuǎn)染MG-63、U-2 OS細(xì)胞后Notch1-Wnt通路相關(guān)蛋白表達(dá)

MG-63、U-2 OS細(xì)胞被Notch1 siRNA轉(zhuǎn)染后，按照試劑盒說明書提取骨肉瘤組織及細(xì)胞株總蛋白及骨肉瘤組織中總蛋白并測(cè)定其濃度。加以5×SDS上樣緩沖液后放入沸水中使其變性。取預(yù)染蛋白Marker（購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）5 μL和40 μg蛋白樣品上樣后電泳（電壓120 Ⅴ，1 h）。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)印至PⅤDF膜（300 mA，1 h），常溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗RIPK4(1∶1 000)、Hes1(1∶1 000)、DLL1(1∶1 000)、Notch1(Abcam 1∶1 000)、β-catenin(1∶1 000)、Cyclin D1(1∶1 000)和GAPDH（1∶2 000）、β-actin1∶2 000），4 ℃溫育過夜，加入相應(yīng)的二抗（1∶5000）室溫溫育1 h。ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，結(jié)果經(jīng)自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀采集，通過Quanyity one采圖分析軟件得出每個(gè)條帶的平均D值（每個(gè)目的條帶與相應(yīng)的β-actin平均D值的比值）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。單一對(duì)照組與多實(shí)驗(yàn)組的比較運(yùn)用Dunnett-t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用±s表示，一組對(duì)比其間內(nèi)容比較采用LSD-t法，接著用方差分析測(cè)試結(jié)果，摒棄差值較大的一組數(shù)值，取均值為計(jì)算數(shù)據(jù)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 骨肉瘤組織中Notch1呈陽性表達(dá)

Notch1蛋白及其Notch1 mRNA在癌旁組織與骨肉瘤組織中的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，Notch1蛋白陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，呈淺棕黃色至深棕黃色顆粒狀，且19例骨肉瘤中Notch1陽性表達(dá)14例(73.7%)。RTFQ-PCR及Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，與癌旁組織相比，骨肉瘤組織中Notch1 mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)水平均顯著增加（圖1）。

圖 1 骨肉瘤組織中Notch1蛋白水平及mRNA的表達(dá)Fig. 1 Protein level and mRNA expressions of Notch1 in osteosarcoma specimens

2.2 靶向沉默Notch1基因及沉默效果檢測(cè)

將Notch1 siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入MG-63、U-2 OS骨肉瘤細(xì)胞，待轉(zhuǎn)染48 h后，用普通顯微鏡及熒光顯微鏡觀察（圖2），然后對(duì)帶有熒光的骨肉瘤細(xì)胞分別進(jìn)行計(jì)數(shù)。Notch1 siRNA-NC轉(zhuǎn)染MG-63和U-2 OS骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率分別為88%和83%。Notch1 siRNA轉(zhuǎn)染MG-63和U-2 OS骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率分別為78%和80%，轉(zhuǎn)染獲得成功。

2.3 Notch1 siRNA轉(zhuǎn)染后骨肉瘤細(xì)胞增殖能力降低

Notch1 siRNA轉(zhuǎn)入MG-63、U-2OS細(xì)胞48 h后，骨肉瘤細(xì)胞增殖能力均有所降低。與control siRNA組和空白組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

圖 2 觀察control siRNA轉(zhuǎn)染48 h時(shí)人成骨肉瘤MG-63、U-2 OS細(xì)胞中綠色熒光的表達(dá)情況Fig. 2 The green fl uorescence in osteosarcoma MG-63 and U-2 OS cells after they were transfected with control siRNA or Notch1 siRNA for 48 h

圖 3 MTT檢測(cè)特異性沉默Notch1基因后MG-63（A）、U-2 OS（B）細(xì)胞的增殖情況Fig. 3 MTT detection of the proliferation of MG-63 (A) and U-2 OS (B) tumor cells after speci fi city silencing of Notch1 gene

