冷卻豬肉中降膽固醇假單胞菌的篩選與鑒定

王京，張明贊

（貴州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025）

假單胞菌（Pseudomonas.spp）是一種外形為直或稍彎的革蘭氏陰性桿菌，也是一種嚴(yán)格好氧菌、從不發(fā)酵的無核細(xì)菌。導(dǎo)致冷卻肉類腐敗變質(zhì)的主要微生物有多種，假單胞菌是其一[1－2]，占肉類腐敗微生物的25%～26%。田璐等[3]研究表明，假單胞菌利用肌氨酸的能力比較強(qiáng)，促使了需氧型假單胞菌在有氧條件下大量繁殖，因而引起冷卻肉腐壞[4]。假單胞菌需要足夠的碳源與能源才能存活。冷卻豬肉含有豐富的碳源和能源，是我國(guó)和國(guó)外日常生活主要的肉類食品之一[5]。冷卻豬肉因其保質(zhì)期長(zhǎng)，柔軟多汁，口感細(xì)膩、鮮美，是豬肉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)[6]。在低溫貯藏條件下，導(dǎo)致肉類腐壞的微生物中，假單胞菌占很大比重[7]。因此，越來越多的研究更加關(guān)注的是假單胞菌作為腐敗菌研究，而對(duì)假單胞菌的其他功能性研究還不夠深入。

目前，隨著人們的生活質(zhì)量不斷提高，膳食營(yíng)養(yǎng)亦日益豐富，患高脂血癥等心腦血管疾病的機(jī)率也增大了。最新流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告[8]表明膽固醇水平每降低1%，冠心病的發(fā)病率就會(huì)降低2.5%，因此科研工作者們爭(zhēng)相研究怎樣才能降低人體血清的膽固醇含量。目前，人們通常用3種方式來調(diào)節(jié)人體內(nèi)血清的膽固醇量，一是控制食品中膽固醇的攝入量，二是抑制膽固醇在體內(nèi)的合成，三是促進(jìn)體內(nèi)膽固醇的轉(zhuǎn)化及排泄。最近，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)膽固醇的代謝與假單胞菌有關(guān)，主要是假單胞菌能產(chǎn)生一種降膽固醇脂酶的作用[9－10]。目前我國(guó)主要是從國(guó)外引進(jìn)假單胞菌，因此有必要篩選出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的降膽固醇假單胞菌菌株，而從冷卻豬肉中篩選出新菌株比較容易。本研究主要從冷卻豬肉中篩選一株假單胞菌株，使用鄰苯二甲醛法測(cè)量菌株在降膽固醇方面的能力，并對(duì)耐酸性進(jìn)行評(píng)估，為以后開發(fā)降膽固醇假單胞菌的食品藥品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

依據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T 9959.2－2008《鮮、凍片豬肉》中要求，樣本都是從超市購(gòu)買后，貯藏特定溫度范圍（0℃～4℃）內(nèi)，在2 h之內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。

假單胞菌培養(yǎng)基[11]：c－f－c 選擇劑 0.1 g，酵母粉 3 g，吐溫80和NH4NO3、膽固醇、牛肉膏各1 g，蔗糖5 g，MgSO4·7H2O和KH2PO4各0.25 g，F(xiàn)eSO40.001 g，培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)為7.0±0.2；蒸餾水1 000 mL。

改良PTYG培養(yǎng)基（胰蛋白胨酵母培養(yǎng)基）[12]：吐溫80 1 mL，鹽溶液40 mL，葡萄糖和酵母提取物各10 g，L－半胱氨酸鹽酸鹽 0.5 g，瓊脂粉 15 g，大豆蛋白胨5 g、胰蛋白胨5 g、低聚果糖5 g，將各成分用蒸餾水1 000 mL，煮沸去除氧氣，高溫滅菌（121℃）20 min。

改良PTYG液體培養(yǎng)基：吐溫80 1 mL，鹽溶液40 mL，葡萄糖和酵母提取物各10 g，L－半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g，大豆蛋白胨5 g、胰蛋白胨5 g、低聚果糖5 g，將各成分用蒸餾水1 000 mL，煮沸去除氧氣，高溫滅菌（121℃）20 min。

