沙雷氏菌PFMP-5發(fā)酵條件的優(yōu)化

丁 磊，徐玉梅，王建明

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

沙雷氏菌PFMP-5發(fā)酵條件的優(yōu)化

丁 磊，徐玉梅，王建明

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

利用生防菌防治溫室大棚根結(jié)線蟲已逐漸成為當(dāng)前保護(hù)地栽培蔬菜病害防控治理的一種新方法。試驗(yàn)主要對(duì)山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離得到的對(duì)根結(jié)線蟲有明顯防效的生防細(xì)菌菌株P(guān)FMP-5的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為蛋白胨，最適合菌株的發(fā)酵時(shí)間為30 h，最佳pH值為7，最佳發(fā)酵溫度為28℃，最佳接種量為5%，最佳裝液量為150 mL，最佳轉(zhuǎn)速為180 r/min，最佳NaCl濃度為6%。

根結(jié)線蟲；沙雷氏菌；發(fā)酵條件優(yōu)化；PFMP-5

黏性沙雷氏菌（Serratia marcescens），又稱靈桿菌（Bacilus prodigiosus），革蘭氏陰性兼性厭氧桿菌，屬腸道菌科沙雷氏菌屬，菌體較小，周生鞭毛或極生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)[1-3]。菌株呈球形，有莢膜，菌落較整齊，在28℃下培養(yǎng)有紅色色素產(chǎn)生，菌落有黏性，呈中心顆粒狀且有惡臭氣味，廣泛存在于水、土壤和食品中[4-5]。

從1990開(kāi)始逐漸有研究人員發(fā)現(xiàn)，黏質(zhì)沙雷氏菌可使煙草、黃瓜等植物產(chǎn)生抗病性和抵抗多種病原物[6]。PRESS等[7]研究發(fā)現(xiàn)，黏質(zhì)沙雷氏菌可誘導(dǎo)煙草、黃瓜等植物產(chǎn)生抗性和抵抗多種病原物的侵襲。黏質(zhì)沙雷氏菌次生代謝物靈菌紅素可破壞TMV病毒粒體，使其失去侵染能力[8]。齊放軍等[9]和楊瓊等[10-11]分別報(bào)道了從罹病甜菜夜蛾蟲體上分離到黏質(zhì)沙雷氏菌致病菌株QL01，QL09和B30，對(duì)甜菜夜蛾幼蟲有致死作用。鄧彩萍等[12-13]從光肩星天牛（Anoplophora glabripennis（Motschulsky））刻槽中分離的黏質(zhì)沙雷氏菌BH-1對(duì)光肩星天牛低齡幼蟲（濃度為7.8×1010cfu/mL）的致死率可達(dá)80.6%。金虹等[14]報(bào)道了黏質(zhì)沙雷氏菌對(duì)寬須蟻蝗（Myrmeleotettix palpalis（Zubovsky））若蟲的毒殺作用。黏質(zhì)沙雷氏菌菌株SRM和EML-SE1分別對(duì)棉鈴蟲（Helicoverpa armigera Hübner） 和小菜蛾（Plutella xylostella L.）幼蟲有較高的致病力[15-16]。黏質(zhì)沙雷氏菌PS-1是首次從罹病黃曲條跳甲（Phyllotreta striolata（Fabricius））幼蟲體分離篩選的、對(duì)黃曲條跳甲有很高致病性的菌株[17]。

郭堅(jiān)華等[18]研究表明，在溫室和田間小區(qū)試驗(yàn)中，沙雷氏菌對(duì)辣椒青枯病都有一定的防治效果。陶科等[19]研究證明，沙雷氏菌HR-3是蝗蟲的致病菌。山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)根結(jié)線蟲課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，一株生防細(xì)菌PFMP-5對(duì)根結(jié)線蟲有很好的毒殺作用。

本研究主要對(duì)PFMP-5菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為該菌后期的大規(guī)模生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 培養(yǎng)基的制備

蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，蔗糖10 g，水1 000 mL，將制成的液體發(fā)酵培養(yǎng)基分別裝入三角瓶中（150 mL/瓶），然后將培養(yǎng)基放入高壓滅菌鍋115℃滅菌30 min。

1.2 單一因素試驗(yàn)

