HPLC法測(cè)定保健食品中抗壞血酸的組成及穩(wěn)定性

劉成浩，張蓉，鄔國(guó)慶，杜勇，楊玲，劉齊，韓蕭茜，張華珺

（北京市藥品檢驗(yàn)所，北京102200）

抗壞血酸有兩種同分異構(gòu)體，分別為L(zhǎng)（+）-抗壞血酸和D（+）-抗壞血酸。L（+）-抗壞血酸具有強(qiáng)還原性，對(duì)人體具有生物活性，可以防治壞血病，并且在過敏性皮膚病、肝炎等疾病上也有治療作用。但L（+）-抗壞血酸不能在人體內(nèi)合成，需要從外界攝取，因此廣泛應(yīng)用于保健食品中。另外L（+）-抗壞血酸極不穩(wěn)定，遇空氣中氧、熱、堿等會(huì)被氧化成脫氫L（+）-抗壞血酸，被氧化后的L（+）-抗壞血酸在人體內(nèi)活性大大降低；D（+）-抗壞血酸又稱為異抗壞血酸，雖然抗氧化性強(qiáng)于L（+）-抗壞血酸，但是對(duì)人體基本無(wú)生物活性，攝入過多會(huì)引起尿酸結(jié)石、多尿、皮疹等[1-10]，因此，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的《營(yíng)養(yǎng)素補(bǔ)充劑原料目錄》（2016年第205號(hào)公告）中明確規(guī)定D（+）-抗壞血酸不能用于保健食品中。

目前測(cè)定抗壞血酸含量的方法中熒光法及滴定法應(yīng)用較廣泛，然而熒光法操作繁瑣，穩(wěn)定性較差；滴定法易受樣品顏色干擾，誤差較大[11-17]。并且上述方法只能測(cè)定樣品中天然存在或添加的抗壞血酸總量，無(wú)法分別出保健食品原料添加的是L（+）-抗壞血酸還是D（+）-抗壞血酸，由于國(guó)家規(guī)定 D（+）-抗壞血酸不能用于保健食品中，因此應(yīng)用上述方法均不能對(duì)保健食品市場(chǎng)進(jìn)行有效監(jiān)管，保健食品原料添加情況存在一定風(fēng)險(xiǎn)。2016年8月31日頒布實(shí)施的《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-食品中抗壞血酸的測(cè)定》（GB 5009.86-2016）[18]對(duì)于抗壞血酸含量測(cè)定新增了高效液相色譜法，此方法可以同時(shí)測(cè)定食品中抗壞血酸兩種同分異構(gòu)體L（+）-抗壞血酸和D（+）-抗壞血酸。但是，日常監(jiān)管檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)給出的實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)用于保健食品時(shí)不能很好的分離兩種同分異構(gòu)體并且操作步驟復(fù)雜，故本文探討了不同色譜條件下兩種同分異構(gòu)體的分離情況，對(duì)方法進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)采用資生堂CAPCELL PAK C18 TYPE-AQ耐水柱，以磷酸二氫鉀溶液-甲醇（98∶2）為流動(dòng)相，無(wú)需控制pH即可較好分離L（+）-抗壞血酸和D（+）-抗壞血酸并分別準(zhǔn)確測(cè)定其含量，方法簡(jiǎn)便重復(fù)性好。優(yōu)化后的方法可以很好地測(cè)定保健食品中抗壞血酸的含量并檢測(cè)保健食品廠家原料中是否違規(guī)添加D（+）-抗壞血酸，為日常監(jiān)管消除了風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)此方法還可分析保健食品中L（+）-抗壞血酸的穩(wěn)定性[19-22]，通過此方法考察保健食品不同劑型L（+）-抗壞血酸穩(wěn)定性可以為企業(yè)改進(jìn)生產(chǎn)方法作為參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（1260 Infinity）：Agilent；電子天平（XS205）：Mettle。

甲醇（色譜純）：德國(guó)默克。磷酸二氫鉀、L-半胱氨酸（均為優(yōu)級(jí)純）、磷酸、偏磷酸、磷酸三鈉（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)。十六烷基三甲基溴化銨（色譜純）：SIGMA公司。

