GRM4正向別構(gòu)調(diào)節(jié)劑抑制乳腺癌細胞的增殖并促進細胞凋亡

李林海，肖 斌，郭梓璇，賴斯華，古麗米熱?安外爾，符玉文，陳建蕓，孫朝暉

1.中國人民解放軍廣州總醫(yī)院檢驗科，廣東 廣州 510000；

2.嘉應學院檢驗系，廣東 梅州 514000；

3.廣州醫(yī)科大學檢驗系，廣東 廣州 510000

谷氨酸受體是介導谷氨酸生物學作用的重要門控開關，是多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療靶點。谷氨酸受體分為離子型谷氨酸受體和代謝型谷氨酸受體，其中代謝型谷氨酸受體4（glutamate metabotropic receptor4，GRM4）屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，可通過G蛋白介導直接與離子通道偶聯(lián)，抑制K+和Ca2+通道開放，K+電導降低，引起緩慢的去極化，增加細胞的興奮性［1］，激活第二信使及下游信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)。GRM4基因已被定位在EJM1區(qū)域內(nèi)，并代表高級候選基因［2］，是GRM的一員，在離子通道調(diào)節(jié)、神經(jīng)元興奮與神經(jīng)遞質(zhì)釋放等方面發(fā)揮重要作用。近年來，GRM4在腫瘤生物學中的機制研究逐漸被人們關注。研究表明GRM4在結(jié)腸癌［3］、前列腺癌［4］及骨肉瘤［5］等多種腫瘤中高表達并與腫瘤患者的預后相關，并且激活GRM4能夠抑制成神經(jīng)管細胞瘤的增殖能力［6］。但GRM4在乳腺癌中的生物學作用尚不清楚。

正向別構(gòu)調(diào)節(jié)劑（positive allosteric modulators，PAM）是結(jié)合在別構(gòu)酶的調(diào)節(jié)部位并激活該酶催化活性的生物分子，也是研究候選靶蛋白生物學功能的重要工具。近期，Selleck公司推出了兩款GRM4的正向別構(gòu)調(diào)節(jié)劑：VU0364439（分子式：C18H13C12N3O3S，相對分子質(zhì)量：422.29）和VU0364770（C12H9CIN2O，相對分子質(zhì)量：232.67），作為治療帕金森病、焦慮和疼痛的候選藥物。VU0364439的半最大有效濃度（concentration for 50% of maximal effect，EC50）為19.8 nmol/L，是目前為止最強的GRM4正性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑［7］。VU0364770是一種新研發(fā)的特異性的GRM4正向別構(gòu)調(diào)節(jié)劑（EC50=1.1 μmol/L）；經(jīng)測試VU0364770對68種細胞膜受體，包括其他代謝性谷氨酸受體亞型均沒有作用活性［8］。兩種正向別構(gòu)調(diào)節(jié)劑均對GRM4有較強的別構(gòu)激活作用，且具有較好的特異性。

本研究擬分析VU0364439和VU0364770對多種乳腺癌細胞系增殖及凋亡的影響，為探索以GRM4為靶點的新的乳腺癌治療方案提供思路。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)與實驗試劑

人乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3、BT474、HCC1937、MDA-MB-453和人正常乳腺癌上皮細胞MCF-10A均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫；細胞用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)溫箱中生長。VU0364439（Cat：S8035，CAS：1246086-78-1，10 mmol/L溶于1 mL DMSO）和VU0364770（Cat：S2862，CAS：61350-00-3，10 mmol/L溶于1 mL DMSO）購自美國Selleck公司（圖1）；CellTiter-Glo?細胞活性檢測試劑購自美國Promega公司（Cat：G7570）；總RNA提取試劑盒（Cat：ER101-01）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（AH341-01）、實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)試劑盒（Cat：AQ131-01）和細胞凋亡試劑盒（Cat：FA101-01）購自北京全式金生物技術有限公司。

圖 1 VU0364439和VU0364770的分子結(jié)構(gòu)Fig. 1 The molecular structures of VU0364439 and VU0364770

1.2 化學發(fā)光法測定細胞增殖活性

將乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7和SK-BR-3鋪于96孔板中，每孔約1萬個細胞，在各孔中分別單獨加入不同濃度的VU0364439和VU0364770（4、20和100 μmol/L）及聯(lián)合加入VU0364439和VU0364770（4、20和100 μmol/ L），以相應濃度的DMSO溶液作為陰性對照組并準備無細胞培養(yǎng)基的對照孔，以獲得背景發(fā)光值。48 h后，每孔加入100 μL CellTiter-Glo?試劑，震蕩混勻2 min使得細胞裂解，室溫溫育10 min后，用分光光度計記錄熒光信號。

