分心木黃酮超聲-微波協(xié)同提取及抗氧化性研究

（衡水學院 生命科學系，河北衡水053000）

核桃分心木簡稱分心木又名核桃隔膜，為胡桃科（Juglandaceae）胡桃屬（Juglans L.）植物核桃的帶骨質內果皮的種隔[1-2]。半圓形片狀，表面呈棕色或淺棕色，略帶光澤，具有補腎澀精、治療多汗、尿頻、遺尿、口腔潰瘍、牙齦出血等多重功效[2]。相關研究表明[3-7]，核桃分心木中含有多糖、黃酮、生物堿、有機酸、甾類等多種化學成分，其中黃酮類物質含量較高。黃酮類物質有很多藥理作用，如：抗氧化、抗腫瘤活性、抗病毒、免疫調節(jié)、抗心腦血管病等功效[8-11]，在食品、保健品、醫(yī)藥等方面應用十分普遍。

分心木數(shù)量廣泛，且安全無毒。以前經常被人們當做垃圾丟棄，或當作燃料使用，這既浪費了資源，也污染了環(huán)境。為開發(fā)分心木資源，本試驗采用超聲-微波協(xié)同提取法對核桃分心木中黃酮類物質進行提取。超聲波能通過機械效應引起組織細胞內物質運動，并有利于物質穿透細胞膜釋放出來；同時超聲波的熱效應也能夠減少提取時間。微波輻射可以使物質的極性分子急速振動，進而由內而外充分產生熱量[12-13]。超聲微波協(xié)同提取操作簡單、速度快、提取物結構未被破壞、提取率高，有著突出的優(yōu)勢。本研究通過對分心木中的黃酮成分進行提取并研究其體外抗氧化活性[14-15]，從而為探索分心木黃酮藥物及功能性食品開發(fā)奠定了基礎，并為分心木的綜合利用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

核桃分心木：河北養(yǎng)元智匯飲品股份有限公司。

蘆丁標準品：國家生物制品檢定所；乙醇、Al（NO3）3、NaNO2、NaOH、VC、石油醚、乙酸乙酯、鐵氰化鉀、磷酸鹽緩沖液、三氯乙酸、三氯化鐵、DPPH、Tris-HCL、鄰苯三酚、HCl、鄰二氮菲、PBS、FeSO4、H2O2均為分析純試劑：衡水瑞豐化玻儀器有限公司。

1.2 儀器與設備

XH-300A型微波超聲波組合合成/萃取儀：北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；TU-1901紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；JA5003N電子分析天平：上海精密科學儀器有限公司；F123602微量可調單道移液器：上海艾研生物科技有限公司；RE-52CS旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；KDC-12離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分心木黃酮提取工藝流程

分心木→清洗→烘干→粉碎→過篩→超聲-微波協(xié)同提取→過濾→濾液濃縮→純化（石油醚洗滌，乙酸乙酯萃取）→凍干→分心木黃酮

1.3.2 標準曲線的繪制

精確稱取蘆丁標準品10.0 mg，用30%的乙醇溶液定容于100 mL容量瓶，搖勻后作為標準溶液備用。準確移取蘆丁標準品溶液 0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于7個10 mL容量瓶中，按1.3.3的方法在510 nm測定黃酮的吸光度。以吸光度值（A）為縱坐標，蘆丁溶液濃度（C）為橫坐標，繪制蘆丁溶液的標準曲線。

1.3.3 黃酮含量的測定方法

采用NaNO2-Al（NO3）3顯色法，樣品溶液加入質量濃度5%NaNO20.3 mL，混勻靜置6 min，加入質量濃度10%Al（NO3）30.3 mL，靜置6 min，加入質量濃度4%NaOH溶液4 mL，用體積分數(shù)30%乙醇定容，靜置15 min后，在510 nm測定黃酮的吸光度。根據(jù)標準曲線計算黃酮含量。

1.3.4 分心木黃酮提取工藝優(yōu)化試驗

1.3.4.1 單因素試驗

1）乙醇濃度對分心木黃酮得率的影響

準確稱取1.00g分心木樣品，分別加體積分數(shù)30%、40%、50%、60%、70%的乙醇25 mL，設置超聲功率250 W、微波功率250 W、溫度60℃進行提取10 min。

