厚樸中蛋白質(zhì)提取方法的優(yōu)化

翁德會(huì)，楊文婷，湯雅萍，范承濤，劉翠，程勛

（1.武漢華夏理工學(xué)院生物與制藥學(xué)院，湖北武漢430223；2.武漢工商學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，湖北武漢430065）

厚樸為木蘭科植物厚樸（Magnolia officinalis Rehd.et Wils.）或凹葉厚樸（Magnolia officinalis Rehd.et Wils.Var.biloba Rehd.et Wils.）的干燥干皮、根皮及枝皮，俗稱“紫油厚樸”。味苦、辛、性溫，歸脾、胃、肺、以及大腸經(jīng)，具有燥濕消痰，溫中下氣的功效，臨床主要用于濕滯傷中，腕痞吐瀉，腹脹便瀉，痰飲咳喘以及食積氣滯等[1]。其主要產(chǎn)地位于四川、浙江、廣西、湖北、湖南等地。在中成藥中，采用厚樸配方的多達(dá)200多種，不同產(chǎn)地厚樸其性狀和有效成分含量有一定區(qū)別?，F(xiàn)今對(duì)不同產(chǎn)地厚樸的鑒定研究多集中在DNA提前和分析、不同化學(xué)成分如木脂素、揮發(fā)油等含量分析方面，對(duì)蛋白質(zhì)提取分離及電泳指紋圖譜研究較少[2-3]。

蛋白質(zhì)電泳指紋圖譜的構(gòu)建前提是需從樣品中提取高質(zhì)量高含量的蛋白質(zhì)，故厚樸中的蛋白質(zhì)提取是其蛋白質(zhì)電泳指紋圖譜研究中重要的一環(huán)。本研究對(duì)厚樸中的蛋白質(zhì)進(jìn)行提取鑒定，取以靜置過(guò)夜、超聲清洗儀超聲提取、超聲破碎法3種不同的方法提取蛋白質(zhì)[4-5]，通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定其蛋白質(zhì)含量，繼而得到提取蛋白質(zhì)含量最高、效率最高的方法。再通過(guò)單因素試驗(yàn)以及正交試驗(yàn)得到厚樸蛋白質(zhì)提取方法的最佳條件，為利用聚丙烯酰胺凝膠電泳法進(jìn)行不同產(chǎn)地厚樸的鑒別鑒定提供研究基礎(chǔ)[6-7]。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

厚樸：湖北省恩施中藥材生產(chǎn)規(guī)范示范基地，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室張林碧教授鑒定為木蘭科植物厚樸的干燥樹(shù)皮、根皮和枝皮。

牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250：廈門(mén)星隆達(dá)化學(xué)試劑有限公司；磷酸、磷酸氫二鉀（分析純）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

DG120型粉碎機(jī)：浙江省瑞安市飛達(dá)藥材器械廠；JY91-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī)：湘麓離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)材料的預(yù)處理

將不同產(chǎn)地的厚樸于粉碎機(jī)中粉碎，過(guò)60目篩，收集粉末，裝于不同的自封袋中，放置于4℃中冷藏。

1.3.2 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取一定量的牛血清白蛋白粉末，配制成200 μg/mL的牛血清蛋白溶液，用移液管分別取5 mL考馬斯亮藍(lán)G250染液于試管中，分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL配制好的牛血清蛋白溶液，添加蒸餾水至溶液總體積6 mL。靜置5 min，在10 min內(nèi)測(cè)量吸光度，以蛋白質(zhì)濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制牛血清白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線[8]。

1.3.3 3種方法提取厚樸蛋白質(zhì)的比較

分別以冷浸法、超聲清洗儀提取法、冰浴超聲破碎法提取厚樸的蛋白質(zhì)。取厚樸樣品3份，每份1 g，分別加入緩沖液16 mL提取樣品中蛋白質(zhì)，冷浸法提取12 h，超聲清洗儀100 W提取30 min，在超聲破碎儀功率150 W、超聲間隔時(shí)間8 s的條件下處理樣品20 min。每種方法做3次平行試驗(yàn)，取浸提液0.1 mL采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)量吸光度，取平均值，以確定厚樸的蛋白質(zhì)提取的合適方法[9-11]。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

1.3.4.1 超聲破碎時(shí)間對(duì)厚樸提取液蛋白質(zhì)濃度的影響

控制超聲功率150 W，超聲破碎間隔8 s，取不同的超聲時(shí)間 10、20、30、40、50 min 提取蛋白質(zhì)，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得其浸提液中蛋白質(zhì)濃度。

