榴蓮凍肉中污染微生物的分離鑒定和低溫存活時(shí)間研究

（綠城農(nóng)科檢測技術(shù)有限公司，浙江杭州310052）

榴蓮富含豐富的蛋白質(zhì)、維生素及礦物質(zhì)等，被譽(yù)為“水果之王”，但其一旦成熟就不易保存，目前最好的保存方式就是采用深凍技術(shù)延長榴蓮保鮮期，也就是榴蓮凍肉，它是水果糕點(diǎn)制品的原材料之一，但仍然逃不過微生物的污染。食品中的生物性污染在國內(nèi)外都是影響食品安全的最主要原因，食源性致病菌是食物中毒和食源性疾病暴發(fā)的重要因素，也是食品安全的重要風(fēng)險(xiǎn)隱患[1]。微生物造成的威脅有兩方面：一是微生物毒素或病原微生物對消費(fèi)者的健康構(gòu)成威脅，二是食品腐敗造成經(jīng)濟(jì)損失[2]。我國的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)對糕點(diǎn)面包等，均規(guī)定微生物限量，控制項(xiàng)目包括菌落總數(shù)、大腸菌群、霉菌、及食源性致病菌[3]。食物污染來源的調(diào)查研究顯示，不合理的運(yùn)輸也會導(dǎo)致各類食物甚至非食物類物品間的交叉感染[4]。當(dāng)榴蓮水果凍肉進(jìn)行微生物檢測時(shí)，菌落總數(shù)僅代表衛(wèi)生指標(biāo)，但無法明確菌株類別，有必要進(jìn)行鑒定以明確其污染源。

目前，在食品檢測中細(xì)菌鑒定采取傳統(tǒng)手工生化鑒定、半自動或全自動鑒定儀如ATB細(xì)菌鑒定儀、VITEK系列鑒定系統(tǒng)等。而在醫(yī)療領(lǐng)域，由于大量的臨床標(biāo)本需要快速鑒定，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix－assisted laser sesorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI－TOF－MS）應(yīng)用微生物鑒定以其快速、準(zhǔn)確、成本低而占具優(yōu)勢[5]。食品中出現(xiàn)微生物污染水平較高時(shí)，運(yùn)用該方法進(jìn)行鑒定較少。試驗(yàn)采用傳統(tǒng)腸道桿菌及其它革蘭氏陰性菌鑒定試劑條（API 20E）和鏈球菌及有關(guān)菌鑒定試劑條（API 20Strep）方法結(jié)合 MALDI－TOF－MS 方法，鑒定三類菌落形的細(xì)菌，分別為明串珠菌屬，粘質(zhì)沙雷氏菌和陰溝腸桿菌。了解榴蓮凍肉的污染菌后可以針對它們的來源進(jìn)行防控措施。粘質(zhì)沙雷氏菌廣泛分布于土壤及水環(huán)境中，其產(chǎn)色素的培養(yǎng)溫度為20℃～36℃，顏色最紅為30℃和28℃，這個(gè)結(jié)果與已有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)保持一致[6－9]。據(jù)報(bào)道這是因?yàn)檎迟|(zhì)沙雷氏菌生長需要礦質(zhì)元素鉀、鈣而 K+、Ca2+、Cu2+和 Mn2+能顯著提高色素產(chǎn)量[7]；而榴蓮營養(yǎng)成分中富含人體所需的豐富礦物質(zhì)元素，如鉀、鈣、鐵、鎂、錳、銅等礦質(zhì)元素[10]。因此，可以通過選擇產(chǎn)色素的溫度作為與其它細(xì)菌有效分離的溫度。陰溝腸桿菌是腸桿菌科腸桿菌屬的成員之一，該菌廣泛存在于自然界中，在人和動物的糞便、水、泥土、植物中均可檢出陰溝腸桿菌，是腸道正常菌種之一，作為條件致病菌成為人類醫(yī)院感染重要的病原菌[11]。陰溝腸桿菌常產(chǎn)生β內(nèi)酰胺酶，它是導(dǎo)致1代～3代頭孢菌素、單環(huán)β－內(nèi)酰胺類及含酶抑制劑的復(fù)合制劑耐藥的重要原因[12]，因此避免因食品污染而感染尤為重要。明串珠菌分布于自然生態(tài)環(huán)境中綠色植物的地上部分和根，但與需氧細(xì)菌和酵母相比數(shù)量少（＜1%），來源于自然環(huán)境的明串珠菌在蔬菜、飼料和多種發(fā)酵食品等各種植物材料中容易繁殖[13]。因此，防范從源頭入手，探索該類水果中微生物檢測鑒定方法的同時(shí)，研究污染微生物的低溫存活時(shí)間，為人們進(jìn)行榴蓮水果食品安全生產(chǎn)運(yùn)輸保藏提供理論信息。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品來源