2）料液比對分心木黃酮得率的影響

準確稱取1.00g分心木樣品，依次按照料液比1∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35（g/mL）的順序加入 50%乙醇后，設置超聲功率250 W、微波功率250 W、溫度60℃進行提取10 min。

3）超聲功率對分心木黃酮得率的影響

準確稱取1.00 g分心木樣品，按照料液比1∶25（g/mL）加入50%乙醇，依次設置超聲功率為150、200、250、300、350 W，微波功率250 W、溫度60℃進行提取10 min。

4）微波功率對分心木黃酮得率的影響

準確稱取1.00 g分心木樣品，按照料液比1∶25（g/mL）加入50%乙醇，超聲功率250W，依次設置微波功率為 50、100、150、200、250 W，60 ℃下進行提取10 min。

5）提取溫度對分心木黃酮得率的影響

準確稱取1.00 g分心木樣品，按照料液比1∶25（g/mL）加入50%乙醇，超聲功率250 W，微波功率為150 W，分別在 40、45、50、55、60 ℃提取 10 min。

6）提取時間對分心木黃酮得率的影響

準確稱取1.00 g分心木樣品，按照料液比1∶25（g/mL）加入50%乙醇，超聲功率250 W，微波功率為150 W，溫度 50 ℃條件下分別提取 6、8、10、12、14 min。

1.3.4.2 黃酮得率的計算方法

式中：C為提取液中分心木黃酮的含量，g/mL；V為提取液體積，mL；M為分心木質量，g。

1.3.4.3 響應面分析

采用Design Expert 8.0.6軟件設計響應面試驗。根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，從單因素試驗中選取對提取結果影響比較大的4個因素：料液比、超聲功率、提取溫度、提取時間為自變量，黃酮得率為響應值，共計29個試驗點進行組合試驗[16-20]。因素與水平見表1。

表1 因素與水平表Table 1 Response surface experimental factors and levels

1.3.5 分心木黃酮體外抗氧化活性試驗

1.3.5.1 分心木黃酮對·OH的清除作用

試管中加入1 mL0.75 mol/L鄰二氮菲，2 mL pH=7.45 PBS溶液、1 mL 蒸餾水、1 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液，1 mL 0.01%H2O2，充分混勻后于37℃下恒溫水浴1 h。536 nm處測定其吸光度Ap；用1 mL水代替H2O2，測定其吸光度Ab；用1 mL樣液代替1 mL水，測定其吸光度As[21]。以VC作對照。

1.3.5.2 分心木黃酮對DPPH·的清除作用

不同濃度的黃酮樣液與DPPH溶液等體積混合，30 min后用無水乙醇作參比，在517 nm處測定其吸光度A1，測定不同濃度的樣液與無水乙醇等體積混合液的吸光度A2；DPPH溶液與無水乙醇等體積混合液的吸光度A0，取3次平行試驗結果根據(jù)下列公式計算對DPPH·的清除率[21－22]。以 VC作對照。

1.3.5.3 分心木黃酮對O2－·的清除作用

取 5 mL 0.05 mol/L，pH=8.2的 Tris－HCL 緩沖液25℃水浴預熱20 min，分別加入1 mL樣液，0.5 mL 25 mmol/L的鄰苯三酚，混勻后25℃水浴準確反應4 min，立即加入2滴8 mol/L HCl終止反應。299 nm處測定吸光度A1，空白對照組的吸光度A0。將鄰苯三酚溶液用0.5 mL蒸餾水代替，得到吸光度A2。取3次平行試驗結果計算對超氧陰離子自由基的清除率。以VC作對照[23]。

1.3.5.4 總還原力的測定

1.0 mL樣液加入2.5 mL的1%鐵氰化鉀溶液和2.5 mL的0.22 mol/L磷酸鹽緩沖液，混合均勻后于50℃水浴中反應30 min，迅速冷卻加入10%三氯乙酸2.5 mL，在4 000 r/min下離心10 min。最后取2.5 mL上清液，加2.5 mL蒸餾水和2.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻后靜置10 min測定700 nm處的吸光度值[24]。以VC作對照。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的確立

按檢測方法，測出蘆丁標準品各濃度下的吸光度值，作出蘆丁標準曲線，結果見圖1。

圖1 蘆丁的標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

由標準曲線結果，得到其回歸方程：A=10.682C－0.0011，R2=0.999 9，蘆丁標準溶液在0.005 mg/mL～0.05 mg/mL的范圍中，呈良好的線性關系。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 乙醇濃度的確定