PTYG瓊脂培養(yǎng)基（含有 5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D半乳糖苷）：在改良PTYG培養(yǎng)基中加入X－gal（40 mg/L）[13]，X－gal放于－20℃避光保存，高溫會(huì)分解，用滅菌水稀釋至20 mg/mL，每個(gè)改良的PTYG瓊脂平板涂布40 μL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

降膽固醇培養(yǎng)基：加入膽固醇膠束溶液，使改良PTYG液體培養(yǎng)基成為含有膽固醇濃度為0.1 mg/mL的降膽固醇培養(yǎng)基。含有0.1 mg/mL膽固醇膠束溶液的1 000 mL的液體培養(yǎng)基的配制：（1）分析天平精確稱取膽固醇0.1 g；（2）依次加入蔗糖八乙酸酯0.1 g，膽鹽 0.2 g，吐溫 80 1 mL，攪拌均勻；（3）加入 5 mL 冰乙酸加熱溶解，超聲15 min；（4）迅速加入到配好的改良PTYG液體培養(yǎng)基中，同時(shí)攪拌均勻，使其成為均一穩(wěn)定的膠體溶液，121℃滅菌20 min。

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液的配制（1 mg/mL）：精密稱取0.05 g（精確至0.01 mg）膽固醇（色譜純）標(biāo)品，放入小燒杯中，再加入10 mL無水乙醇，待完全溶解后定容至50 mL，即得1 mg/mL的膽固醇母液，4℃保存。

鄰苯二甲醛（O－phthalaldehyde，OPA）試劑的配制（0.5 mg/mL）：精密稱取 0.05 g（精確至 0.01 mg）鄰苯二甲醛，放入燒杯中，再加入20 mL的冰乙酸，待完全溶解后定容至100 mL，常溫避光保存，注意現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 儀器與設(shè)備

MLS－3750高壓蒸汽滅菌鍋：三洋（SANYO）有限公司；SPX－250BY－III生化培養(yǎng)箱：常州恒隆儀器有限公司；FA2004電子天平：上海方瑞儀器有限公司；SWCJ－1D超凈工作臺(tái)：北京永光明醫(yī)療儀器有限公司；902－ULTS超低溫冰箱：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；CX21SF1奧林巴斯生物顯微鏡：奧林巴斯中國(guó)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種分離篩選與鑒定

分離篩選：稱取5.0 g冷卻豬肉，放入錐形瓶，再向其中加入50 mL無菌生理鹽水，再加入4顆小玻璃珠，在溫度為37℃、轉(zhuǎn)速設(shè)置為180 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)30 min，吸取5 mL振蕩后溶液加入富集培養(yǎng)基（250 mL三角瓶裝液量為50 mL）中，同樣條件下?lián)u床富集培養(yǎng)24 h。取0.2 mL稀釋適當(dāng)梯度的富集懸浮液涂布于假單胞菌培養(yǎng)基上，靜置5 min后，平板倒置放于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，溫度設(shè)置為37℃。將形成單一菌落，劃線純化后劃Z形線保藏于斜面培養(yǎng)基上，37℃條件下培養(yǎng)1 d或2 d直到斜面出現(xiàn)豐滿的菌落后，放于4℃冰箱保藏，菌株編號(hào)為JXJ。

生理生化實(shí)驗(yàn)初步鑒定：篩選出耐酸耐膽鹽受性好且膽固醇去除率高的菌株，利用糖發(fā)酵鑒定管和對(duì)碳源的利用[14－15]鑒定并觀察記錄結(jié)果，本試驗(yàn)中采用的糖發(fā)酵鑒定管中主要有13種糖（分別為D－核糖、無糖對(duì)照管、纖維二糖、棉籽糖、松三糖、麥芽糖、甘露糖、乳糖、D－阿拉伯糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖鹽酸鹽、淀粉）。

