中國前列腺癌患者BRCA1/2及ATM基因的胚系突變研究

韋 煜，吳俊龍，顧偉杰，秦曉健，林國文，戴 波，朱 耀，葉定偉

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

在歐美國家，前列腺癌已經(jīng)成為發(fā)病率最高的男性惡性腫瘤［1］，雖然我國前列腺癌的發(fā)病率較低，但近年來發(fā)病率呈顯著上升趨勢［2］。據(jù)估計，2015 年我國前列腺癌新發(fā)患者有60 300例，死亡患者約26 600例［2］。

前列腺癌的高危因素之一是腫瘤家族史，這提示前列腺癌的發(fā)生與基因遺傳背景密切相關(guān)。得益于高通量測序技術(shù)的迅速發(fā)展，全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association study，GWAS）已經(jīng)確認(rèn)了100多種導(dǎo)致前列腺癌風(fēng)險增加的遺傳突變，與33%的家族性前列腺癌有關(guān)［3-6］；此外，其他與前列腺癌發(fā)病風(fēng)險相關(guān)的基因也相繼被發(fā)現(xiàn)。其中，大量研究發(fā)現(xiàn)BRCA2基因致病突變是前列腺癌的高風(fēng)險因子［7-10］，存在于1.2%～1.8%的前列腺癌患者［11-12］。盡管在局限性前列腺癌中DNA修復(fù)基因的胚系突變率很低，但最近的一篇文獻(xiàn)報道顯示，在轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者當(dāng)中，11.8%的患者攜帶胚系DNA修復(fù)基因的突變，其中BRCA1/2、ATM基因的突變占到了7.55%［13］。已有研究表明，BRCA2基因的胚系突變與前列腺癌的早期發(fā)生、高危分級和治療后復(fù)發(fā)有關(guān)［14］。

盡管在闡明前列腺癌易感性的分子機(jī)制上取得了豐碩進(jìn)展，但基于中國人群的樣本研究鮮有報道。同時，不同種族人群前列腺癌遺傳易感性的差異使獲中國患者的遺傳突變譜變得更加迫切。既往研究顯示，在轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者中，18.18%的中國患者攜帶有胚系BRCA2或ATM基因突變，分別占13.64%和4.55%；而在局限性前列腺癌中，攜帶這3種基因突變的人數(shù)為0［15］。然而，由于樣本量有限，這一結(jié)論仍然需要得到進(jìn)一步的驗證。本課題組基于中國人群前列腺癌患者數(shù)據(jù)，分析報道了中國人群前列腺癌患者的遺傳突變特征。

1 資料和方法

1.1 研究對象

本前瞻性研究納入了2017年2月—2017年6月在復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院遺傳咨詢門診確診為前列腺癌的53例患者，前列腺癌的診斷基于前列腺穿刺活檢的病理結(jié)果。為保證樣本數(shù)據(jù)有代表性，對有意愿進(jìn)行基因檢測的前列腺癌患者進(jìn)行了連續(xù)入組。臨床信息來自于患者診療記錄以及隨訪調(diào)查。本研究已得到復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理道德委員會批準(zhǔn)，且均獲得入組患者的知情同意。

1.2 基因測序

在本研究中，我們采用目標(biāo)區(qū)域捕獲的方法對3個前列腺癌遺傳易感基因（BRCA1、BRCA2和ATM）進(jìn)行了二代測序。首先將從外周血淋巴細(xì)胞中提取的胚系基因組DNA進(jìn)行純化、取樣后，對DNA片段進(jìn)行純化和擴(kuò)增，然后采用設(shè)計好的Human SureSelect XT Custom Kit（700 Kb-34 Mb，AgilentTechnologies）進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域捕獲，使用Agilent 2100 Bioanalyzer分析捕獲的文庫，隨后在HiSeq4000平臺進(jìn)行二代測序。目標(biāo)基因的平均測序深度超過100×。

1.3 生物信息學(xué)分析

我們使用Illumina base-calling software 1.7處理原始測序數(shù)據(jù)，然后采用Burrows-Wheels Aliger將測序Reads與參考基因組序列比對，進(jìn)行初步的質(zhì)控。接著，我們用Picard來標(biāo)記由聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)生的重復(fù)讀取的冗余信息。對重復(fù)數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾后，使用BWA軟件將高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)與UCSC人類參考基因組（GRCH37，UCSC hg19）進(jìn)行比對。隨后采用SAMtools來鑒定小插入或缺失突變，用SOAPsnp來鑒定中單核苷酸多態(tài)性。最后，采用ANNOVAR對In Dels和SNPs進(jìn)行注釋。