乙醇濃度對分心木黃酮得率的影響見圖2。

圖2 乙醇濃度對黃酮提取得率的影響Fig.2 Effect of different ethanol concentration on yield of flavonoid

由圖2可知，隨乙醇濃度的增加，黃酮的溶解度也隨之增加。在乙醇濃度50%的條件下，所提取的分心木中黃酮得率達到4.94%。乙醇濃度超過50%之后，黃酮得率下降。黃酮一般難溶或不溶于水，易溶于乙醇等有機溶劑。所以一開始隨乙醇濃度增大得率增高。但乙醇濃度過高時，樣品溶液沸點降低，且醇溶性雜質開始溶出，導致黃酮得率下降。由此可知，50%乙醇對黃酮的溶解性相對最好。

2.2.2 料液比的確定

料液比對分心木黃酮得率的影響見圖3。

由圖3可知，隨料液比的增多，黃酮的溶解度也隨之增加，即黃酮物質的得率增加。在料液比1∶25（g/mL）處，所提取的分心木中黃酮得率達4.98%。繼續(xù)增大料液比后，黃酮物質得率增加不明顯。且繼續(xù)增大溶劑量既浪費溶劑又不易回收，所以料液比1∶25（g/mL）為宜。

圖3 料液比對黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of different rate of solid to solution on yield of flavonoid

2.2.3 超聲功率的確定

超聲功率對分心木黃酮得率的影響見圖4。

圖4 超聲功率對黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of different ultrasonic power to solution on yield of flavonoid

由圖4可知，隨著超聲功率的增大，黃酮物質的得率也相應增加。在超聲波功率達到250 W時，所提取的分心木中黃酮得率為5.01%。繼續(xù)增大超聲功率，黃酮物質提取率有輕微的降低。可能由于超聲波功率的增大導致了黃酮的結構被破壞，所以超聲功率以250 W為宜。

2.2.4 微波功率的確定

試驗過程中發(fā)現(xiàn)，微波在本試驗中只起到快速升溫的作用，達到指定提取溫度后，微波功率會迅速下降至可維持預定溫度的功率，且數(shù)值非常小。提高微波功率有助于快速達到預定提取溫度，節(jié)省了時間；但是微波功率過高又會引起溫度升高過快導致超過預定溫度導致試驗出現(xiàn)誤差。最終確定最佳微波功率為150 W，在該功率下即能夠保證快速升至提取溫度又能夠維持預定溫度。

2.2.5 提取溫度的確定

溫度對分心木黃酮得率的影響見圖5。

分心木中黃酮物質的得率隨著溫度升高而增加，在50℃時，所提取的分心木中黃酮得率達5.09%。繼續(xù)升高提取溫度，黃酮物質提取率逐漸減小?？赡苁且驗闇囟冗^高會使黃酮類化合物的結構被破壞，也可能是由于溫度過高會溶出其它雜質，使得黃酮物質提取率降低。所以提取溫度以50℃為宜。

圖5 溫度對黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of different temperature on yield of flavonoid

2.2.6 提取時間的確定提取時間對分心木黃酮得率的影響見圖6。

圖6 時間對黃酮提取得率的影響Fig.6 Effect of different time on yield of flavonoid

由圖6可知，在6 min～8 min內分心木中黃酮物質的得率隨著時間的增加而增大，在8 min黃酮提取率達到最高值5.16%。時間繼續(xù)增加黃酮得率變化不大并有減少可能是因為時間太長，會使黃酮類化合物的結構遭到破壞，也可能是由于長時間提取會使分心木粉末溶出其它雜質，使得黃酮物質提取率降低。所以為了保證黃酮物質的提取率以及減小提取周期，以8 min為宜。

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 試驗結果

根據(jù)表1設定的水平和因素，共設29個試驗點，其中24個為析因點，5個為零點。得到各個試驗條件的黃酮得率，試驗結果見表2、表3。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface experimental design and result

續(xù)表2 響應面試驗設計及結果Continue table 2 Response surface experimental design and result