分子鑒定：利用傳統(tǒng)的菌種鑒定方法如菌落特征、形態(tài)特征、生理生化特征[16]和16S rRNA、recA基因序列分析對(duì)菌種進(jìn)行準(zhǔn)確的分類鑒定，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（用MEGA5.0生物學(xué)軟件），采用鄰近相連算法（Neighbor－joining）對(duì)該菌株的16S rRNA序列進(jìn)行分析，初始值設(shè)定為1 000次，之后在樹枝上對(duì)自展值進(jìn)行標(biāo)記，從而確定出菌株的種類[17]。

1.3.2 菌落形態(tài)特征及細(xì)胞形態(tài)特征觀察

樣品經(jīng)處理后培養(yǎng)，由其形成菌落的形態(tài)和顏色篩選后用革蘭氏染色法進(jìn)行處理，然后用顯微鏡觀察，先用低倍鏡找到菌落，再換用高倍鏡觀察單個(gè)細(xì)菌形態(tài)特征，同時(shí)做好記錄。挑菌，原則是挑選菌落較小、表面光滑、邊緣整齊、呈乳白色且質(zhì)地柔軟的單一菌落，將挑出的菌落在改良的PTYG的瓊脂培養(yǎng)基上純化，通常傳代4次后，可以得到純化菌株，編號(hào)記錄，并用甘油凍存于-80℃。

1.3.3 繪制鄰苯二甲醛法（OPA）標(biāo)準(zhǔn)曲線

設(shè)置6個(gè)清潔試管，分別吸取0.02、0.05、0.10、0.12、0.15、0.20 mL的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液置于其中，再分別加入無水乙醇，使試管中溶液體積為1 mL，數(shù)據(jù)見表1，在各試管中加入4 mL的OPA試劑，在室溫條件下放置10 min。然后向其中緩慢加入4 mL的濃硫酸，為使其充分混勻，用振蕩器振蕩20 s，完成后放置于黑暗條件下10 min，最后測(cè)其在550 nm處的吸光值，以吸光值為x軸，膽固醇濃度為y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合出線性回歸方程。用1 mL無水乙醇作為空白對(duì)照組。

表1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)表Table 1 Data list of cholesterol standard curve

1.3.4 假單胞菌待測(cè)液的準(zhǔn)備

將之前凍存的純化菌株進(jìn)行復(fù)蘇，方法是將取出的菌株迅速放入37℃的水浴鍋中，可適當(dāng)晃動(dòng)以使其快速融化，再用移液槍吸取100 μL滴在改良的PTYG液體培養(yǎng)基上，用玻璃棒涂布均勻，倒置放于CO2含量5%，濕度100%，溫度37℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2天后，再進(jìn)行挑菌，然后用平板劃線的方法進(jìn)行純化，傳代3次后，接種在改良的PTYG液體培養(yǎng)基中，37℃搖床上進(jìn)行搖菌，24 h后將菌液收集至離心管進(jìn)行離心，計(jì)數(shù)，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer solution）重懸菌液，使菌體量為3×108CFU/mL，后將其按接種量為10%（體積分?jǐn)?shù)）接種于含有0.1 mg/mL膽固醇的PTYG液體培養(yǎng)基，搖床搖菌24 h后離心管收集菌液，離心后取上清，同時(shí)用適量PBS洗滌菌落2次，每次洗滌液可轉(zhuǎn)入上清，一同作為待測(cè)液用于測(cè)定膽固醇的去除率，并同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，即空白的未添加菌落的膽固醇培養(yǎng)基。假單胞菌降膽固醇率S按公式（1）計(jì)算：

式中：S為膽固醇去除率，%；A為未接種菌株的含有膽固醇的PTYG液體培養(yǎng)基中膽固醇的含量，mg/mL；B為待測(cè)上清液中膽固醇的含量，mg/mL。

1.3.5 耐酸實(shí)驗(yàn)

