響應(yīng)面法優(yōu)化仙人掌果花色苷的提取工藝

吉雪慧，張?bào)蓿?，劉術(shù)明，竇迎港

（1.黑龍江東方學(xué)院，黑龍江哈爾濱150066；2.黑龍江貝因美乳業(yè)有限公司，黑龍江安達(dá)151400）

仙人掌果（Opuntia ficus-indica）為仙人掌屬（Opuntia）植物的果實(shí)。果漿肉質(zhì)為紅色或紫色，果肉可食，酸甜可口[1]。由于天然色素對(duì)人體無(wú)毒無(wú)害、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，而且具有一定的生物活性，因此，研究開(kāi)發(fā)無(wú)毒無(wú)害的天然色素就成為了色素未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。花色苷是一類(lèi)廣泛存在于高等植物中的天然水溶性色素，存在于很多水果、蔬菜和花朵中，呈現(xiàn)紅、藍(lán)、紫或者黑的色澤[2]。具有一定的營(yíng)養(yǎng)和藥理作用，有較高的安全性能，而且具有抗突變、抗氧化、降血壓、保護(hù)肝臟等保健功能[3-6]，被廣泛用于功能性食品和保健品的原料和著色，含花色苷的植物提取物已被意大利、德國(guó)等國(guó)家的藥典收載[7]。目前，仙人掌果除被當(dāng)?shù)乩习傩丈倭坎墒持?，尚無(wú)他用。國(guó)內(nèi)有關(guān)仙人掌的開(kāi)發(fā)利用研究的報(bào)道較多，但有關(guān)仙人掌果的資料報(bào)道甚少。本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，基于響應(yīng)面法（response surface methogology，RSM）研究提取溫度、提取時(shí)間和乙醇提積分?jǐn)?shù)對(duì)水提取仙人掌果中花色苷進(jìn)行研究，并確定提取花色苷的條件，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用仙人掌果中花色苷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海南野生仙人掌果；無(wú)水乙醇、氯化鉀、濃鹽酸、結(jié)晶乙酸鈉（分析純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；濃鹽酸：天津市耀華化學(xué)試劑有限責(zé)任公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

UV1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海棱光技術(shù)有限公司；FDU-1100型冷凍干燥機(jī)：日本東京理化儀器有限公司；JJ200型電子天平：美國(guó)雙杰兄弟有限公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī)：上海市離心機(jī)械研究所；Microstirrer6磁力攪拌器：意大利VELP。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料的預(yù)處理

仙人掌果洗凈、去刺，取適量的仙人掌果原料放入榨汁機(jī)中，加水，打成漿，將其漿液倒入培養(yǎng)皿中，放入超低溫冰箱中，使其溫度冷凍至零下，放入真空冷凍干燥機(jī)中，待其水分被蒸發(fā)完全，粉碎機(jī)粉碎，過(guò)100目篩，裝于密封袋中，4℃冷藏備用。

1.2.2 仙人掌果花色苷的提取

準(zhǔn)確稱取2.0 g原料粉末，加入錐形瓶中并添加一定量體積的乙醇溶液，放置磁力攪拌器中按照預(yù)先設(shè)定的溫度條件預(yù)處理一定的時(shí)間，將其倒入離心管中以4 500 r/min的轉(zhuǎn)速，離心15 min，取1 mL上清液于25 mL容量瓶中，分別加入10 mL的pH=1和pH=4.5的緩沖溶液，靜置60 min后，用相應(yīng)濃度的乙醇定容。用紫外分光光度計(jì)于530 nm處測(cè)量其吸光度[8]。用pH示差法計(jì)算仙人掌果花色苷的含量，計(jì)算公式[9]如下：

1.3 單因素試驗(yàn)

采用1.2.2設(shè)計(jì)的仙人掌果中花色苷的提取方法進(jìn)行試驗(yàn)：固定提取時(shí)間為60 min，提取溫度為60℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%3個(gè)因素，考察不同料液比[1∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）]對(duì)仙人掌果吸光度的影響；固定料液比1∶25（g/mL），提取時(shí)間為60 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%三個(gè)因素，考察不同提取溫度（50、55、60、65、70 ℃） 對(duì)仙人掌果花色苷吸光度的影響；固定料液比1∶25 g/mL，提取溫度為60℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%3個(gè)因素，考察不同提取時(shí)間（50、60、70、80、90 min）對(duì)仙人掌果花色苷吸光度的影響；固定料液比1∶25（g/mL），提取時(shí)間為60 min，提取溫度為60℃3個(gè)因素，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（40%、45%、50%、55%、60%）對(duì)仙人掌果花色苷吸光度的影響。進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各因素變量對(duì)仙人掌果花色苷的吸光值的影響。