1.3 流式細胞術測定細胞凋亡

將乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7和SK-BR-3鋪于6孔板中，每孔約40萬個細胞，在各孔中分別單獨加入不同濃度的VU0364439和VU0364770（4、20和100 μmol/L）及聯(lián)合加入VU0364439和VU0364770（4、20和100 μmol/ L），以相應濃度的DMSO溶液作為陰性對照組，48 h后，使用不含EDTA的胰酶消化收集細胞；用預冷的PBS洗滌細胞2次，500×g，4 ℃離心5 min，收集細胞；加入100 μL預冷的1×AnnexinⅤ結(jié)合緩沖液，重懸細胞；加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和5 μL PI，輕輕混勻；室溫避光反應15 min；加入400 μL預冷的1×AnnexinⅤ 結(jié)合緩沖液，輕輕混勻，將樣品于冰上避光放置，1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測。

1.4 RTFQ-PCR檢測

1.4.1 RNA的提取

1.4.1.1 樣品處理

使用胰蛋白酶處理6孔板中培養(yǎng)的乳腺癌細胞（約4×105個），4 ℃ 12 000×g離心5 min；輕彈離心管底部，使細胞沉淀松散，加入相應體積的裂解液BB4（每1 mL BB4，加10 μL β-巰基乙醇，現(xiàn)用現(xiàn)配）。劇烈旋渦震蕩，直至細胞沉淀分散均勻；用RNase-Free的針管反復吹吸5～10次，使溶液均質(zhì)化；室溫下12 000×g離心5 min，吸上清液于RNase-Free的離心管中。

1.4.1.2 RNA提取

向上清液中加入1倍體積70%乙醇，漩渦振蕩，分散沉淀；將得到的溶液和沉淀一起加入離心柱中，12 000×g離心30 s，棄掉流出液；向離心柱中加入500 μL CB4，室溫12 000×g離心30 s，棄掉流出液；加入500 μL WB4，室溫12 000×g離心30 s，棄掉流出液；室溫12 000×g離心2 min，徹底去除殘留的乙醇；將離心柱轉(zhuǎn)入一個新1.5 mL RNase-Free的離心管中，并向離心柱中央加50 μL RNase-Free Water，室溫靜置1 min；室溫12 000×g離心2 min，洗脫RNA；將RNA置于-80 ℃保存。

1.4.2 逆轉(zhuǎn)錄與RTFQ-PCR反應

逆轉(zhuǎn)錄反應體系：總RNA50 ng，5×SuperMix 4 μL，gDNA去除劑1 μL，加RNase-Free Water至20 μL。輕輕混勻體系，50 ℃溫育15 min，85 ℃加熱5 s失活逆轉(zhuǎn)錄酶及gDNA 去除劑。

RTFQ-PCR反應體系：cDNA模板 2 μL，正向引物0.2 μmol/L，反向引物0.2 μmol/L，2×RTFQ-PCR SuperMix 10 μL，加ddH2O至20 μL反應體系。

RTFQ-PCR反應條件：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40～45個循環(huán)，熔解曲線。GRM4上游引物為5’-TGAGGGTGCTGTCACGATCC-3’，GRM4下游引物為5’-ACGTGGCTGCCCTTCTTGAG-3’；β-actin上游引物為5’-ACAGAGCCTCGCC TTTGCCGAT-3’，β-actin下游引物為5’-CTTG CACATGCCGGAGCCGTT-3’。

2 結(jié) 果

2.1 GRM4正向別構(gòu)調(diào)節(jié)劑抑制乳腺癌細胞增殖

在3種乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7、SK-BR-3中，VU0364439和VU0364770在濃度為100 μmol/L時，對3種乳腺癌細胞的增殖均有顯著的抑制作用，而濃度為4和20 μmol/L時抑制作用不明顯。VU0364439和VU0364770聯(lián)合使用時，也能夠抑制3種乳腺癌細胞的增殖，但抑制效果與單獨使用VU0364439和VU0364770基本一致（圖2）。

2.2 GRM4正向別構(gòu)調(diào)節(jié)劑促進乳腺癌細胞凋亡

在MCF-7細胞中，DMSO處理組的平均細胞凋亡百分比（Q2+Q3）為16.36%，而加入VU0364439和VU0364770后，細胞凋亡百分比分別達到了32.47%和42.71%；與對照組相比，聯(lián)合使用VU0364439和VU0364770也顯著促進MCF-7細胞凋亡，但聯(lián)合使用與單獨使用相比差異無統(tǒng)計學意義（圖3）。

