低滲腫脹實(shí)驗(yàn)、苯胺藍(lán)染色及染色質(zhì)擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)檢測(cè)精子核蛋白及膜完整性對(duì)比研究

李安娜 張美華 房振亞 邱毅

精子膜完整性與精子代謝、頂體反應(yīng)、精子獲能及精卵融合密切相關(guān)，測(cè)定精子膜是否完整可以準(zhǔn)確地反映精子功能并預(yù)測(cè)精子潛在受精能力。通過(guò)精子尾部低滲腫脹實(shí)驗(yàn)(hypoosmotic swellingtest,HOST)測(cè)定人精子膜功能始創(chuàng)于1984年，是目前為數(shù)不多的評(píng)價(jià)精子膜功能的檢測(cè)方法之一，越來(lái)越廣泛地被應(yīng)用于男性生殖避孕和不育的基礎(chǔ)研究和臨床診治中[1-4]。細(xì)胞的物質(zhì)交換和新陳代謝活動(dòng)依靠細(xì)胞膜進(jìn)行，精子在男、女性生殖道中極易受到各種化學(xué)物質(zhì)影響，精子膜對(duì)這些物質(zhì)的傳遞能力直接影響精子的活力和新陳代謝，從而關(guān)系到能否獲能，完成受精的全過(guò)程。因此，評(píng)價(jià)精子膜功能在精子功能檢測(cè)中具有重要意義。但是，單純的精子低滲腫脹實(shí)驗(yàn)只能檢測(cè)精子細(xì)胞膜是否完整，而不能檢測(cè)出核蛋白是否受損，不能準(zhǔn)確地判斷精子的活性[5,6]。精子DNA完整性對(duì)自然受孕、人工授精、胚胎、胎兒、嬰兒甚至成人的發(fā)育至關(guān)重要[7,8]。研究表明精子DNA完整性是優(yōu)于常規(guī)精液分析的獨(dú)立參數(shù)[5,6]，與輔助生殖技術(shù)結(jié)局有相關(guān)性[7],已經(jīng)有多種方法如精子苯胺藍(lán)(aniline blue,AB)染色、精子染色質(zhì)擴(kuò)散(sperm chromatin dispersion,SCD)實(shí)驗(yàn)及脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling,TUNEL)檢測(cè)精子染色質(zhì)和DNA的完整性，但這些檢測(cè)的結(jié)果與流產(chǎn)或其他懷孕結(jié)果之間是否有關(guān)尚不清楚[1]。因此，對(duì)男性不育患者進(jìn)行精子DNA完整性分析，有助于探討或發(fā)現(xiàn)其不育的原因，為患者的預(yù)防和治療提供咨詢及診斷依據(jù)。但現(xiàn)有的檢測(cè)方法難以同時(shí)準(zhǔn)確判斷出同一條精子的細(xì)胞膜及核蛋白是否受損，即難以對(duì)精子的質(zhì)量作出精確的評(píng)價(jià)。

本文將精子低滲腫脹實(shí)驗(yàn)分別與AB染色核蛋白檢測(cè)、SCD實(shí)驗(yàn)及TUNEL聯(lián)合使用與各檢驗(yàn)方法單獨(dú)使用相比較，目的是驗(yàn)證同時(shí)檢測(cè)精子核蛋白及膜完整性是否可以更準(zhǔn)確地判斷精子質(zhì)量，從而改進(jìn)精子質(zhì)量的檢測(cè)方法。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

選取2012年5月—2016年10月就診已育成年健康男性志愿者30例。臨床試驗(yàn)入選標(biāo)準(zhǔn)為無(wú)心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)疾病，無(wú)傳染病史，需采取避孕措施節(jié)育，身體健康、已婚且至少生育有1個(gè)子女的男性(32～48歲，有二胎生育指標(biāo))，填寫知情同意書。本臨床試驗(yàn)經(jīng)山東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、研究方法