榴蓮凍肉：產(chǎn)地泰國，杭州市售。

1.1.2 培養(yǎng)基

平板計(jì)數(shù)瓊脂（platecountagar，PCA）、氯化鈉胰酪胨大豆肉湯瓊脂培養(yǎng)基（tryptic soy agar，TSA）、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（nutritional agar，NA）：青島高科技園海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 試劑

API 20 E腸桿菌及G－菌、API 20 Strep鏈球菌生化試劑：生物梅里埃中國有限公司；氧化酶試劑、觸酶試劑、革蘭氏染色液試劑等其它生化試劑：青島高科技園海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 儀器

MALDI－TOF MS Clin－ToF－II基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)：北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司；LRH－250F型生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GI80TW型高壓滅菌器：致微（廈門）儀器有限公司；HFSafe－1500LC II級A2型生物安全柜：上海力申科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌落總數(shù)測定

稱取25 g樣品至225 mL 0.85%無菌氯化鈉溶液，取此培養(yǎng)液1 mL加0.85%無菌氯化鈉溶液9 mL，采用10倍遞增稀釋法，吸取1 mL樣品勻液于無菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿，傾注平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，于（36±1）℃倒置培養(yǎng) 48 h。

1.2.2 分離純化

選取適宜稀釋度的平板，按不同菌落形態(tài)的細(xì)菌，分別劃線接種TSA，30℃～35℃培養(yǎng)24 h。產(chǎn)色素的菌株，設(shè)置不同溫度進(jìn)行分離培養(yǎng)，確定產(chǎn)色素溫度范圍和優(yōu)選最適溫度。分離的菌株通過菌落形態(tài)觀察、純化、染色鏡檢后分別保存于25%甘油溶液和瓷珠中，作為供試菌株用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 鑒定方法

傳統(tǒng)方法鑒定：將適宜稀釋度的單個(gè)菌落，按不同菌落形態(tài)細(xì)菌分別分離劃線于氯化鈉胰酪胨大豆肉湯瓊脂培養(yǎng)基（TSA）上，置36℃培養(yǎng)18 h～24 h，挑取單菌落通過革蘭氏染色、鏡檢，革蘭氏陰性桿菌接種到API 20E生化鑒定條，鏈球菌接種API 20 Strep板條，36℃培養(yǎng)24 h，讀生化結(jié)果。

MALDI－TOF－MS 用 1 μL 接種環(huán)直接挑取單個(gè)菌落點(diǎn)涂抹在金屬靶板上，滴加1 μL基質(zhì)液（50%乙腈與2.5%三氟乙酸混合配制的飽和α－氰基－4－羥基肉桂酸溶液），室溫晾干后將靶板放入MALDI－TOF－MS儀檢測。同時(shí)每次試驗(yàn)用大腸埃希菌DH5α的蛋白抽提液作為校準(zhǔn)品和陽性對照。

1.2.4 污染菌的低溫存活時(shí)間研究

將第一次檢測完的樣品于－20℃保存，然后每隔2個(gè)月按1.2.1進(jìn)行菌落總數(shù)檢測，連續(xù)監(jiān)測12個(gè)月，計(jì)數(shù)并觀察微生物污染情況，同時(shí)按最優(yōu)的鑒定方法進(jìn)行典型菌落鑒定。將－20℃保存1個(gè)月后的榴蓮樣品，測完菌落總數(shù)后，放入2℃～8℃冷藏，每天按1.2.1進(jìn)行菌落總數(shù)檢測，連續(xù)監(jiān)測4 d，計(jì)數(shù)并觀察微生物污染情況，同時(shí)按最優(yōu)的鑒定方法進(jìn)行典型菌落鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落總數(shù)測定

經(jīng)檢測榴蓮凍肉樣品中初始污染菌落總數(shù)平均為50 000 CFU/g。單菌落出現(xiàn)在1 000倍稀釋梯度，挑選典型菌落共50個(gè)用于分離純化鑒定。

2.2 分離純化

挑取梯度中的單菌落，用TSA分離純化得到3種不同菌落形態(tài)的細(xì)菌。一是紅色大菌落（LHD），菌落占比19%；二是白色大菌落（LBD），菌落大而濕潤的黏液狀，菌落占16%；三是白色小菌落（LBX）菌落，菌落占比65%。因LHD1菌落出現(xiàn)紅色，為了確認(rèn)紅色產(chǎn)生的溫度范圍，分離時(shí)設(shè)置了5個(gè)溫度分別為15、20、28、30、36、40 ℃見圖 1。

圖1 不同溫度下產(chǎn)紅色素能力Fig.1 The ability to produce red pigment in different temperatures