結(jié)合本研究，我們選取了BRCA1、BRCA2、ATM這3個DNA修復(fù)基因，依據(jù)1000 Genomes Project（www.1000genomes.org）和Exome Aggregation Consortium（http://exac.broadinstitute.org）篩選出人群中遺傳突變頻率＜5%的突變，同時查閱了已發(fā)表文獻(xiàn)和公共數(shù)據(jù)庫ClinVar（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）和LOVD（http://www.lovd.nl/3.0/home）。最終遺傳突變的致病性根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）遺傳分類標(biāo)準(zhǔn)來判斷。致病性突變和可能致病性突變被定義為：① 所有的截斷突變，同時人群數(shù)據(jù)庫中該突變頻率不超過5%，沒有疾病數(shù)據(jù)庫報道成良性或可能良性；② 人群數(shù)據(jù)庫中突變頻率不超過5%，同時已被疾病數(shù)據(jù)庫報道成致病性或者可致病性的無意義突變；③ 影響到3個以上氨基酸的非移碼突變。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。以年齡為連續(xù)變量，以家族史、轉(zhuǎn)移與否、Gleason評分、前列腺特異抗原（prostate-specific antigen，PSA）是否高危（PSA≥20 ng/mL）為分類變量，對連續(xù)變量采用Student’t檢驗，對分類變量采用χ2檢驗或Fisher確切檢驗法，均為雙側(cè)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

本研究的患者年齡范圍44～81歲，中位年齡65歲，＜60歲患者15例，≥60歲患者38例；PSA＜20 ng/mL有10例，≥20 ng/mL有39例（部分?jǐn)?shù)據(jù)缺失）；Gleason評分≤7分7例，＞7分45例（部分?jǐn)?shù)據(jù)缺失）；其中16例患者一級親屬具有腫瘤病史，37例患者一級親屬無腫瘤病史（表1）。

在53例進(jìn)行測序的患者中，有4例（7.55%）患者攜帶致病性遺傳突變。4個致病性突變類型均為截斷突變；其中，BRCA2基因突變有3例，ATM基因突變僅有1例，未發(fā)現(xiàn)BRCA1基因致病突變。同時，尚有4例臨床意義不明突變存在，可能會造成對致病性突變的低估（表2）。無患者同時攜帶兩種不同基因的致病性突變。53例患者致病性基因胚系突變位置見圖1，BRCA1/2和ATM基因的胚系致病突變、臨床意義不明突變分布見圖2。

表 1 研究對象的臨床病理信息Tab. 1 Characteristics of the patients

表 2 53例患者中的致病性突變和臨床意義不明突變Tab. 2 Pathogenic mutations and uncertain signi fi cance identi fi ed in 53 patients

圖 2 BRCA1/2和ATM基因的致病性突變、臨床意義不明突變及其頻率Fig. 2 Pathogenic and uncertain signi fi cance mutations and the frequencies in BRCA2 and ATM genes

我們發(fā)現(xiàn)，相比無致病性胚系突變的患者，攜帶胚系致病突變的患者往往確診時年齡更低。突變患者確診時的平均年齡為53.75歲，而未突變患者的平均年齡為65.25歲（P=0.011）。

一級親屬家族史陽性患者中，12.50%（2/16）的患者存在致病性突變，而一級親屬家族史陰性的患者中，5.41%（2/37）的患者存在致病性突變（P=0.575），沒有證據(jù)顯示出家族史與遺傳突變之間的相關(guān)性。對于轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者，他們的遺傳突變率分別為9.68%、4.55%（P=0.633），確診時腫瘤已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者的遺傳突變率與非轉(zhuǎn)移患者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

同樣，遺傳突變與前列腺癌的危險分級之間似乎并不相關(guān)。53例患者中，1例患者因外院進(jìn)行內(nèi)分泌治療無法對Gleason評分。所有遺傳突變攜帶者的Gleason評分大于7分，而在未突變患者中Gleason評分大于7的占85.42%（P=1.0）。53例患者中，49例患者確診時的PSA數(shù)據(jù)是有效數(shù)據(jù)，分析顯示攜帶突變的患者中75%的PSA≥20 ng/mL，而80%的未突變患者PSA≥20 ng/mL（P=1.000）。