1.精液常規(guī)分析：按照WHO《人類精液及精子-宮頸粘液相互作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊(cè)》[9]精液變量參考值的標(biāo)準(zhǔn)：液化時(shí)間少于60 min，精液量>2 ml，濃度大于20×106/ml，存活率≥60%，前向運(yùn)動(dòng)精子≥50%，精子正常形態(tài)率>30%，為正常精液指標(biāo)參數(shù)。連續(xù)3次精液常規(guī)檢查5×106/ml≤精子密度<20×106/ml為少精子癥，精子密度<5×106/ml為嚴(yán)重少精子癥。

2.試劑制備：

(1)低滲液：100 ml超純水中加入0.735 g檸檬酸鈉和1.35 g果糖，檢測(cè)離子強(qiáng)度為0.15(系數(shù))，滲透壓為150 mOsm(摩斯摩爾)。

(2)伊紅-吉姆薩染液：100ml生理鹽水中加入0.5 g伊紅(E6003,美國(guó)Sigma公司)和0.1g吉姆薩(G4507,美國(guó)Sigma公司)混勻配置成0.5%的染液，雙層濾紙過(guò)濾，所得濾液即伊紅-吉姆薩染液，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

3.精子低滲腫脹實(shí)驗(yàn)(HOST)：向1 ml低滲液中加入0.1 ml精液，混勻,37℃水浴30 min，使用顯微鏡觀察200個(gè)精子，計(jì)算尾部腫脹的精子比率。

4.苯胺藍(lán)染色(AB染色)與染色質(zhì)擴(kuò)散(SCD)實(shí)驗(yàn)[5，8]及脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)實(shí)驗(yàn)按照常規(guī)方法進(jìn)行[10-12]。

5.HOST結(jié)合精子苯胺藍(lán)染色(HOST/AB)：取1 ml低滲處理(HOST)后的精液，1000 rpm離心5 min，棄上清，所得精子沉渣用PBS稀釋到10×106/ml；取0.1 ml上述精子懸液與0.1 ml PBS充分混勻，1000 rpm離心3min，棄上清，精子沉淀物加0.1 ml PBS洗滌3次后加0.1 ml明膠，吸取20 μl置入載玻片上，空氣中自然干燥；載玻片在室溫條件下加甲醇固定90 s；加入0.4 mol/L的苯胺藍(lán)染色5 min；自來(lái)水緩慢沖洗，然后將載玻片浸入生理鹽水中脫色19 min；自然晾干或吹干后加甘油封固液2滴，蓋玻片封片。普通光學(xué)顯微鏡下觀察200個(gè)精子。

6.HOST結(jié)合精子染色質(zhì)擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)(HOST/SCD)：取1 ml低滲處理(HOST)后的精液，1000 rpm離心5 min，棄上清，精子沉渣用PBS稀釋到10×106/ml，取0.2 ml精液與瓊脂凝膠按1：1比例混勻，37℃孵育；吸取50 μl上述精液置于瓊脂包被的載玻片上，蓋蓋玻片4℃放置4 min；去除蓋玻片，放入0.08 N的HCl內(nèi)室溫孵育7 min后加入0.4 M Tris，0.8M DTT，1% SDAS，室溫孵育5 min；標(biāo)本片放入0.09 M的Tris和0.002 M的EDTA沖洗2 min；經(jīng)70%、90%和100%乙醇梯度脫水；空氣中自然干燥后加入DAPI染色，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。加入瑞-吉氏染液后顯微鏡下觀察精子。

7.HOST結(jié)合脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)實(shí)驗(yàn)：取1 ml低滲處理(HOST)后的精液，1000 rpm離心5 min，棄上清，精子沉渣用PBS稀釋到10×106/ml，取0.2ml精液與瓊脂凝膠按1∶1比例混勻，37℃孵育5 min；吸取50 μl上述精液置于瓊脂包被的載玻片上，蓋蓋玻片4℃放置4 min；去除蓋玻片，置于4%多聚甲醛中固定25 min，PBS清洗；置于0.2% Triton X-100中5 min，PBS清洗；將50 μl TdT和450 μl熒光素標(biāo)記的dUTP液混勻制備混合液；載玻片加50～100 μl二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物,15～25 ℃孵育10 min；蘇木素或甲基綠復(fù)染，自來(lái)水沖洗；梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片；顯微鏡下觀察結(jié)果。