2.4 Notch1 siRNA轉(zhuǎn)染后骨肉瘤細(xì)胞凋亡率增加

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，Notch1 siRNA轉(zhuǎn)染MG-63、U-2 OS骨肉瘤細(xì)胞48 h后，骨肉瘤細(xì)胞凋亡率增加。Notch1 siRNA組MG-63骨肉瘤細(xì)胞凋亡率(27.55%±2.16%)明顯高于control siRNA組(11.79%±0.42%)和空白組(9.72%±1.65%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；Notch1 siRNA組U-2 OS骨肉瘤細(xì)胞凋亡率(27.545%±2.96%)明顯高于control siRNA組(18.70%±2.61%)和空白組(16.345%±1.63%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，轉(zhuǎn)染后兩組細(xì)胞中空白組與control siRNA組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖4）。

2.5 Notch1 siRNA轉(zhuǎn)染后骨肉瘤細(xì)胞Notch通路相關(guān)蛋白及mRNA水平降低

將靶向Notch1基因的siRNA轉(zhuǎn)染入人骨肉瘤MG-63、U-2 OS細(xì)胞中，誘導(dǎo)降低或缺失Notch1基因后檢測(cè)細(xì)胞中的Notch通路分子的活性，應(yīng)用RTFQ-PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MG-63骨肉瘤細(xì)胞和U-2 OS骨肉瘤細(xì)胞表現(xiàn)出Notch配體DLL1、Notchl和Notch靶基因Hes1含量的變化，Notch1 siRNA組與control siRNA組和空白組比較，上述蛋白的含量和表達(dá)均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖5、6）。

圖 5 特異性轉(zhuǎn)染Notch1 siRNA后，MG-63細(xì)胞中DLL1、Notch1和Hes1的表達(dá)情況Fig. 5 The expressions of DLL1, Notch1 and Hes1 after MG-63 cells were transfected by Notch1 siRNA

圖 6 特異性轉(zhuǎn)染Notch1 siRNA后，U-2 OS細(xì)胞中DLL1、Notch1和Hes1的表達(dá)情況Fig. 6 The expressions of DLL1, Notch1 and Hes1 after U-2 OS cells were transfected by Notch1 siRNA

2.6 Notch1 siRNA轉(zhuǎn)染后骨肉瘤細(xì)胞Wnt通路相關(guān)蛋白及mRNA水平降低

將靶向Notch1基因的siRNA轉(zhuǎn)染入人骨肉瘤MG-63、U-2 OS細(xì)胞中，誘導(dǎo)降低或缺失Notch1基因后檢測(cè)細(xì)胞中的Wnt通路分子的活性，應(yīng)用RTFQ-PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MG-63骨肉瘤細(xì)胞和U-2 OS骨肉瘤細(xì)胞表現(xiàn)出β-catenin、Cyclin D1含量的變化，Notch1 siRNA組與control siRNA組和空白組比較，上述兩種蛋白的mRNA表達(dá)均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖7、8）。

2.7 Notch1 siRNA轉(zhuǎn)染后骨肉瘤細(xì)胞中PIPK4表達(dá)降低

將靶向Notch1基因的siRNA轉(zhuǎn)染入人骨肉瘤MG-63、U-2 OS細(xì)胞中，誘導(dǎo)降低或缺失Notch1基因后檢測(cè)細(xì)胞中的RIPK4的表達(dá)，應(yīng)用RTFQPCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MG-63骨肉瘤細(xì)胞和U-2 OS骨肉瘤細(xì)胞中，RIPK4 mRNA與蛋白表達(dá)水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖9）。

圖 7 特異性轉(zhuǎn)染Notch1 siRNA后，MG-63細(xì)胞中β-catenin、Cyclin D1的表達(dá)情況Fig. 7 The expressions of β-catenin and Cyclin D1 after MG-63 cells were transfected by Notch1 siRNA

圖 8 特異性轉(zhuǎn)染Notch1 siRNA后，U-2 OS 細(xì)胞中β-catenin、Cyclin D1的表達(dá)情況Fig. 8 The expressions of β-catenin and Cyclin D1 after U-2 OS cells were transfected by Notch1 siRNA

圖 9 特異性轉(zhuǎn)染Notch1 siRNA后，MG-63與U-2 OS細(xì)胞中RIPK4的表達(dá)情況Fig. 9 The expressions of RIPK4 after MG-63 and U-2 OS cells were transfected by Notch1 siRNA