表3 回歸模型的方差分析Table 3 The analysis of varianceof regression model

由軟件分析得到回歸方程為：Y=5.13+0.032A+0.069B+0.17C+0.11D-0.015AB+0.060AC-0.038AD-0.040BC+0.027BD-0.040CD-0.17A2-0.13B2-0.25C2-0.19D2，其中Y為核桃分心木黃酮含量的預測值。該模型的預測復相關系數(shù)R2=0.917 1，矯正系數(shù)Adj R2=0.969 2，說明試驗的實際值和預測值擬合度比較好。

由表3可以看出，P<0.000 1，說明該模型極其顯著，在統(tǒng)計學上是有意義的。失擬項P=0.094 0>0.05，說明不顯著，即選擇的模型對該試驗的擬合度良好。A、B、C、D 4個因素所模擬的一次項都小于0.05，說明因變量和所選自變量之間的線性關系顯著，該回歸方程能代替試驗真實點分析試驗結果。模擬的二次項P都小于0.01，表明A、B、C、D 4個因素對分心木黃酮的提取率都達到極其顯著的水平，交互項AC、BC、CD的P值小于0.05，達到顯著水平，由此可知，料液比與提取溫度、超聲功率與提取溫度、提取溫度與提取時間這些因素之間都存在一定的交互作用，并且它們之間的交互作用會對分心木中的黃酮的提取率產生顯著的影響。

2.3.2 響應面交互作用分析

通過Design-Expert 8.0.6軟件，將AC、BC、CD交互進行分析比較，做出響應面曲線圖，見圖7。

圖7 各個因子交互作用的響應面圖Fig.7 The response surface of interaction between every two factors

由響應面三維圖7可知，當各因素在一定范圍內增大時，對應的響應值也增大；但當響應值達到最高點，各因素的值繼續(xù)增大時，其響應值卻不斷減小。等高線圖的中心點在3D圖上的投影即最高點，表明該點的提取率最高。圖7中每個響應曲面都開口向下，呈現(xiàn)凸面形狀。

2.3.3 優(yōu)化與驗證試驗

依據(jù)以上響應面試驗模型和結果分析，得出最佳提取條件下的分心木中黃酮的提取率為5.19%，料液比 1∶25.6（g/mL），超聲功率 261.8 W，提取溫度 51.6℃，提取時間8.5 min。在此最佳條件下，將平行驗證試驗重復進行3次，可得分心木黃酮的提取率的平均值5.17%。實際所測得的提取率的平均值和預測值減少0.016%，表明該模型的可靠性較高，并且提取工藝的重復性良好。

2.4 分心木中黃酮體外抗氧化活性

分心木中黃酮體外抗氧化活性見圖8。

圖8 分心木黃酮的還原力及·OH、O2-·、DPPH·清除率Fig.8 Reducing power and hydroxyl，superoxide anion and DPPH radical scavenging activities of Diaphragma juglandis fructus flavonoids

根據(jù)圖8能夠看出，分心木黃酮對·OH、O2-·、DPPH·均能夠起到清除作用，并且在試驗濃度范圍內，對自由基的清除能力呈現(xiàn)量效關系。當分心木黃酮濃度為2mg/mL時，對·OH和O2-·的最大清除率分別為66.2%、36.9%，而對DPPH·的清除率在濃度為0.07 mg/mL時即達到70.2%。在試驗的濃度范圍內，分心木黃酮和VC的還原力均隨著濃度的增大而增大，線性關系較好，其中2 mg/mL的分心木黃酮的還原能力與0.65 mg/mL的VC幾乎一致?？梢姺中哪军S酮體外抗氧化活性較好。

3 結論

本試驗采用響應面法優(yōu)化分心木黃酮的提取工藝條件，并對其體外抗氧化活性進行研究。最優(yōu)提取條件條件為：乙醇濃度50%，料液比1∶25.6（g/mL），超聲功率261.8 W，微波功率150 W，提取溫度51.6℃，提取時間8.5 min。分心木總黃酮得率為5.17%。分心木黃酮對·OH、O2-·、DPPH·均能夠起到清除作用，當分心木黃酮濃度為2 mg/mL時，對·OH和O2-·的最大清除率分別為66.2%、36.9%，而對DPPH·的清除率在濃度為0.07 mg/mL時即達到70.2%，并且其還原能力強，能夠說明其體外抗氧化活性較強。

采用超聲微波協(xié)同提取法提取分心木中的黃酮類物質產率高，方法簡單易行，提取率較好，產物具有較強的體外抗氧化活性。