葉綠素對乳酸鏈球菌生長特性和代謝水平的影響

李媛媛，歐雅文，崔羽，胡小松，廖小軍，張燕

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，國家果蔬加工工程技術(shù)研究中心，北京100083）

隨著生活水平提高，居民高脂肪、高蛋白飲食的 攝入使肥胖、高血脂等代謝疾病的發(fā)病率在全世界普遍上升[1－3]。為了降低肥胖發(fā)生率，緩解這一健康問題，2016年美國農(nóng)業(yè)部和中國營養(yǎng)學(xué)會分別修訂了各自的膳食指南，指南中均明確提出增加蔬菜的攝入量[4－7]。葉綠素作為綠色蔬菜中含量最為豐富的色素，其決定了果蔬的品質(zhì)特征，同時國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)其還具有降低膽固醇、調(diào)節(jié)腸道功能、抗突變等生理功能[8-11]。近年來，隨著深色蔬菜中的花色苷、多酚等非營養(yǎng)物質(zhì)被深入研究，蔬菜攝入后的葉綠素的生物活性和營養(yǎng)價值引起了研究人員的重視，但目前人們對葉綠素的生物活性作用的理解還十分有限。

乳酸菌（Lactobaillus）是在自然界中廣泛存在的一類可以發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)乳酸的菌群，也是最早被利用于食物加工貯藏中的微生物之一[12]。Park等[13]研究發(fā)現(xiàn)微生物在體內(nèi)作用的靶點為胃腸道，因此它對腸道菌群具有直接的調(diào)控作用。最新的研究表明在人體腸道菌群中乳酸菌具有改善腸道菌群結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、促進(jìn)機(jī)體最大程度吸收營養(yǎng)物質(zhì)，提高機(jī)體免疫力等有益的功能[13-14]。當(dāng)給肥胖人群補(bǔ)充乳酸菌時，乳酸菌對肥胖人群腸道菌群的調(diào)節(jié)平衡作用，能夠潛在的治療肥胖及腎臟疾病[15]。在腸道中，乳酸菌通過產(chǎn)生的有機(jī)酸維持腸道酸性環(huán)境的穩(wěn)定，并抑制有害菌的生長[16]。

因此，本試驗在體外研究葉綠素的生物活性對乳酸鏈球菌（Lactic streptococci）的生長及代謝的影響，試圖探索作為非營養(yǎng)物質(zhì)之一的葉綠素是否能促進(jìn)乳酸菌屬中的乳酸鏈球菌種這類有益菌的生長，影響其產(chǎn)代謝物水平，進(jìn)而起到促進(jìn)乳酸鏈球菌調(diào)節(jié)腸道菌群，維持腸道菌群平衡的作用。此外，本試驗為后續(xù)葉綠素和乳酸鏈球菌二者在體內(nèi)協(xié)同發(fā)揮降低體重，有益健康的作用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

同一來源同一批次的新鮮菠菜（Spinacia oleracea L.）：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)家屬區(qū)種植購買；乳酸鏈球菌（Lactic streptococci）：四川省微生物資源平臺菌種保藏中心；色譜級甲醇、三氯甲烷、乙腈、正己烷：美國Thermo fisher公司；濃硫酸、95%乙醇等均為分析純試劑，試驗中所用的水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

CR21GⅢ型高速冷凍離心機(jī)：日本日立公司；DHP-9082恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；UV-1800紫外可見光分光光度計：日本島津公司；JYDZ-31B九陽打漿機(jī)：九陽股份有限公司；Acquit UPLC液相色譜儀（UPLC）：美國Agilent公司；T6新世紀(jì)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：北京普析通用儀器有限責(zé)公司。

1.3 方法

1.3.1 葉綠素的制備

參照Rivera-Chávez等[17]的方法提取新鮮菠菜中的葉綠素。將洗凈晾干的菠菜葉去梗，放攪拌機(jī)中，并倒入適量乙醇，攪拌成漿。按照料液比1∶3（g/mL）的比例再加入95%乙醇（體積分?jǐn)?shù)），混勻后4℃，8 000 g條件下離心6 min，所得上清液在36℃水浴條件下旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)濃縮，靜置過夜后去除上清獲得葉綠素濃漿。葉綠素水平測定參照張雅婕[18]的方法并做修改，用移液槍吸取1 mL葉綠素濃縮液，梯度稀釋100倍后分別在645、663 nm處測吸光度值OD，以80%丙酮（體積分?jǐn)?shù)）為對照。葉綠素水平計算公式如下：

式中：Ca代表葉綠素a濃度，mg/L；Cb代表葉綠素b 濃度，mg/L；C 代表葉綠素總濃度，mg/L；A645代表樣品在645 nm下的吸光值；A663代表樣品在663 nm下的吸光值。

本試驗中，得到葉綠素溶液平均濃度為7.8mg/mL。

1.3.2 菌種的活化和乳酸鏈球菌培養(yǎng)

參照Wolf等[19]方法，并稍作修改，進(jìn)行菌種的活化。取1mL甘油貯存液菌種接入到19 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，在37℃培養(yǎng)24 h，活化兩代后，第三代活化至對數(shù)中后期，混勻后取適量菌液3 000 r/min離心10 min棄去上清液，用0.9%NaCl溶液還原至相同體積后，稀釋10倍備用。