1.3.4.2 超聲功率對(duì)厚樸提取液蛋白質(zhì)濃度的影響

控制超聲時(shí)間30 min，超聲破碎間隔8 s，取不同的超聲功率 100、150、200、250、300 W 提取蛋白質(zhì)，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得其浸提液中蛋白質(zhì)濃度。

1.3.4.3 超聲破碎間隔時(shí)間對(duì)厚樸提取液蛋白質(zhì)濃度的影響

控制超聲時(shí)間30 min，超聲功率150 W，取不同的超聲間隔時(shí)間12、10、8、6、4 s提取蛋白質(zhì)，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得其浸提液中蛋白質(zhì)濃度。

1.3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用超聲破碎時(shí)間（30、40、50 min），超聲功率（200、250、300 W），超聲破碎間隔時(shí)間（4、6、8 s）3個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè) 3個(gè)水平，采用三因素三水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9（33），見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2 結(jié)果分析與討論

2.1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)1.3.2中方法測(cè)定不同濃度下的牛血清蛋白溶液的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1。

圖1 牛血清白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of bovine serum albumin

如圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.004 9C+0.015 2，R2=0.997 2，表明在 0～200 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.2 3種方法提取厚樸蛋白質(zhì)的比較

3種不同蛋白質(zhì)提取方法的蛋白質(zhì)提取濃度見(jiàn)表2。

表2 3種不同蛋白質(zhì)提取方法的比較Table 2 Comparison of three different protein extraction methods

由表2可知，3種不同蛋白質(zhì)提取方式中，以超聲破碎法提取厚樸蛋白質(zhì)效果最佳，提取的蛋白質(zhì)濃度在3種提取蛋白質(zhì)的方法中最高，綜合考慮，確定超聲破碎法進(jìn)一步進(jìn)行提取條件的優(yōu)化。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 超聲破碎時(shí)間對(duì)厚樸提取液蛋白質(zhì)濃度的影響

在超聲功率150 W，超聲破碎間隔8 s的條件下，考察不同超聲破碎時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 超聲破碎時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取濃度的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on the protein extraction concentration

由圖2可知，蛋白質(zhì)溶解于提取液是一個(gè)緩慢的過(guò)程，超聲破碎時(shí)間從10 min～40 min，蛋白質(zhì)提取率升高，當(dāng)超聲破碎時(shí)間為30 min，厚樸蛋白的提取率達(dá)到最大為880.11 μg/mL，再隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)提取率呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，分析原因，可能是由于一定時(shí)間后，蛋白的溶出達(dá)到飽和，則溶出率趨于平衡，若再進(jìn)一步延長(zhǎng)浸提時(shí)間，可能是厚樸纖維素、淀粉等與蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合，使蛋白質(zhì)難以溶出，從而使提取率降低，且超聲破碎時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，樣品易受微生物污染，影響蛋白產(chǎn)品的質(zhì)量。因此選擇超聲破碎時(shí)間30 min為最佳條件。

2.3.2 超聲功率對(duì)厚樸提取液蛋白質(zhì)濃度的影響

在超聲時(shí)間30 min，超聲破碎間隔8 s條件下，超聲功率對(duì)厚樸蛋白提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 超聲破碎功率對(duì)蛋白質(zhì)提取濃度的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the protein extraction concentration

由圖3可知，當(dāng)超聲功率為250 W時(shí)，提取到的厚樸蛋白最高，為840.41 μg/mL。當(dāng)超聲功率小于250 W時(shí)，厚樸蛋白濃度隨功率增加而增加，說(shuō)明功率越高，蛋白質(zhì)的提取率越高，蛋白質(zhì)濃度也越高；而當(dāng)超聲功率大于250 W時(shí)，厚樸蛋白質(zhì)的濃度開(kāi)始降低，說(shuō)明功率過(guò)大雖然會(huì)增加細(xì)胞破碎率，但由于功率增大的同時(shí)對(duì)活性物質(zhì)的破壞力也有所增大，同時(shí)考慮到節(jié)約能源，因此超聲功率選擇250 W較為適宜。