L（+）-抗壞血酸對(duì)照品：（來(lái)源：Dr.Ehrenstorfer GmbH 純度：98.9%批號(hào)：103944）。D（+）-抗壞血酸對(duì)照品（來(lái)源：TRC 純度：98%批號(hào)：1-AGE-94-1）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

精密稱取 L（+）-抗壞血酸對(duì)照品 10 mg和 D（+）-抗壞血酸對(duì)照品10 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，用20 g/L偏磷酸溶液溶解并稀釋至刻度。精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液 0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mL 分別置于10 mL棕色容量瓶中，加20 g/L偏磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻備用。

1.2.2 供試品溶液的制備

在避光條件下，取本品20片研細(xì)混勻，精密稱取0.2 g，置于50 mL棕色容量瓶中，用20 g/L偏磷酸溶液溶解并定容，搖勻后過濾，棄去初濾液，從續(xù)濾液中精密吸取2.0 mL，置于50 mL棕色容量瓶中，用20 g/L偏磷酸溶液稀釋定容至刻度，混勻。0.45 μm微孔濾膜濾過，濾液上機(jī)測(cè)定L（+）－抗壞血酸和D（+）－抗壞血酸的含量。

1.2.3 供試品中脫氫抗壞血酸的還原

從1.2.2供試品溶液中精密吸取2.0 mL，置于50 mL離心管中，用20 g/L偏磷酸溶液補(bǔ)至20 mL，加入40 g/L的L－半胱氨酸溶液10 mL，用100 g/L磷酸三鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.1，以200次/min振蕩5 min。再用磷酸調(diào)節(jié)pH值至4.5，用水將試液全部轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，并定容至刻度，混勻。0.45 μm微孔濾膜濾過，濾液上機(jī)測(cè)定L（+）－抗壞血酸總量，其中包含抗壞血酸和脫氫抗壞血酸，并由此可推算出抗壞血酸氧化程度。

1.2.4 色譜條件

色譜柱：資生堂CAPCELL PAK C18 TYPE－AQ柱，柱長(zhǎng) 250 mm，內(nèi)徑 4.6 mm，粒徑 5 μm；流動(dòng)相：磷酸二氫鉀溶液（取13.600 g磷酸二氫鉀和1.821 g十六烷基三甲基溴化銨，加水溶解并定容至2 000 mL，用 0.45 μm 微孔濾膜濾過即得）－甲醇（98∶2）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為 245 nm；進(jìn)樣量 20 μL。理論板數(shù)應(yīng)大于2 000，各峰分離度應(yīng)大于2。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相條件的確定

2.1.1 色譜柱的選擇

本試驗(yàn)中選用3根不同的色譜柱，分別為資生堂CAPCELLPAKC18TYPE－AQ、安捷倫ZORBAXSB－Aq、德國(guó)MN C18柱，按1.2.4中色譜條件分別進(jìn)行試驗(yàn)，考察不同色譜柱對(duì)色譜分離的影響，其色譜圖見圖1。

圖1 對(duì)照品色譜圖Fig.1 Chromatogram of reference substance

結(jié)果表明資生堂CAPCELL PAK C18 TYPE－AQ色譜柱分離度較好，不同色譜柱的分離度見表1。

表1 色譜柱對(duì)色譜分離的影響Table 1 The influence of chromatogram by column

表1表明，資生堂CAPCELL PAK C18 TYPE－AQ色譜柱分離效果最好（色譜圖見圖1），因此采用資生堂CAPCELL PAK C18 TYPE－AQ為本實(shí)驗(yàn)色譜柱。

2.1.2 流動(dòng)相的pH值對(duì)色譜分離的影響

以磷酸二氫鉀溶液－甲醇（98∶2）為流動(dòng)相，改變其pH值，考察pH值對(duì)L（+）－抗壞血酸和D（+）－抗壞血酸色譜行為的影響。結(jié)果見表2。