由圖1可知，紅色素在菌落中分布不均勻，菌落中心先出現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，紅色素分泌至整個(gè)菌落。產(chǎn)色素的能力范圍為20℃～36℃，15℃以下，40℃以上菌落生長，但不產(chǎn)色素。顏色最紅的是28℃和30℃，最淺的是20℃。當(dāng)把20℃的平皿延長培養(yǎng)或移入28℃培養(yǎng)24 h，菌落紅色加深。40℃移入28℃培養(yǎng)24 h出現(xiàn)少部分菌落產(chǎn)紅色素。為了使其與其它細(xì)菌明顯有效分開，分離純化時(shí)選用產(chǎn)紅色素能力最適溫度30℃。

2.3 菌株鑒定

2.3.1 傳統(tǒng)鑒定方法結(jié)果

經(jīng)API 20E和API 20 Strep系統(tǒng)生化鑒定，并查閱《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》第八版中描述，表明LHD型菌落共10株，有動力，具有產(chǎn)明膠酶和DNA酶的特性，阿拉伯糖、棉子糖和木糖均為陰性，為典型的粘質(zhì)沙雷氏菌，檢出率100%，置信度95.9%～99.8%。LBD型菌落共8株，其中1株出現(xiàn)不可接受的生化譜，不能鑒定，其它7株均為陰溝腸桿菌，鑒定置信度為92.9%～97.5%，檢出率為87.5%（7/8）。LBX型菌落菌株共32株，三者中鑒定最困難的菌株，其中出現(xiàn)無可接受生化譜的菌株占9.4%（2/32），檢出置信度低于90%的結(jié)果占25%（8/32），置信度為91.2%～98.9%的結(jié)果占65.6%（21/32），均為明串珠菌屬某些種。不同菌落形態(tài)的細(xì)菌鑒定結(jié)果具體見表1和表2。50株菌經(jīng)過傳統(tǒng)鑒定法總的檢出率為76%。

2.3.2 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDITOF－MS）鑒定結(jié)果

從分離的單個(gè)菌落開始、經(jīng)涂布、上機(jī)檢測讀結(jié)果，每個(gè)菌在1 min～2 min內(nèi)完成，操作步驟簡單快速，完成50個(gè)單菌落的鑒定，僅耗時(shí)1 h。鑒定結(jié)果當(dāng)置信度≥25分，表示結(jié)果可信；≤20分鑒定結(jié)果不可靠；20分～25分鑒定需通過其他輔助試驗(yàn)才能選出鑒定結(jié)果；試驗(yàn)表明50株菌包括質(zhì)控菌株大腸埃希氏菌全部正確檢出，檢出率100%，置信度全部大于25分。相同菌落形態(tài)的污染微生物鑒定結(jié)果一致，歸類成表4和圖2的結(jié)果。

表1 榴蓮凍肉中污染菌形態(tài)觀察結(jié)果Table 1 The results of colony morphologies for contaminated bacteria in durian frozen flesh

表2 榴蓮凍肉分離菌的生化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The biochemical results of bacteria isolated from durian frozen flesh

表4 榴蓮凍肉中污染菌的MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果Table 4 The results of microbe identification in durian frozen flesh with MALDI-TOF-MS

圖2 部分MALDI-TOF-MS鑒定典型圖譜Fig.2 Typical chart of MALDI-TOF-MS identification of colony

2.3.3 榴蓮凍肉中污染微生物存活時(shí)間

3組榴蓮凍肉樣品于－20℃保存下，連續(xù)監(jiān)測結(jié)果見圖3。

圖3 冷凍（-20℃）保存榴蓮凍肉中污染微生物變化Fig.3 Changes of microbial in durian fresh storage in-20℃

由圖3可知，紅色大菌落（LHD）存活時(shí)間為4個(gè)月，白色大菌落（LBD）存活時(shí)間為8個(gè)月，白色小菌落（LBX）存活時(shí)間大于12個(gè)月。經(jīng)后續(xù)跟蹤鑒定紅色大菌落（LHD）為粘質(zhì)沙雷氏菌，白色大菌落（LBD）為陰溝腸桿菌和白色小菌落（LBX）為明串珠菌屬。

2.3.4 榴蓮凍肉污染微生物冷藏下微生物的變化

污染微生物的3組榴蓮凍肉樣品于（2℃～8℃）冷藏，微生物變化結(jié)果見圖4。

圖4 冷藏（2℃～8℃）保存榴蓮凍肉中污染微生物變化Fig.4 Changes of microbial in durian fresh storage in 2℃-8℃

紅色大菌落（LHD）與白色大菌落（LBD）在數(shù)量級上無明顯變化，而白色小菌落（LBX）細(xì)菌濃度每天都有增長，第3天達(dá)到高峰，出現(xiàn)數(shù)量級升至8次方，之后趨向平穩(wěn)。經(jīng)后續(xù)鑒定該菌為明串珠菌屬。