將細(xì)菌懸液以接種量為5%（體積分?jǐn)?shù)）分別接種于pH值7.0和3.0的改良PTYG液體培養(yǎng)基中（pH值用0.1 mol/LHCl或NaOH調(diào)節(jié)），搖勻后放入孵箱，靜置2 h，每組重復(fù)3次。再用滅菌后的生理鹽水按10倍的比例進(jìn)行梯度稀釋，至適合濃度后，吸取100 μL均勻涂布于改良的PTYG固體培養(yǎng)基上，倒置于放入CO2孵箱，24 h后，進(jìn)行計(jì)數(shù)。

菌株的存活率N按公式（2）計(jì)算：

式中：N為菌株存活率，%；N0為菌株的存活菌數(shù)（在pH值為3.0的PTYG液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h后）；N1為菌株的存活菌數(shù)（在pH值為7.0的PTYG液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h后）。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)均由SPSS 20.0，OriginPro9.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落與細(xì)胞形態(tài)

在平板上挑一株假單胞菌株，記：菌株JXJ。菌株的平板菌落形態(tài)如圖1。

圖1 純化菌落形態(tài)和鏡檢10×40倍Fig.1 Schematic of puried colonies morphology and microscopy

由圖1可知，菌落在假單胞菌培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度較快，菌落特征明顯，呈淡黃色半透明，近圓形，邊緣齊整，光滑稍隆起，菌落直徑1.5 mm～3.0 mm，經(jīng)比對(duì)該株菌株與熒光假單胞菌（P.fluorescens）特征接近。根據(jù)以上形態(tài)及生理生化特征可知菌株JXJ的特征符合假單胞桿菌屬，初步鑒定它屬假單胞菌屬（Pseudomonas）。

2.2 假單胞菌降膽固醇能力

2.2.1 繪制OPA法測(cè)降膽固醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線[16]

按照表1對(duì)不同濃度的膽固醇測(cè)定其在550 nm處的吸光值A(chǔ)550，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

圖2 膽固醇標(biāo)品的OPA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Standard curve of cholesterol measured by OPA

圖2表明了在0～0.20 mg/mL范圍內(nèi)，當(dāng)膽固醇濃度增加的時(shí)候，吸光值也隨著增加。根據(jù)圖2得出了膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程y=4.926 4x-0.013 0，其相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2。

2.2.2 菌株的膽固醇去除能力

將篩選到的JXJ株菌，純化后挑選10株菌，分別標(biāo)注JXJ1、JXJ2、JXJ3、JXJ4、JXJ5、JXJ6、JXJ7、JXJ8、JXJ9、JXJ10。對(duì)膽固醇的去除能力用鄰苯二甲醛（OPA）法測(cè)定，得到菌株的降膽固醇能力見表2。

表2 不同菌株的體外膽固醇去除率的結(jié)果（M±SD，n=3）Table 2 Degradation rate of cholesterol of strains in vitro（M±SD，n=3）

由表2可知，10株假單胞菌膽固醇去除率均達(dá)到了5.00%以上，最高的是菌株JXJ7達(dá)到了7.01%，結(jié)果表明這10株菌都具備一定的降膽固醇能力，為進(jìn)一步篩選出所需要的菌株，選擇膽固醇去除率最高的JXJ5、JXJ7、JXJ8 3株進(jìn)行下一步耐酸受性實(shí)驗(yàn)。目前，對(duì)菌株的膽固醇去除率研究主要體現(xiàn)在雙歧桿菌，而對(duì)假單胞菌的降膽固醇研究還處于探索階段[22]。