表2 pH對(duì)色譜分離的影響Table 2 The influence of chromatogram by pH

表2表明，流動(dòng)相pH值為4.0、4.5、5.0時(shí)分離度均滿足要求，且當(dāng)流動(dòng)相按上述方法配制后pH值為4.5，在不改變pH值的條件下即可很好的分開抗壞血酸兩種同分異構(gòu)體。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系

取 1.2.1 中 L（+）－抗壞血酸和 D（+）－抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在1.2.4色譜條件下用高效液相色譜儀測(cè)定，記錄色譜圖，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理得線性回歸方程L（+）－抗壞血酸：A=45.09 C－83.71，相關(guān)系數(shù) r=0.999 7；D（+）－抗壞血酸：A=43.26C－64.30，相關(guān)系數(shù) r=0.999 9。表明兩種抗壞血酸同分異構(gòu)體在2 μg/mL～100 μg/mL濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度均呈良好的線性關(guān)系。

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線中第3點(diǎn)（10 μg/mL濃度）重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，計(jì)算RSD值為L(zhǎng)（+）－抗壞血酸：1.1%；D（+）－抗壞血酸 1.5%。

表3 精密度測(cè)定結(jié)果Table 3 The results of precision

2.2.3 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

取已知含量的供試品（含量為L(zhǎng)（+）-抗壞血酸：2.69×104mg/100 g；D（+）-抗壞血酸：0 mg/100 g；按1.2.3測(cè)定 L（+）-抗壞血酸總量為 2.79×104mg/100 g）研細(xì)混勻后，精密稱取 0.100 3、0.101 7、0.100 8 g，分別置于50 mL棕色容量瓶中，精密稱取L（+）-抗壞血酸和D（+）-抗壞血酸對(duì)照品各30 mg，置于上述50 mL棕色容量瓶中，用20 g/L偏磷酸溶液溶解并定容，搖勻后過濾，棄去初濾液，從續(xù)濾液中精密吸取2.0 mL，置于50 mL棕色容量瓶中，用20 g/L偏磷酸溶液稀釋定容至刻度，混勻。0.45 μm微孔濾膜濾過，濾液上機(jī)測(cè)定L（+）-抗壞血酸和D（+）-抗壞血酸的加標(biāo)回收率。

從上述續(xù)濾液中精密吸取2.0 mL，置于50 mL離心管中，用20 g/L偏磷酸溶液補(bǔ)至20 mL，加入40 g/L的L-半胱氨酸溶液10 mL，用100 g/L磷酸三鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.1，以200次/min振蕩5 min。再用磷酸調(diào)節(jié)pH至4.5，用水將試液全部轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，并定容至刻度，混勻。0.45 μm微孔濾膜濾過，濾液上機(jī)測(cè)定L（+）-抗壞血酸總量的加標(biāo)回收率。加標(biāo)回收率結(jié)果見表4。

表4 回收率結(jié)果Table 4 The results of recoveries

2.3 市售保健食品中抗壞血酸的分析研究

2.3.1 對(duì)于市售保健食品中抗壞血酸組成的分析

由于保健食品營(yíng)養(yǎng)素補(bǔ)充劑原料中不包括D（+）-抗壞血酸，因此隨機(jī)抽取市售保健食品中銷量較大的30個(gè)廠家的品種，在本文條件下進(jìn)行試驗(yàn)，考察其中抗壞血酸成分的組成，發(fā)現(xiàn)均未檢出D（+）-抗壞血酸，因此可認(rèn)為這30批次樣品均為合格產(chǎn)品。

2.3.2 保健食品中L（+）-抗壞血酸穩(wěn)定性的分析

隨機(jī)抽取市售保健食品不同劑型的10批次產(chǎn)品進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，在溫度為25℃，相對(duì)濕度為50%的條件下放置12個(gè)月，分別在3、6、9、12個(gè)月時(shí)取樣測(cè)定其L（+）-抗壞血酸的含量，取0月的樣品進(jìn)行1.2.3中供試品還原的操作，測(cè)定L（+）-抗壞血酸總量，以此比較出保健食品中抗壞血酸的氧化程度。結(jié)果見表5。