1.4 仙人掌果花色苷提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以料液比為1∶25（g/mL）進(jìn)行試驗(yàn)，以530 nm吸光值為指標(biāo)，對(duì)提取時(shí)間、溫度、提取劑體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行單因素試驗(yàn)。根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[10]，以提取時(shí)間、溫度、提取劑體積分?jǐn)?shù)為影響因素，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)因素與水平如表1所示。

表1 因素水平表Table 1 Independent variables and levels for optimization

1.5 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用spss 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 仙人掌果花色苷提取單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)仙人掌果花色苷提取工藝的影響

料液比對(duì)仙人掌果花色苷提取工藝的影響見(jiàn)圖1。

圖1 料液比對(duì)仙人掌果花色苷提取工藝的影響Fig.1 Effects of solid-liquid ratio on extraction yield of anthocyanins of cactus fruit

由圖1可見(jiàn)，隨著液料比的增大，提取液的吸光值也增加，當(dāng)液料比達(dá)到1∶25（g/mL）時(shí)，吸光值最大。此后當(dāng)溶劑用量繼續(xù)增加，吸光值下降，表明花色苷提取率也在下降。這可能是由于色素在高濃度時(shí)分子之間存在自聚作用使其比較穩(wěn)定，而增加溶劑時(shí)，色素濃度降低以致色素分子之間的作用力變?nèi)?，其穩(wěn)定性下降而容易分解[11]，最后花色苷含量趨于平衡，說(shuō)明色素已經(jīng)基本提取出來(lái)。因此，應(yīng)選擇液料比為1∶25（g/mL），這樣既有利于仙人掌果花色苷的提取，也利于減少后續(xù)濃縮步驟的成本。

2.1.2 提取溫度對(duì)仙人掌果花色苷提取工藝的影響

即便如此，我仍固執(zhí)地認(rèn)為，像沙莉這樣的“植物人”只能存活于自然經(jīng)濟(jì)社會(huì)，在現(xiàn)代商品社會(huì)里，終究會(huì)被類(lèi)似于我這樣更富斗爭(zhēng)性的“猛獸”們淘汰出局。我暗下決心，一定要讓她知道我的厲害！

提取溫度對(duì)仙人掌果花色苷提取工藝的影響見(jiàn)圖2。

圖2 提取溫度對(duì)仙人掌果中花色苷提取率的影響Fig.2 Effects of extraction temperature on extraction yield of anthocyanins of cactus fruit

由圖2可見(jiàn)，在一定范圍內(nèi)，隨著提取溫度的增加，仙人掌果花色苷的提取率不斷增加，當(dāng)提取溫度達(dá)到65℃時(shí)，提取率達(dá)到最大，隨后再增加提取溫度，提取率反而降低了。這是因?yàn)橄扇苏乒ㄉ赵诘偷臏囟戎胁蝗菀捉?，在高溫度下發(fā)生了降解，破壞了結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致吸光度減小。因此，選擇提取溫度為65℃，此試驗(yàn)結(jié)果與李媛媛[12]研究一致。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)仙人掌果花色苷提取工藝的影響

提取時(shí)間對(duì)仙人掌果花色苷提取工藝的影響見(jiàn)圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)仙人掌果中花色苷提取率的影響Fig.3 Effects of extraction time on extraction yield of anthocyanins of cactus fruit

如圖3所示，隨著提取時(shí)間的增加，花色苷的提取率不斷增加。當(dāng)提取時(shí)間為70 min時(shí)，提取率達(dá)到最高。提取時(shí)間較短時(shí)，花色苷并未完全浸提，提取時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，空氣的氧化作用使花色苷成分分解進(jìn)而產(chǎn)生褪色現(xiàn)象[13]。所以導(dǎo)致吸光度不高。因此選擇提取時(shí)間為70 min，這與王紅梅[14]在仙人掌果中提取黃酮物質(zhì)工藝優(yōu)化中的最佳提取時(shí)間相同。

2.1.4 溶劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)仙人掌果花色苷提取工藝的影響

溶劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)仙人掌果花色苷提取工藝的影響見(jiàn)圖4。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)仙人掌果中花色苷提取率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on extraction yield of anthocyanins of cactus fruit

通過(guò)圖4可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，仙人掌果花色苷的提取率增加，在50%乙醇溶液提取時(shí)，提取率達(dá)到最高，隨后逐漸降低，同時(shí)也考慮到乙醇濃度越低，溶液沸點(diǎn)越高，不利于后期溶劑的回收處理[15]，故最佳的提取條件是乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%。

2.2 仙人掌果花色苷提取的最佳工藝參數(shù)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒓捌浣Y(jié)果

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取提取溫度（X1）、提取時(shí)間（X2）和乙醇濃度（X3）3個(gè)影響因素，采用三因素三水平的響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)花色苷提取率（Y）進(jìn)行優(yōu)化[16]。按照Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，對(duì)各項(xiàng)回歸系數(shù)進(jìn)行回歸擬合，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Box-Behnken design with the observed responses