2.3 酸耐受性結(jié)果

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，假單胞菌的數(shù)量在減少[16]，目前，主要用活菌體內(nèi)增殖的方法來提高體內(nèi)假單胞菌的數(shù)量。因?yàn)槿梭w胃液的pH值通常維持在0.9～1.8左右[17]，當(dāng)人體食用帶假單胞菌食品或者藥品時(shí)，假單胞菌會(huì)在小腸中發(fā)揮益生作用。在進(jìn)食的過程中，因?yàn)槊總€(gè)人的身體素質(zhì)不同，吃的食物也有差異，所以胃部的pH值通常會(huì)在1.8～6.0范圍內(nèi)變化，但是一般在3.0左右。除此之外，人們所吃的食物一般會(huì)在胃中停留90 min，且腸道中不同部位的pH值會(huì)有所不同[17]。而假單胞菌生長(zhǎng)的最適pH值在6.5～7.0之間，因此，本研究中對(duì)所篩選的菌株進(jìn)行了酸耐受性的實(shí)驗(yàn)，不同菌株的耐酸受性也會(huì)有差異，3株降膽固醇能力高的菌株其耐酸性能見表3。

表3 菌株耐酸性能結(jié)果（M±SD，n=3）Table 3 Strains’tolerance to low pH（M±SD，n=3）

由表3可知，3株假單胞菌在酸性條件下的存活率均在90%以上，表明這3株菌都具備一定的耐酸能力，而且耐酸能力較好。其中JXJ7的存活率最高，達(dá)到了96.13%?？梢钥闯觯嵝詶l件會(huì)在一定程度上抑制假單胞菌的生長(zhǎng)，但存活率仍然高于95%，主要是因?yàn)榫昃哂休^強(qiáng)的耐酸性。近年來，假單胞菌的耐酸性廣受研究者的關(guān)注，研究結(jié)論表明與章茂林等[23]研究的假單胞菌的耐酸性一致。

2.4 菌株生理生化實(shí)驗(yàn)初步鑒定

自篩菌株JXJ7的[19-20]鑒定結(jié)果如表4和表5，可以看出所篩選的假單胞菌有很好的生理生化效果，結(jié)合菌株的菌落形態(tài)、菌株形態(tài)特征和糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果與GB/T 4789.29-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)椰毒假單胞菌酵米面亞種檢驗(yàn)》及伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)對(duì)照得到JXJ為動(dòng)物假單胞菌。

表4 菌株JXJ的生理生化鑒定結(jié)果Table 4 The physiological and biochemical results of JXJ

續(xù)表4 菌株JXJ的生理生化鑒定結(jié)果Continue table 4 The physiological and biochemical results of JXJ

2.5 序列分析

將JXJ菌株的全部16S rRNA序列[21]分別提交到NCBI，通過Blast在線程序在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索與已刊登的16S rRNA序列同源性進(jìn)行比較，下載同源性較高的菌株的序列，使用軟件MEGA 5.0對(duì)其進(jìn)行分析，通過鄰近法對(duì)系統(tǒng)樹進(jìn)行構(gòu)建，并且Bootstrap1000次檢驗(yàn)分子系統(tǒng)樹置信度獲得系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖3）。

表5 JXJ生理生化特征-碳源利用Table 5 Physiological and biochemical characteristics（utilization of carbon sources）of the strain JXJ

圖3 基于JXJ的部分16S rRNA序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree on the similarity of partial 16S rRNA sequence of the strain JXJ

從系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出，該菌所在的最大分支中其所包括的菌株均為假單胞菌，菌株JXJ的16S rRNA序列與Pseudomonas sp.HY13KR序列同源性在99%以上，且屬于同一個(gè)最小分支中，因此菌株JXJ的鑒定結(jié)果為動(dòng)物假單胞菌乳亞種。

3 結(jié)論

在冷卻豬肉中所篩選的JXJ7為假單胞菌并具有很好的生理生化特性，其表面光滑，邊緣整齊且為半透明或不透明狀，經(jīng)鏡檢多呈桿狀，菌落微小，為革蘭氏陰性菌株，假單胞菌的膽固醇去除率為7.01%，在pH3.0條件培養(yǎng)下，其存活率高達(dá)96.13%，具有很好的耐酸性。本研究為假單胞菌的預(yù)測(cè)和檢測(cè)提供了有效工具，研究假單胞菌作為相關(guān)藥品食品來降低體內(nèi)的膽固醇提供了數(shù)據(jù)支撐，同時(shí)為開發(fā)降膽固醇假單胞菌的食品藥品奠定基礎(chǔ)。