3 討 論

在有關(guān)前列腺癌遺傳突變的相關(guān)報道中，既往很少有研究將中國人群的數(shù)據(jù)納入到統(tǒng)計之中。本研究中，我們對中國人群前列腺癌患者BRCA1/2、ATM基因的遺傳突變率以及轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者中這3個基因的突變率進(jìn)行了報道。一方面，我們的研究表明，中國人群中BRCA1/2、ATM基因的胚系突變率為7.55%，在轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者中為9.68%；另一方面，我們發(fā)現(xiàn)在中國人群中，BRCA1/2、ATM基因的突變與前列腺癌的早期發(fā)生有關(guān)，攜帶胚系致病突變的患者確診時的平均年齡為53.75歲，顯著低于無胚系致病突變的患者。這提示我們除了依據(jù)美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南，對轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者或家族中存在易感胚系基因突變患者的人群推薦進(jìn)行基因檢測之外［16］，對于發(fā)病年齡偏早的患者推薦進(jìn)行基因檢測能夠篩選出更多的突變攜帶者。

BRCA1/2、ATM基因的胚系突變不僅與前列腺癌的進(jìn)展、預(yù)后相關(guān)，既往研究已表明對于攜帶胚系或體細(xì)胞BRCA1/2、ATM、PALB2和FANCA基因突變的轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌（metastatic castration-resistant prostate cancer，mCRPC）患者，PARP抑制劑的響應(yīng)率可達(dá)到88%［17］，鉑類治療則可使PSA明顯降低［18-19］，治療上的進(jìn)展使得對獲益人群進(jìn)行有效篩選愈加重要。同時，PARP抑制劑和鉑類在DNA修復(fù)基因胚系突變的mCRPC患者中顯示出的不同效應(yīng)是否與突變位點(diǎn)有關(guān)也值得進(jìn)一步探討。

Na等［15］的研究結(jié)果顯示，中國人群BRCA2、BRCA1及ATM的遺傳突變率為5.97%，其中轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者中突變攜帶者18.18%，局限性前列腺癌患者的突變攜帶者為0%，后者極低的突變率可能與入組的前列腺癌患者還必須符合Gleason評分≤6有關(guān)。同時，在致病性突變位點(diǎn)上，我們尚未發(fā)現(xiàn)與其中報道相同的位點(diǎn)，需要發(fā)現(xiàn)更多的致病性突變來進(jìn)一步探究不同突變類型是否會對PARP抑制劑及鉑類化療的療效造成影響。

本研究同樣存在幾點(diǎn)不足：首先，我們的樣本量仍然有限，最終得到的致病性突變偏少，這在一定程度上影響了統(tǒng)計的準(zhǔn)確性，需要依靠更多的樣本獲得更加準(zhǔn)確的結(jié)果，以進(jìn)一步指導(dǎo)中國人群前列腺癌的基因檢測；另外，在樣本的選取上，Gleason評分＞7的患者占86.54%，PSA≥20 ng/mL的患者占79.59%，高危人群的大量分布導(dǎo)致無法對照得出BRCA1/2、ATM基因的胚系突變與前列腺癌高危之間的關(guān)系，需要設(shè)計更加合理的入組標(biāo)準(zhǔn)來排除人群導(dǎo)致的結(jié)果偏移。

總之，中國人群前列腺癌患者中BRCA1/2、ATM基因的突變攜帶者占5.97%～7.55%，在轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者中達(dá)9.68%～18.18%，仍然推薦進(jìn)行基因檢測。同時在中國患者中，前列腺癌的早發(fā)也提示了可能帶有BRCA1/2、ATM基因的胚系突變。由于中國前列腺癌發(fā)病率在60歲以上人群中明顯增加，可考慮對確診年齡小于60歲患者進(jìn)行基因檢測。更大樣本量的研究很有必要，可以獲得更精確的突變率來指導(dǎo)臨床治療，同時可以闡明突變位點(diǎn)不同對患者使用PARP抑制劑和鉑類化療獲得不同療效造成的影響。