3 結(jié)論與討論

從榴蓮凍肉中分離細(xì)菌的報(bào)導(dǎo)較少，試驗(yàn)從榴蓮凍肉污染的50株微生物中分離出3種細(xì)菌：10株粘質(zhì)沙雷氏菌、8株陰溝腸桿菌和32株明串珠菌屬。運(yùn)用了傳統(tǒng)方法和MALDI－TOF－MS時(shí)間飛行質(zhì)譜進(jìn)行鑒定。比較得出傳統(tǒng)方法檢出率低僅為76%，且操作繁瑣，即使是用API生化試驗(yàn)條，分離出單菌落后必須先做革蘭氏染色涂片、氧化酶試驗(yàn)或觸酶試驗(yàn)等前期鑒定，才能選擇相應(yīng)鑒定試條。上試條前還需要制備規(guī)定濃度的菌懸液，要求無菌操作技術(shù)嚴(yán)格，否則影響后續(xù)生化結(jié)果判讀準(zhǔn)確性和工作效率。其次，當(dāng)某個(gè)鑒定結(jié)果不能判定時(shí)，要求做許多補(bǔ)充試驗(yàn)。再是人工判讀時(shí)對生化反應(yīng)的結(jié)果把握存在因人而異的主觀性，易造成誤判或結(jié)果不可讀，試驗(yàn)中出現(xiàn)4株不可鑒定的菌株，用基質(zhì)輔助激光解析電離時(shí)間飛行質(zhì)譜，分別檢出為1株陰溝腸桿菌和3株假腸膜明串珠菌。對于菌落形態(tài)小的明串珠菌屬，傳統(tǒng)方法鑒定較困難。而MALDI－TOF－MS試驗(yàn)表明，同時(shí)對一個(gè)平皿上的多個(gè)菌落進(jìn)行鑒定，效率最高的是MALDI－TOFMS；只要分離到單菌落，檢出率高達(dá)100%，不用重復(fù)傳統(tǒng)方法的系列生化試驗(yàn)，上機(jī)后僅用3 min～5 min檢出一個(gè)結(jié)果，完成50株菌僅需1 h，試驗(yàn)中也得出培養(yǎng)時(shí)間24 h和存放更長時(shí)間的單菌落，鑒定結(jié)果仍一致，不會受到細(xì)菌生長時(shí)間的影響。食品微生物鑒定中，運(yùn)用MALDI－TOF－MS自動鑒定儀的方法優(yōu)于傳統(tǒng)方法，省時(shí)省力省成本。

通過分析在榴蓮凍肉中污染微生物的存活周期發(fā)現(xiàn)，一旦榴蓮凍肉被上述微生物污染，即使保存在－20℃，微生物仍然會存活較長時(shí)間。粘質(zhì)沙雷氏菌和陰溝腸桿菌在－20℃低溫的榴蓮凍肉內(nèi)存活時(shí)間為4個(gè)月和8個(gè)月；明串珠菌則時(shí)間更長，該榴蓮凍肉在低溫下保藏12個(gè)月后，仍檢出高濃度的明串珠菌。在2℃～8℃下放置1 d至3 d，粘質(zhì)沙雷氏菌和陰溝腸桿菌仍存活，但未見生長繁殖，無明顯變化。而明串珠菌細(xì)菌濃度出現(xiàn)數(shù)量級上升。在榴蓮隨溫度恢復(fù)到室溫，存活能力強(qiáng)的污染菌特別是明串珠菌會迅速生長繁殖起來?？梢?，低溫保藏時(shí)引起榴蓮凍肉微生物持續(xù)繁殖的可能主要為明串珠菌。因此，榴蓮水果不宜冷藏，宜冷凍。試驗(yàn)結(jié)果與加拿大水果蔬菜農(nóng)場食品安全指南一致，在儲藏過程中，應(yīng)該將水果凍肉速凍以減少病原菌的生長[14]。

綜上所述，榴蓮水果凍肉污染的微生物用MALDI－TOF－MS鑒定，確定為粘質(zhì)沙雷氏菌、陰溝腸桿菌和明串珠菌屬。粘質(zhì)沙雷氏菌、陰溝腸桿菌為條件致病菌，明串珠菌對人雖無致病性，但一旦污染會影響水果風(fēng)味和營養(yǎng)。它們均來自大自然、水果和植物，試驗(yàn)研究結(jié)果給人們對榴蓮水果采摘、生產(chǎn)，保藏提供預(yù)防污染的理論依據(jù)。另外，分離出的粘質(zhì)沙雷氏菌是否為產(chǎn)紅色素的高產(chǎn)菌株和基因水平的特點(diǎn)，以及明串珠菌在乳制品食品防腐和醫(yī)藥行業(yè)具有重要工業(yè)價(jià)值，但工業(yè)用途方面仍然存在菌株差異[15]，其優(yōu)良特性以及抑菌性[16]有待進(jìn)一步研究。