結(jié) 果

一、HOST/AB實(shí)驗(yàn)結(jié)果

精子在低滲溶液里進(jìn)行腫脹實(shí)驗(yàn)后，接著進(jìn)行精子苯胺藍(lán)染色核蛋白檢測(cè)，得到的精子形態(tài)變化及核蛋白改變共有4種類型(AB1-AB4)，見(jiàn)表1及圖1。其中：AB1型精子是精子膜與核蛋白均完整的，精子頭部未被苯胺藍(lán)染色且尾部腫脹，是正常的精子；AB2型精子是核蛋白完整而精子尾部膜受損，精子頭部未被苯胺藍(lán)染色而尾部未腫脹；AB3型精子是精子核蛋白受損而尾部膜未受損，精子頭部被苯胺藍(lán)染色而尾部腫脹；AB4型精子是精子核蛋白受損且尾部也受損，精子頭部被苯胺藍(lán)染色且尾部未腫脹。單獨(dú)AB和單獨(dú)HOST實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)與HOST/AB聯(lián)合法相比，AB1型與AB4型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；單獨(dú)AB和單獨(dú)HOST實(shí)驗(yàn)正常精子比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.410)。

表1 單純精子低滲HOST、單純精子AB核蛋白檢測(cè)及HOST/AB聯(lián)合實(shí)驗(yàn)正常生育男性檢測(cè)結(jié)果比較Table 1 Comparison of testing results of normal fertility males with HOST,AB and HOST/AB combined experiment

*P<0.001，compared to HOST/AB.

圖1 (a)HOST/AB結(jié)合實(shí)驗(yàn)正常AB1型精子圖像，頭部未被苯胺藍(lán)染色且尾部腫脹，精子膜與核蛋白均完整的，是活動(dòng)的正常精子；(b)AB2型精子，核蛋白完整而精子尾部膜受損，精子頭部未被苯胺藍(lán)染色而尾部未腫脹，這種精子是有活動(dòng)能力的精子；(c)AB3型精子，精子核蛋白受損而尾部膜未受損，精子頭部被苯胺藍(lán)染色而尾部腫脹，在單純精子低滲腫脹實(shí)驗(yàn)里被判斷為活動(dòng)的精子，因?yàn)榫游材な悄[脹的，即完整的；(d)AB4型精子，精子核蛋白受損且尾部也受損，精子頭部被苯胺藍(lán)染色且尾部未腫脹，是死精子；(e)HOS/AB結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可見(jiàn)尾部腫脹頭部被苯胺藍(lán)染色的精子；(f)單純HOS實(shí)驗(yàn)精子圖像。Figure 1 (a) Type AB1 sperm of HOST/AB experiment:Its head was not stained with aniline blue and tail was swollen.the sperm membrane and nuclear protein were intact.It was active normal sperm; (b) Type AB2 sperm:Its nucleoprotein was intact and tail membrane was damaged.The sperm head was not stained with aniline blue and the tail was not swollen.This sperm was movable; (c) Type AB3 sperm:Its nucleoprotein was damaged and the tail membrane was not affected.Its head is stained with aniline blue and the tail was swollen.It was judged to be active sperm in HOST,because the sperm tail membrane was swollen that it was intact; (d) Type AB4 sperm:Its nucleoprotein was damaged and tail was intact.the sperm head was stained with aniline blue and the tail was not swollen,it was dead sperm; (e) The sperm with swollen tail and blue head in HOS/AB binding experiment; (f) The sperm image in HOS experiment.