發(fā)酵條件的優(yōu)化主要采用單一因素試驗(yàn)分析，主要優(yōu)化指標(biāo)及其設(shè)計(jì)包括：碳源（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖及淀粉），氮源（硝酸鉀、硫酸銨、谷氨酸、蛋白胨、硝酸銨），pH值（4，5，6，7，8，9），溫度（26，28，30，32，34℃），接種量（1%，3%，5%，7%，9%），培養(yǎng)時(shí)間（6，12，24，30，36，48 h），裝液量（90，110，130，150，170 mL），轉(zhuǎn)速（0，60，120，180，240 r/min），NaCl濃度（4%，6%，8%，10%，12%），在30℃的條件下恒溫培養(yǎng)24 h，定期用分光光度法測(cè)定其OD600吸光值，每處理重復(fù)3次，以確定各個(gè)因素的最佳值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對(duì)沙雷氏菌PFMP-5生長(zhǎng)的影響

從圖1可以看出，沙雷氏菌PFMP-5對(duì)5種碳源均有不同程度的利用，其中對(duì)乳糖的利用率最低，OD600值僅為0.74。對(duì)麥芽糖、葡萄糖的利用率相差略微，對(duì)蔗糖的利用率最高，其OD600值達(dá)到了1.35。因此，最佳碳源為蔗糖。

2.2 不同氮源對(duì)沙雷氏菌PFMP-5生長(zhǎng)的影響

從圖2可以看出，對(duì)沙雷氏菌PFMP-5的生長(zhǎng)抑制性最強(qiáng)的是硝酸銨，其OD600值僅有0.91。硝酸鉀、硫酸銨和谷氨酸對(duì)菌株的生長(zhǎng)影響較小，OD600值分別為2.40，2.04和3.06，蛋白胨對(duì)沙雷氏菌PFMP-5的生長(zhǎng)最有益，經(jīng)檢測(cè)其OD600值為3.54。因此，最佳氮源為蛋白胨。

2.3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)沙雷氏菌PFMP-5生長(zhǎng)的影響

從圖3可以看出，沙雷氏菌PFMP-5在培養(yǎng)6～12 h時(shí)處于其生長(zhǎng)的調(diào)整期，12～30 h屬于生長(zhǎng)繁殖的對(duì)數(shù)期，菌量增長(zhǎng)速度很快。培養(yǎng)30 h后，沙雷氏菌PFMP-5開(kāi)始生長(zhǎng)緩慢。表明最適合菌種的發(fā)酵時(shí)間為30 h。

2.4 不同pH值對(duì)沙雷氏菌PFMP-5生長(zhǎng)的影響

由圖4可知，pH值的變化對(duì)沙雷氏菌PFMP-5的生長(zhǎng)影響非常明顯，以pH值7為最高點(diǎn)，兩邊呈下降趨勢(shì)，強(qiáng)酸和強(qiáng)堿的環(huán)境都會(huì)抑制沙雷氏菌PFMP-5的發(fā)酵。當(dāng)pH值為7時(shí)，OD600值最高，可達(dá)3.93。因此，該菌株培養(yǎng)的最佳pH值為7。

2.5 不同發(fā)酵溫度對(duì)沙雷氏菌PFMP-5生長(zhǎng)的影響

從圖5可以看出，培養(yǎng)溫度對(duì)沙雷氏菌PFMP-5的生長(zhǎng)繁殖有明顯的影響。28℃作為一個(gè)最高點(diǎn)，之后隨著溫度的升高，OD600值在下降，當(dāng)溫度達(dá)到34℃時(shí)，OD600值最低，僅為0.22。同樣，溫度低于28℃也不利于該菌的生長(zhǎng)。在28℃時(shí)該菌生長(zhǎng)最快，OD600值為0.50。因此，該菌株的最佳發(fā)酵溫度為28℃。

2.6 不同接種量對(duì)沙雷氏菌PFMP-5生長(zhǎng)的影響

由圖6可知，接種量對(duì)PFMP-5的生長(zhǎng)狀況影響較大。其中，接種量1%，3%，5%，7%，9%的OD600值依次為1.15，1.68，2.30，1.66，1.53，因此，5%為最佳接種量。

2.7 不同裝液量對(duì)沙雷氏菌PFMP-5生長(zhǎng)的影響

由圖7可知，裝液量的多少對(duì)沙雷氏菌PFMP-5的生長(zhǎng)狀況影響不大。OD600值在150 mL時(shí)最高，裝液量增加至170 mL時(shí)，OD600值降低，為2.35，裝液量下降至130，110，90 mL時(shí)，OD600值也隨之降低，分別為2.38，2.22，1.08，因此，發(fā)酵最佳裝液量為150 mL。