續(xù)表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Continue table 2 Box-Behnken design with the observed responses

利用Design-expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件通過(guò)逐步回歸對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到花色苷提取率對(duì)提取溫度、提取時(shí)間、溶劑體積分?jǐn)?shù)3個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸模型：Y=289.44+5.84X1-37.91X2+17.50X3-0.65X1X2+2.47X1X3-11.17X2X3-56.95X12-81.34X22-39.02X32。對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 二次回歸方程模型方差分析Table 3 ANOVA for the regression model

由表3可知，模型具有高度顯著性（P<0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.988 5>0.05）[17]，可知回歸方程擬合度和可信度均很高，試驗(yàn)誤差較小，故可用此模型對(duì)仙人掌果中花色苷提取的工藝結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算原理可知，回歸方程相關(guān)系數(shù)R2為0.982 1，說(shuō)明模型能解釋98%響應(yīng)值的變化，說(shuō)明該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合程度良好[18]，用該模型對(duì)乙醇提取仙人掌果中花色苷的提取過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化是合適的。

2.2.2 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化

根據(jù)回歸方程，作響應(yīng)面圖和等高線圖，考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀，分析提取時(shí)間、提取溫度以及乙醇的體積分?jǐn)?shù)對(duì)花色苷提取率的影響。模型的響應(yīng)面和等高線圖如圖5、圖6和圖7所示。

圖5 時(shí)間、溫度對(duì)花色苷提取率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response of contour plots and surface plots of the extraction yield under the interaction of temperature and time amount

依據(jù)各因素X1、X2和X3對(duì)響應(yīng)值Y所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，可反映各因素對(duì)其響應(yīng)值的影響。等高線的形狀能夠反映這兩種因素交互作用的強(qiáng)弱，結(jié)合對(duì)應(yīng)的響應(yīng)面圖能夠分析自變量對(duì)響應(yīng)值的影響。當(dāng)?shù)雀呔€越接近圓形，表明這兩種因素對(duì)響應(yīng)值的影響不顯著，反之，越接近橢圓，對(duì)響應(yīng)值影響越顯著。響應(yīng)面圖可以比較直觀的看出各因素對(duì)仙人掌果花色苷提取率的影響，曲線越陡峭，表明該因素對(duì)提取率的影響越大，響應(yīng)值的變化越大[19-20]。由圖5可知，提取溫度和提取時(shí)間的曲面的坡度較為平緩，所以這兩個(gè)因素對(duì)花色苷的提取率的交互作用不明顯；由圖6可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)和溫度的響應(yīng)曲面的坡度較陡，表明仙人掌果花色苷的提取率對(duì)乙醇體積和提取溫度的變化較敏感；由圖7可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間響應(yīng)面的坡度較平緩，說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間對(duì)花色苷提取率的響應(yīng)值交互作用不明顯。符合表2中對(duì)方程3個(gè)交互項(xiàng)的方差分析結(jié)果。因此，各影響因素對(duì)仙人掌果中花色苷提取率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。為進(jìn)一步確定最佳提取工藝參數(shù)，采用Design-expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)模型進(jìn)行優(yōu)化求解，可得最佳工藝參數(shù)為：提取溫度57.48℃，提取時(shí)間70.59 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)51.32%，此仙人掌果花色苷的提取率為296.7 mg/100 g。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)、溫度對(duì)色素提取率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response of contour plots and surface plots of the extraction yield under the interaction of temperature and solvent amount

圖7 提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)色素提取率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Response of contour plots and surface plots of the extraction yield under the interaction of solvent and time amount

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

最優(yōu)工藝條件確定與模型驗(yàn)證通過(guò)Design-Expert.8.0.6軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行計(jì)算，得提取仙人掌果花色苷最佳工藝條件為：溫度57.48℃，時(shí)間70.59 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)51.32%。由于對(duì)條件可操作性考慮，將最佳提取工藝條件修正為：溫度55℃，時(shí)間70 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)51%，采用此提取條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù) 3次，花色苷含量為（284±1.27）mg/100 g，與預(yù)測(cè)值296.7 mg/100 g相近。說(shuō)明通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化后的提取條件參數(shù)可靠，具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

在提取溫度、提取時(shí)間和溶劑體積分?jǐn)?shù)3個(gè)因素的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)仙人掌果中花色苷提取的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的提取工藝條件為：提取溫度55℃、提取時(shí)間70 min、溶劑體積分?jǐn)?shù)51%，此時(shí)仙人掌果花色苷的含量為296.7 mg/100 g。此工藝參數(shù)的確定可以減少工藝操作的盲目性，從而對(duì)后續(xù)仙人掌果花色苷精細(xì)加工提供理論依據(jù)。