二、HOST/SCD實(shí)驗(yàn)結(jié)果

計(jì)數(shù)500個(gè)精子，觀察精子光暈大小及尾部腫脹情況，分為4個(gè)等級(jí)(A-D)，見(jiàn)表2及圖2。A型：尾腫脹(HOS+)而具有大光暈或中光暈 (SCD+)的精子，判斷為尾膜及DNA均完整的精子，(SCD+)-(HOS+)。B型：尾不腫脹(HOS-)而具有大光暈或中光暈 (SCD+)的精子，判斷為尾膜損傷而DNA完整的精子，(SCD+)-(HOS-)。C型：尾腫脹(HOS+)而具有小光暈或無(wú)光暈的精子，判斷為尾膜完整而DNA損傷的精子，(SCD-)-(HOS+)。D型：尾不腫脹(HOS-)而具有小光暈或無(wú)光暈的精子，判斷為尾膜及DNA均損傷的精子，(SCD-)-(HOS-)。單獨(dú)SCD和單獨(dú)HOST實(shí)驗(yàn)與HOST/SCD實(shí)驗(yàn)相比，A型和D型精子比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；單獨(dú)SCD和單獨(dú)HOST實(shí)驗(yàn)中正常精子比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.127)。

表2 應(yīng)用單純HOS、單純SCD及HOST/SCD結(jié)合實(shí)驗(yàn)30例正常生育男性檢測(cè)結(jié)果比較 Table 2 Comparison of testing results of 30 normal males with HOS、SCD and HOST/SCD

*P<0.01，compared to HOST/SCD.

圖2 (a) 單純SCD實(shí)驗(yàn)顯示大光暈及中光暈精子(SCD+)；(b) HOS/SCD結(jié)合實(shí)驗(yàn),1為小光暈而尾部不腫脹的精子(D型精子)，2為無(wú)光暈的精子，3、4和5為具有大光暈且尾部腫脹的精子，(SCD+)--(HOS+)；(c)具有大光暈且尾部腫脹的精子；(d)具有大光暈而尾部未腫脹的精子；(e) 具有中光暈且尾部腫脹的精子；(f)具有中光暈而尾部未腫脹的精子；(g) 具有小光暈且尾部腫脹的精子；(h) 具有小光暈而尾部未腫脹的精子；(i) 無(wú)光暈而尾部腫脹的精子；(j) 無(wú)光暈且尾部未腫脹的精子；(k) 尾部腫脹的雙頭精子；(l) 尾部未腫脹的針尖頭樣精子；(m)無(wú)光暈而尾部腫脹的退化的精子；(n)無(wú)光暈且尾部未腫脹的精子。Figure 2 (a) SCD experiments show large and medium halo sperm (SCD+); (b) HOS/SCD binding experiments:1 was a sperm with small halo and tail not swollen (D-type sperm); 2 was a sperm without halo; 3,4 and 5 were sperms with large halo and tail swelling,(SCD+)--(HOS+).(c) Sperm with large halo and swollen tail; (d) Sperm with large halo and tail not swollen; (e)Sperm with medium halo and swollen tail; (f) Sperm with medium halo and tail not swollen; (g)Sperm with small halo and swollen tail; (h)Sperm with small halo and tail not swollen; (i) Sperm without halo and with swollen tail; (j)Sperm without halo and swollen tail; (k) Bouble-headed sperm with swollen tail; (l) Needle-like sperm without swollen tail; (m) Degraded sperm without halo and with swollen tail; (n) Sperm without halo swollen tail.