圖 2 化學發(fā)光法測定VU0364439和VU0364770的單獨使用和聯(lián)合使用對3種乳腺癌細胞增殖能力的影響Fig. 2 Chemiluminescence assay showed the eあect of VU0364439 and VU0364770, which were used alone or in combination on the proliferation of three breast cancer cells lines

圖 3 流式細胞術檢測單獨使用或聯(lián)合使用VU0364439和VU0364770對乳腺癌細胞系MCF-7凋亡的影響Fig. 3 Flow cytometry assay showed the eあect of VU0364439 and VU0364770, which were used alone or in combination on the apoptosis of breast cancer cell line MCF-7

2.3 GRM4正向別構(gòu)調(diào)節(jié)劑促進GRM4基因的表達

RTFQ-PCR檢測GRM4在6種不同的乳腺癌細胞系及正常乳腺上皮細胞MCF-10A中的表達，如圖4A所示，GRM4在多數(shù)乳腺癌細胞及對照細胞中表達較低，而在MCF-7中表達水平最高。在MCF-7細胞中，單獨或聯(lián)合使用VU0364439和VU0364770均能促進GRM4的表達，而聯(lián)合使用VU0364439和VU0364770與單獨使用對GRM4基因表達的促進作用差異無統(tǒng)計學意義（圖4B）。

圖 4 VU0364439和VU0364770促進GRM4的表達Fig. 4 VU0364439 and VU0364770 promoted the expression of GRM4

3 討 論

GRM4是代謝型谷氨酸受體的一種亞型，是G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor，GPCR）家族C組的成員。GRM4在腫瘤生物學中的研究報道較少，原因之一就是缺乏選擇性配體，特別是通過正位作用位點以外的區(qū)域起作用的別構(gòu)調(diào)節(jié)劑［9］。本研究以體外培養(yǎng)的乳腺癌細胞系為研究對象，初步探討了VU0364439和VU0364770對乳腺癌細胞系增殖和凋亡的影響。研究發(fā)現(xiàn)，當兩種別構(gòu)調(diào)節(jié)劑達到一定使用濃度時，均能夠抑制多種乳腺癌細胞的增殖，并且促進乳腺癌細胞凋亡；兩種別構(gòu)調(diào)節(jié)劑聯(lián)合使用時，并沒有起到疊加效應。兩種別構(gòu)調(diào)節(jié)劑均能夠促進GRM4基因的表達，但聯(lián)合使用與單獨使用相比差異無統(tǒng)計學意義。以上結(jié)果表明，GRM4可能是乳腺癌的抑癌基因。

別構(gòu)調(diào)節(jié)劑是結(jié)合在別構(gòu)酶的調(diào)節(jié)部位調(diào)節(jié)該酶催化活性的生物分子。別構(gòu)調(diào)節(jié)劑可以是激活劑（正向），也可以是抑制劑（反向）。正向別構(gòu)調(diào)節(jié)劑與GRM4的結(jié)合與調(diào)控作用機制極為復雜，可能涉及到蛋白構(gòu)象的重組或相互作用蛋白及下游信號通路的改變，還可能通過正反饋通路促進GRM4基因的表達。事實上，一些正向別構(gòu)調(diào)節(jié)劑已在腫瘤的治療中體現(xiàn)出了其潛在的臨床應用價值，如A型氨基丁酸受體GABAAR的正向別構(gòu)調(diào)節(jié)劑3α-diol可以影響前列腺癌細胞的增殖［10］；MRS1477是TRPV1通道的正向別構(gòu)調(diào)節(jié)劑，其與辣椒素的聯(lián)合使用能夠協(xié)同發(fā)揮抑制乳腺癌增殖的作用［11］。

GRM4作為抑癌基因的作用僅在神經(jīng)管細胞瘤中有報道，而研究表明GRM家族的其他成員在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用。GRM3主要表達于小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0的細胞凋亡中期，敲低GRM3能顯著抑制細胞凋亡［12］；GRM5與肝癌細胞的發(fā)生、發(fā)展關系密切，其抑制劑MPEP能夠促進肝癌細胞凋亡，抑制肝癌細胞遷移［13］。GRM1是報道最多的GRM家族成員，其可作為乳腺癌抗血管生成治療方案的藥物作用靶點［14］，也是軟骨黏液樣纖維瘤中重要的致癌驅(qū)動基因［15］。由此可見，GRM家族的不同成員在各種惡性腫瘤中發(fā)揮不同作用。

綜上所述，本研究初步對GRM4的兩種正向別構(gòu)調(diào)節(jié)劑對乳腺癌細胞增殖和凋亡的作用進行了探討，進一步配合一些常規(guī)化療藥物進行輔助治療驗證是我們下一步的研究目標，本研究為探索以GRM4為靶點的乳腺癌治療方案奠定了基礎。