3 討 論

骨肉瘤是骨腫瘤中最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，好發(fā)于兒童和青少年［9］。骨肉瘤在臨床上為高度惡性，同時(shí)具有致殘率高、肺部轉(zhuǎn)移早及復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)。迄今為止，骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)分子機(jī)制尚不明確，臨床上也沒有針對(duì)性的有效治療藥物［10-11］。

已有研究報(bào)道，Notch1的表達(dá)量在肺癌、肝癌、骨肉瘤及乳腺癌等多種惡性腫瘤組織中顯著升高，活化Notch1能夠促進(jìn)離體培養(yǎng)骨肉瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移［12-14］。王克猛等［15］的研究結(jié)果顯示，Notch1蛋白的陽性表達(dá)率在軟骨肉瘤、骨軟骨瘤及正常軟骨組織3組間逐漸增高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。周彬等［16］的研究結(jié)果表明，Notch1阻斷劑能夠抑制骨肉瘤小鼠模型腫瘤的生長(zhǎng)，參與這一過程的可能分子機(jī)制包括降低促增殖分子和促侵襲分子的生成、增加促凋亡和侵襲抑制分子的生成。但是Notch1對(duì)骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制仍未闡明。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在19例臨床骨肉瘤組織中有14例Notch1蛋白染色顯示為陽性，且Notch1 mRNA表達(dá)及蛋白水平在組織中顯著增加。另外采用MTT法檢測(cè)Notch1 siRNA轉(zhuǎn)染入人骨肉瘤MG-63和U-2 OS細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞增殖能力降低，同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，Notch1 siRNA轉(zhuǎn)染入人骨肉瘤MG-63和U-2 OS細(xì)胞后其細(xì)胞凋亡率增加。上述結(jié)果進(jìn)一步確定，Notch1不但與骨肉瘤有著高度相關(guān)性，而且在骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著非常重要的促增殖角色。

Notch1基因有著重要的生理作用，其功能決定了Notch信號(hào)通路的整體功能。Dailey等［17］通過使用基因序列分析和RTFQ-PCR檢測(cè)的方法，也發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤組織中Hes1、Hey-1、Notch1和Notch2表達(dá)增強(qiáng)，提示當(dāng)Notch信號(hào)通路被激活后，會(huì)促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和發(fā)育。此外，Wnt通路則是調(diào)控細(xì)胞增殖分化的重要信號(hào)通路。Wnt配體可通過β-catenin依賴性及β-catenin非依賴性信號(hào)通路對(duì)多種器官的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)維持產(chǎn)生重要影響。

已有研究證實(shí)，Wnt信號(hào)通路與Notch信號(hào)通路之間有著緊密的聯(lián)系［18］，Wnt信號(hào)通路和Notch信號(hào)通路是相互聯(lián)系并協(xié)調(diào)平衡的，在胚胎發(fā)育、組織再生和腫瘤形成中共同起作用，具體分子作用機(jī)制復(fù)雜，可概括為3個(gè)類型：共同參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)［19］；一條信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄靶基因?qū)α硪粭l信號(hào)通路造成影響，使信號(hào)活性在不同時(shí)間、不同空間產(chǎn)生差異［20］；在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，直接通過分子作用串話［21］。

本研究將靶向Notch1基因的siRNA轉(zhuǎn)染入人骨肉瘤MG-63和U-2 OS細(xì)胞中，誘導(dǎo)降低或缺失Notch1基因后，發(fā)現(xiàn)Notch配體DLL1、Notchl和Notch靶基因Hes1的表達(dá)明顯降低，同時(shí)Wnt通路中關(guān)鍵分子β-catenin與Cyclin D1的表達(dá)也顯著降低。此外誘導(dǎo)降低或缺失Notch1后，促增殖分子RIPK4的蛋白表達(dá)水平也明顯下降。說明Notch1 siRNA信號(hào)分子可能通過抑制Notch-Wnt通路，減少促增殖分子RIPK4的表達(dá)，進(jìn)而降低骨肉瘤細(xì)胞的增殖作用。

綜上所述，Notch1在骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演促增殖分子的重要角色，參與這一過程的分子機(jī)制可能是通過影響Notch-Wnt信號(hào)通路進(jìn)而增加促增殖分子RIPK4的表達(dá)而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用。