表5表明，大部分儲(chǔ)存 3、6、9、12月后的產(chǎn)品L（+）-抗壞血酸氧化程度較小，而軟膠囊和口服液中抗壞血酸含量隨時(shí)間延長(zhǎng)含量有所降低，氧化程度均接近40%，由此推測(cè)在適宜的儲(chǔ)存環(huán)境下固體產(chǎn)品穩(wěn)定性較好，液態(tài)產(chǎn)品穩(wěn)定性稍差。

表5 L（+）-抗壞血酸穩(wěn)定性的分析Table 5 The analysis of stability

3 結(jié)論與討論

1）本試驗(yàn)通過考察不同pH值對(duì)測(cè)定結(jié)果以及L（+）－抗壞血酸和D（+）－抗壞血酸分離度的影響，發(fā)現(xiàn)國(guó)標(biāo)中給出的pH2.5～2.8條件下分離度不能滿足R≥1.5，而按照本文1.2.4中條件配制流動(dòng)相時(shí)，其pH值為4.5不需要再進(jìn)行調(diào)節(jié)pH值的步驟即可滿足分離度R≥1.5，簡(jiǎn)化了國(guó)標(biāo)方法的同時(shí)優(yōu)化了試驗(yàn)條件。

2）本試驗(yàn)中考察了3根不同的色譜柱，分別為資生堂CAPCELL PAK C18 TYPE－AQ、安捷倫ZORBAX SB－Aq、德國(guó)MN C18柱。結(jié)果表明資生堂CAPCELL PAK C18 TYPE－AQ柱耐水性較好，分離效果最好，故采用此色譜柱作為本試驗(yàn)的色譜柱。

3）由于抗壞血酸極易氧化，所以試驗(yàn)中用水均為新沸晾涼后的水，并且在避光條件下進(jìn)行試驗(yàn)，以減少抗壞血酸氧化對(duì)結(jié)果的影響。通過本試驗(yàn)方法可以對(duì)保健食品中抗壞血酸的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，采用1.2.3中方法將樣品進(jìn)行還原測(cè)定其L（+）－抗壞血酸總量，與直接測(cè)定的L（+）－抗壞血酸含量進(jìn)行比較從而判斷產(chǎn)品中抗壞血酸的被氧化程度。研究中發(fā)現(xiàn)目前大部分保健食品在正常儲(chǔ)存環(huán)境下抗壞血酸較穩(wěn)定，個(gè)別產(chǎn)品中L（+）－抗壞血酸被氧化程度較高，其中液態(tài)產(chǎn)品穩(wěn)定性較固態(tài)產(chǎn)品差，可能由于產(chǎn)品包裝透光性較強(qiáng)，密封不嚴(yán)以及液態(tài)環(huán)境下更有利于抗壞血酸分解所致，因此建議廠家可改用片劑或泡騰片等劑型。

4）目前，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中抗壞血酸的含量測(cè)定有滴定法，熒光法及HPLC法3種，熒光法操作繁瑣，穩(wěn)定性較差；滴定法易受樣品顏色干擾，誤差較大；新增的HPLC法相較于前兩種方法優(yōu)勢(shì)在于穩(wěn)定性好重復(fù)性高，并且可以分離 L（+）－抗壞血酸和D（+）－抗壞血酸兩種異構(gòu)體，由此可應(yīng)用于保健食品中抗壞血酸組成的測(cè)定，從而監(jiān)督保健食品廠家是否添加了營(yíng)養(yǎng)素補(bǔ)充劑原料中不允許添加的D（+）－抗壞血酸。與此同時(shí)，此方法還可以測(cè)得L（+）－抗壞血酸被氧化程度，而被氧化的L（+）－抗壞血酸對(duì)人體活性較小，可以利用此方法研究L（+）－抗壞血酸在保健食品的不同制備及存儲(chǔ)條件下的穩(wěn)定性從而選擇最優(yōu)方案，使產(chǎn)品質(zhì)量控制得到更好的提升。