2.8 不同轉(zhuǎn)速對(duì)沙雷氏菌PFMP-5生長(zhǎng)的影響

由圖8可知，轉(zhuǎn)速對(duì)沙雷氏菌PFMP-5的生長(zhǎng)有明顯影響，當(dāng)轉(zhuǎn)速為0，60 r/min時(shí)，該菌數(shù)量處于低水平，其OD600值分別為0.63和0.72。逐漸增加轉(zhuǎn)速值至120，180 r/min時(shí)，沙雷氏菌PFMP-5增長(zhǎng)加快，其OD600值分別為1.36和2.21，而轉(zhuǎn)速值增至240 r/min時(shí)，沙雷氏菌PFMP-5數(shù)量開(kāi)始下降，OD600值為1.68，因此，發(fā)酵培養(yǎng)的最佳轉(zhuǎn)速為180 r/min。

2.9 不同NaCl濃度對(duì)沙雷氏PFMP-5生長(zhǎng)的影響

由圖9可知，NaCl濃度對(duì)沙雷氏菌PFMP-5的生長(zhǎng)影響明顯。當(dāng)NaCl濃度為6%時(shí)，OD600值最高，達(dá)到2.08。調(diào)低NaCl濃度至4%時(shí)，OD600值降至1.45。而當(dāng)NaCl濃度高于6%時(shí)，OD600值降至1.0左右。所以，最適NaCl濃度為6%，此時(shí)對(duì)沙雷氏菌PFMP-5的生長(zhǎng)繁殖最有利。

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)沙雷氏菌PFMP-5菌株的發(fā)酵時(shí)間、接種量、裝液量、NaCl濃度、pH值、發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速、碳源及氮源等發(fā)酵條件篩選試驗(yàn)，篩選出該菌的最優(yōu)發(fā)酵條件為：最佳碳源是蔗糖，最佳氮源是蛋白胨，最適合菌株的發(fā)酵時(shí)間為30 h，最佳pH值是7，最佳發(fā)酵溫度為28℃，最佳接種量為5%，最佳裝液量為150 mL，最佳轉(zhuǎn)速為180 r/min，最佳NaCl濃度為6%。

此外，沙雷氏菌在醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境保護(hù)、紡織染料方面具有廣闊的應(yīng)用前景和巨大研發(fā)價(jià)值，尤其是沙雷氏菌的次生代謝產(chǎn)物靈菌紅素，已發(fā)現(xiàn)具有多種生物活性作用，能抗癌、抗微生物、抗瘧疾、抗霉、免疫抑制的作用[20-21]。尤其在抗癌方面，因其具有癌組織的高針對(duì)性和對(duì)正常細(xì)胞則表現(xiàn)的低毒害作用，是一種非常有潛力的抗癌物質(zhì)[22]。但是有關(guān)沙雷氏菌防治植物病害的報(bào)道仍然較少，本研究將沙雷氏菌初步應(yīng)用于根結(jié)線蟲的室內(nèi)防治中，但是要將其應(yīng)用到根結(jié)線蟲的生產(chǎn)防治中還需要進(jìn)一步的探索和實(shí)踐。

［1］曹毅.受根結(jié)線蟲侵染的煙草根際細(xì)菌群落特征及南方根結(jié)線蟲伴生細(xì)菌多樣性研究[D].昆明：云南大學(xué)，2015.

［2］劉郵洲，羅楚平，劉永鋒，等.黏質(zhì)沙雷氏菌C8-8幾丁質(zhì)酶基因的克隆與表達(dá)[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，28（3）：487-491.

［3］鄧丹丹.靈桿菌非特異性核酸酶的固定化及酶學(xué)特性研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2013.

［4］黃文芳.黏質(zhì)沙雷氏菌（Serrtia marcescens）的研究I：黏質(zhì)沙雷氏菌9-2菌株分離、分類鑒定和形態(tài)特征[J].華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2003（3）：108-111.

［5］黃文芳，諸瑜.黏質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）研究：營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)和不同色光對(duì)黏質(zhì)沙雷氏菌生長(zhǎng)的影響[J].華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005（1）：86-89.

［6］易圖永，謝丙炎，張寶璽，等.辣椒疫病的發(fā)生、危害及其防治研究進(jìn)展[J].中國(guó)辣椒，2002（2）：10-13.

［7］PRESS C M，WILSON M，TUZUN S，et al.Salicylic acid produced by Serratia marcescens 902166 is not the primary determinant of induced systemic resistance in cucumber or tobacco[J].Mol Plant Microbe Interact，1997，10：761-768.