三、HOST/TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果

HOST、TUNEL及HOST/TUNEL結(jié)合實(shí)驗(yàn)共測(cè)定30例正常生育男性，HOST/TUNEL結(jié)合實(shí)驗(yàn)得得到的精子形態(tài)變化及凋亡共有4種類型(A-D)見(jiàn)表3與圖3，其中A型精子尾部腫脹、精子頭部染藍(lán)色，即精子膜與染色質(zhì)均完整而未發(fā)生凋亡的，精子是具有活動(dòng)能力或是活的；B型精子頭部染藍(lán)色而尾部未腫脹，即精子染色質(zhì)完整、未凋亡而尾部膜損傷，是有活動(dòng)能力的精子；C型精子頭部染紅色或紫色而尾部腫脹，是凋亡精子；D型精子頭部染紅色或紫色而尾部也不腫脹，是凋亡和尾部膜損壞的精子。單獨(dú)TUNEL和單獨(dú)HOST實(shí)驗(yàn)與HOST/TUNEL實(shí)驗(yàn)相比，A型和D型精子比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表3 應(yīng)用單純HOST、TUNEL及HOST/TUNEL結(jié)合實(shí)驗(yàn)30例正常生育男性檢測(cè)結(jié)果比較Table 3 Comparison of testing results of 30 normal males with HOS、TUNEL and HOST/TUNEL

*P<0.01，compared to HOST/TUNEL.

圖3 (a)單純TUNEL實(shí)驗(yàn)。1為頭部染藍(lán)色后顯示為綠色的正常精子；2為頭部染藍(lán)色后顯示為紫色的凋亡精子圖像，沒(méi)有經(jīng)過(guò)HOST實(shí)驗(yàn)，尾部沒(méi)有腫脹；(b)HOST/TUNEL結(jié)合實(shí)驗(yàn)。1為A型精子，即頭部染成綠色而尾部腫脹的精子，2為B型精子，即頭部染成綠色而未尾部腫脹的精子；(c)HOST/EUNEL結(jié)合實(shí)驗(yàn)：A型；(d)為B型；(e)為C型；(f)為D型。Figure 3 (a)TUNEL experiment:1 was normal sperm with green head after staining blue; 2 was apoptotic sperm with purple head after staining blue,whose tail was not swollen without HOST; (b) HOST/TUNEL experiment:1 was a type A sperm,that the head was green and the tail was swollen; 2 was a type B sperm,that the head was green and the tail was not swollen; (c) HOST/TUNEL experiment： Type A; (d) Type B; (e) Type C; (f) Type D.

討 論

在人類精子成熟過(guò)程中，DNA極易受內(nèi)外環(huán)境因素影響而形成DNA碎片，從而引起精子形態(tài)和功能異常，導(dǎo)致男性不育，并帶來(lái)遺傳風(fēng)險(xiǎn)。盡管精子DNA完整性一直是生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)，但過(guò)去對(duì)精子DNA完整性的研究并不多，主要原因是方法學(xué)不足。隨著技術(shù)的改進(jìn)和研究的深入，精子DNA完整性檢測(cè)方法逐漸增多。但應(yīng)用精子膜完整性與DNA完整性檢測(cè)同一條精子的結(jié)合方法尚少見(jiàn)報(bào)道。

在HOST和HOST/AB實(shí)驗(yàn)的對(duì)比中，AB1(HOS+)和 AB4(HOS-)型精子分別對(duì)應(yīng)活動(dòng)且頭膜-尾膜完整的精子和死亡精子。但對(duì)AB2型精子，單純HOST實(shí)驗(yàn)會(huì)判斷其為沒(méi)有活動(dòng)能力的死精子，但實(shí)際上這種精子是活精子，只是精子尾部膜受到損傷；而對(duì)AB3型精子，單純HOST實(shí)驗(yàn)則判斷其為活精子，但實(shí)際上這種精子是死精子。其中AB2型和AB3型精子(5.1%～5.7%)在單獨(dú)HOST及單獨(dú)AB實(shí)驗(yàn)中判斷的結(jié)果是相反的，而HOST/AB兩種方法結(jié)合判斷為異常精子，所以，應(yīng)用HOST/AB結(jié)合實(shí)驗(yàn)才能對(duì)這些精子做出正確判斷。