2.3.3 超聲間隔時(shí)間對(duì)厚樸提取液蛋白質(zhì)濃度的影響

超聲間隔時(shí)間是超聲破碎過(guò)程中的重要因素之一，其直接影響細(xì)胞破碎率，而且不同時(shí)間間隔還會(huì)引起超聲破碎過(guò)程中熱效應(yīng)和空化效應(yīng)的改變，影響蛋白質(zhì)的活性，控制超聲時(shí)間30 min，超聲功率250 W條件下，超聲間隔時(shí)間分別以4、6、8、10、12 s進(jìn)行超聲細(xì)胞破碎，見(jiàn)圖4。

圖4 超聲間隔時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取濃度的影響Fig.4 Effect of ultrasonic interval time on the protein extraction concentration

由圖4可知，在一定范圍內(nèi)，隨著超聲破碎間隔時(shí)間的增大，厚樸蛋白質(zhì)濃度逐步減小，在超聲破碎間隔時(shí)間為4 s時(shí)，厚樸蛋白質(zhì)濃度最高，為862.86 μg/mL，之后蛋白質(zhì)濃度呈下降趨勢(shì)。在超聲破碎間隔時(shí)間為4、6、8 s時(shí)，蛋白質(zhì)濃度下降不明顯，而在8 s到10 s蛋白質(zhì)濃度影響較大，可能是因?yàn)槌暺扑闀r(shí)間間隔過(guò)長(zhǎng)會(huì)影響其破壁效果，使蛋白質(zhì)無(wú)法充分溶出?？紤]到超聲破碎時(shí)間間隔過(guò)短會(huì)影響到儀器的使用壽命，因此，選擇超聲破碎間隔時(shí)間6 s進(jìn)行超聲破碎。

2.4 正交試驗(yàn)

2.4.1 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

正交試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 3 Orthogonal test scheme and results

由表3可以看出，超聲破碎提取厚樸蛋白質(zhì)正交試驗(yàn)結(jié)果中，極差的高低順序?yàn)椋浩扑闀r(shí)間>間隔時(shí)間>超聲功率，即超聲破碎時(shí)間對(duì)提取厚樸蛋白質(zhì)的影響最大，其次是超聲破碎間隔時(shí)間，影響最小的因素是超聲破碎功率。由表3還可見(jiàn)，從厚樸提取蛋白質(zhì)的最佳超聲破碎工藝條件為，即超聲功率250 W，超聲破碎時(shí)間30 min，超聲間隔時(shí)間6 s。即取1 g厚樸蛋白質(zhì)粉末，加入4 mL稀釋4倍的濃縮膠緩沖液，在250 W的超聲功率下，取超聲間隔間隔6 s，超聲破碎30 min。

2.4.2 驗(yàn)證性試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)得出的最佳條件提取3次，取3份厚樸粉末，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，測(cè)得蛋白質(zhì)濃度分別為930.87、934.21、933.15 μg/mL，RSD 值為 0.18%，說(shuō)明該條件下所得的蛋白質(zhì)濃度基本穩(wěn)定，條件可行。

3 結(jié)論

通過(guò)比較3種不同方式提取蛋白質(zhì)的效率，確定超聲破碎法提取為最佳。試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)用超聲清洗儀超聲破碎時(shí)其溫度會(huì)隨著超聲時(shí)間的增加而增加，這可能會(huì)使蛋白質(zhì)因溫度的升高而變性失活，因此在冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎能避免這一問(wèn)題。蛋白質(zhì)的提取是蛋白質(zhì)指紋圖譜構(gòu)建中重要的一環(huán)，供試樣品的蛋白質(zhì)含量不能達(dá)到要求的話在電泳之后就無(wú)法得到清晰完整的條帶[12-13]。在前期相關(guān)研究中，因提取樣品的蛋白質(zhì)含量過(guò)低，無(wú)法跑出達(dá)到清晰的電泳圖譜，故在本研究中對(duì)超聲破碎提取蛋白質(zhì)的方法進(jìn)行了優(yōu)化，選擇超聲破碎時(shí)間、超聲時(shí)間間隔以及超聲破碎功率等因素，進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，繼而得出最佳的蛋白質(zhì)提取方式。結(jié)果表明，在超聲破碎時(shí)間30 min，超聲間隔時(shí)間6 s，超聲破碎功率250 W時(shí)蛋白質(zhì)提取濃度達(dá)到最大為930 μg/mL，達(dá)到了蛋白質(zhì)電泳的靈敏度要求，為后續(xù)進(jìn)行厚樸的蛋白質(zhì)指紋圖譜研究提供了研究基礎(chǔ)。