［8］畢建華，楊金廣，歐陽(yáng)明安，等.黏質(zhì)沙雷氏菌次生代謝物對(duì)TMV的抑制機(jī)理[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（5）：912-922.

［9］齊放軍，劉纓，季志英.一種新的甜菜夜蛾致病菌的分離和鑒定[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2004，31（2）：223-224.

［10］楊瓊，周宇，韓光杰，等.兩種甜菜夜蛾致病菌的分離、鑒定及殺蟲成分初步分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，28（6）：1267-1271.

［11］BULLA L A，JR RHODES R A，JULIAN G S.Bacteria as insect pathogens[J].Annual ReviewofMicrobiology，1975，29：163-190.

［12］鄧彩萍，閏喜中，劉紅霞，等.光肩星天牛刻槽中一種細(xì)菌及其對(duì)天牛幼蟲的致病性[J].中國(guó)生物防治，2008，24（3）：244-248.

［13］鄧彩萍，劉紅霞，閏喜中，等.罹病光肩星天牛幼蟲分離菌株16S r DNA系統(tǒng)發(fā)育分析 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（18）：7672-7673，7682.

［14］金虹，葛紹榮，陶勇，等.一株蝗蟲病原茵的鑒定及其毒力和病理研究[J].微生物學(xué)報(bào)，2005，45（2）：172-176.

［15］JEONGH U，MUN H Y，KEUN OH H，et al.Evaluation of insecticidal activity of a bacterial strain，Serratia sp.EML-SE1 against diamondback moth[J].The Journal of Microbiology，2010，48（4）：541-545.

［16］MOHANM，SELVAKUMAR G，SUSHIL S N.Entomopathogenicity of endophytic Serratia marcescens strain SRM against larvae of Helicoverpa armigera（Noctuidae:Lepidoptera）[J].World Journal ofMicrobiology and Biotechnology，2011，27：2545-2551.

［17］楊建云，紀(jì)春艷，凌冰，等.黃曲條跳甲幼蟲致病菌的鑒定及其對(duì)黃曲條跳甲的殺蟲活性研究 [J].中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2014，30（3）：434-440.

［18］郭堅(jiān)華，郭亞輝，張立新，等.辣椒青枯病拮抗菌株的篩選及田間防效測(cè)定[J].中國(guó)生物防治，2001，17（3）：101-106.

［19］陳秀為，范寰，陳融，等.黏質(zhì)沙雷氏菌對(duì)棉鈴蟲、菜青蟲致病力及田間控制的研究初報(bào) [J].天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，8（3）：28-30.

［20］WILLIAMSON N R，F(xiàn)INERAN P C，GRISTWOOD T，et al.Anticancer and immunosuppressive properties of bacterial prodiginines [J].Future Microbiology，2007，2（6）：605-618.

［21］FENDER J E，BENDER C M.Serratia marcescens quinoprotein glucose dehydrogenase activity mediates medium acidification and inhibition of prodigiosin production by glucose[J].Applied and Environmental Microbiology，2012，78（17）：6225-6235.

［22］李洪波，杜巍，趙凱，等.靈菌紅素研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊，2011，22（1）：139-142.

Optimization of Ferment Conditions of Serratia marcescens PFMP-5

DINGLei，XUYumei，WANGJianming

（College ofAgronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

Biocontrol of root-knot nematodes（Meloidogyne）by bacteria has become a new method of vegetable disease management in greenhouse.A bacterial strain PFMP-5 isolated with high preventive and therapeutic effect to root-knot nematodes.In this paper,the optimum composition ofculture medium and cultivation parameters of strain PFMP-5 was studied.The result showed that the optimum condition were as following:the optimal carbon source was sucrose,the optimal nitrogen source was peptone,the optimal ferment time was 30 hours,the best pH was 7,the optimal ferment temperature was 28℃,the proportion of inoculum was 5%,the ideal volume was 150 mL,the rotation speed was 180 r/min and the best NaCl concentration was 6%.

root-knot nematodes;Serratia marcescens;optimization offerment conditions;PFMP-5

Q93-335；S476

A

1002-2481（2017）03-0386-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.03.16

2016-10-26

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（20120311019-3）；山西省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（201601D202072）

丁 磊（1991-），男，山西隰縣人，在讀碩士，研究方向：線蟲分類及綜合治理。王建明為通信作者。