在HOST和HOST/SCD實(shí)驗(yàn)的對(duì)比中,A(HOS+)型精子和D(HOS-)型精子分別對(duì)應(yīng)活動(dòng)且精子尾部膜-DNA均完整的精子和精子DNA及膜均損傷的死亡精子。但對(duì)B型精子，單獨(dú)使用HOST實(shí)驗(yàn)只能判斷其為死精子，但實(shí)際上這種精子是活精子，只是精子尾部膜受到損傷；而對(duì)C型精子，單純HOST則判斷其為活精子，實(shí)際上這種精子是死精子，應(yīng)用HOST/SCD檢測(cè)結(jié)合實(shí)驗(yàn)，才能對(duì)這些精子做出正確判斷。本研究在改良的SCD實(shí)驗(yàn)[6]基礎(chǔ)上，進(jìn)一步縮短了操作時(shí)間，并改瑞氏染液為瑞氏-姬姆薩染液，在普通光學(xué)顯微鏡下可清晰觀察到精子暈環(huán)，方法穩(wěn)定、簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，可直觀定量顯示精子DNA完整性水平，使之更適用于臨床檢測(cè)。HOST/SCD觀察到4個(gè)等級(jí)(A-D)精子，其中B型和C型精子(5.8%～5.9%)在單獨(dú)HOST及單獨(dú)SCD實(shí)驗(yàn)中判斷的結(jié)果是相反的，而HOST/SCD兩種方法結(jié)合判斷為異常精子，增加了異常精子的檢出比例。

TUNEL法是檢測(cè)細(xì)胞凋亡過(guò)程中細(xì)胞核DNA 完整性的有效方法，廣泛應(yīng)用于男性不孕癥研究中[14]。有研究比較了TUNEL 法、SCSA 法和SCGE 法三種檢測(cè)方法，認(rèn)為TUNEL 法能更好的檢測(cè)出精子DNA 單鏈及雙鏈的斷裂情況[15]。在HOST和HOST/TUNEL實(shí)驗(yàn)的對(duì)比中,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了單純精子HOST實(shí)驗(yàn)對(duì)于判斷精子活動(dòng)能力和膜的完整性是不完全的，單純TUNEL實(shí)驗(yàn)判斷精子是否正常也是不完全的。對(duì)于A型精子和D型精子，單純HOST實(shí)驗(yàn)和本發(fā)明所述方法的實(shí)驗(yàn)判斷結(jié)果是一致的，即A型精子是活動(dòng)的和頭膜-尾膜完整的精子，D型精子是DNA和膜均損傷的精子(凋亡)，是死亡的精子，但對(duì)B型精子，單只能判斷其為死精子，實(shí)際上這種精子是活精子，而對(duì)C型精子則判斷為活精子，實(shí)際上這種精子是死精子。將HOST和TUNEL結(jié)合在同一條精子上進(jìn)行，使單獨(dú)HOST及單獨(dú)TUNEL試驗(yàn)檢測(cè)部分為正常的精子確定為異常精子，因?yàn)閮煞N方法都存在一定缺陷，如HOST試驗(yàn)只能檢測(cè)精子膜的完整性，而不能測(cè)定精子的DNA完整性及凋亡情況，TUNEL試驗(yàn)只能測(cè)定精子的DNA完整性及凋亡情況，而不能檢測(cè)精子膜的完整性。因此，建立TUNEL/HOST結(jié)合實(shí)驗(yàn)很有必要。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了單純HOST實(shí)驗(yàn)對(duì)于判斷精子活動(dòng)能力和膜的完整性是不完全的。單純的AB、SCD及TUNEL實(shí)驗(yàn)只能判斷核蛋白或DNA的完整性而不能對(duì)精子的膜完整性進(jìn)行正確判斷。因此，這三種聯(lián)合實(shí)驗(yàn)對(duì)精子的核蛋白、DNA及膜完整性的判斷是較為準(zhǔn)確和實(shí)用的。