參照Prückler等[20]的方法并稍作修改。取出冷凍的1.5 mL乳酸鏈球菌EP管室溫融化后，接種到20 mL液體厭氧培養(yǎng)管中，同時加入1 mL葉綠素粗提液，以不加葉綠素粗提液為空白對照，置于37℃的水浴搖床中（70 r/min）培養(yǎng)24 h，得到乳酸鏈球菌發(fā)酵液。

1.3.3 乳酸鏈球菌生長曲線的測定

參照Di Cagno等[21]的試驗方法，每隔2 h用1 mL注射器吸取乳酸菌發(fā)酵液1 mL在紫外600 nm下測OD值，并記錄試驗數(shù)據(jù)，繪制乳酸菌生長曲線。

1.3.4 有機(jī)酸及短鏈脂肪酸測定

采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定有機(jī)酸、短鏈脂肪酸等乳酸菌代謝產(chǎn)物的變化趨勢[22-25]。具體試驗方法為：分別配制草酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、丙酸、正戊酸等標(biāo)準(zhǔn)品的系列濃度梯度，用0.22 μm的水相濾膜進(jìn)行過濾，濾液用高效液相色譜法測定，定量分析后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于后續(xù)有機(jī)酸和短鏈脂肪酸含量的計算。HPLC條件為：用超純水作為流動相A，在13 mm水系濾膜下過濾后的0.005 mol/L H2SO4作為流動相B，等梯度洗脫，流速 0.5 mL/min，柱溫 65 ℃，進(jìn)樣量 10 μL，檢測波長為210 nm。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個試驗重復(fù)至少3次，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Statistix 8.1（分析軟件，St Paul，MN）軟件包中Linear Models程序進(jìn)行，差異顯著性（P＜0.05）分析使用Tukey HSD程序，采用Origin 8.1（Microcal Software，Inc.，Northampton USA）制圖軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素對乳酸鏈球菌生長曲線的影響

葉綠素對乳酸鏈球菌生長曲線的影響見圖1。

圖1 乳酸鏈球菌生長曲線Fig.1 The growth curve of Lactic streptococci

如圖1所示，葉綠素的添加能顯著提高乳酸鏈球菌菌液的OD值（P＜0.05），且葉綠素對乳酸鏈球菌生長曲線趨勢無影響，與對照組一致。0～2 h內(nèi)是乳酸鏈球菌的急速增長期，乳酸鏈球菌OD值由0.62上升至0.89，上升43%。因此我們推測0～2 h為乳酸鏈球菌可以充分利用并消耗葉綠素而促進(jìn)自身生長的最有效時期。

2.2 葉綠素對乳酸鏈球菌代謝物水平的影響

2.2.1 葉綠素對乳酸鏈球菌產(chǎn)草酸的影響

葉綠素對乳酸鏈球菌產(chǎn)草酸的影響見圖2。

圖2 葉綠素對乳酸鏈球菌產(chǎn)有機(jī)酸——草酸水平的影響Fig.2 Effect of chlorophyll on the content of organic acid（oxalic acid）by Lactic streptococci

由圖2可知，和對照組相比，添加葉綠素后24 h內(nèi)代謝物中草酸水平顯著降低（P＜0.05），其中6 h～10 h內(nèi)降低最為顯著。Sasikumar等[26]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌可以降解草酸，降低人體腎臟草酸水平，減輕腎臟負(fù)擔(dān)，同時增加尿液中的草酸的排泄。Mogna等[27]通過對比乳酸桿菌和雙歧桿菌的降解草酸能力，得出了前者的草酸降解能力強(qiáng)于后者，有約68.5%的草酸銨鹽能被其降解。本研究發(fā)現(xiàn)，和單獨的乳酸鏈球菌相比，葉綠素的添加能顯著降低草酸水平（P＜0.05），可能存在兩方面原因，一是葉綠素促進(jìn)乳酸鏈球菌的增殖，有效降解草酸。二是葉綠素可以提高乳酸鏈球菌降解草酸的能力，具體的原因還需要進(jìn)一步研究。

2.2.2 葉綠素對乳酸鏈球菌產(chǎn)乳酸，檸檬酸水平的影響

乳酸鏈球菌進(jìn)入腸道后，通過代謝產(chǎn)生乳酸和檸檬酸，可以有效的抑制有害細(xì)菌的增殖和生長，維持機(jī)內(nèi)生態(tài)平衡和腸道的正常機(jī)能[12－13]。因此乳酸鏈球菌對腸道內(nèi)菌群的組成和調(diào)節(jié)具有非常重要的作用，研究葉綠素對乳酸鏈球菌產(chǎn)生乳酸和檸檬酸水平的影響，有助于更好的了解其在腸道中的代謝情況。葉綠素對乳酸鏈球菌產(chǎn)乳酸，檸檬酸水平的影響如圖3所示。

圖3 葉綠素對乳酸鏈球菌產(chǎn)有機(jī)酸——乳酸、檸檬酸水平的影響Fig.3 Effect of chlorophyll on the content of organic acid（lactic acid and citric acid）by Lactic streptococci

由圖3可見，添加葉綠素后，和對照組相比，在24 h內(nèi)乳酸，檸檬酸水平顯著提高（P＜0.05），其中檸檬酸含量提高達(dá)5%。檸檬酸、乳酸水平的升高，均能促進(jìn)三羧酸循環(huán)和糖酵解過程[22]。檸檬酸可以直接參與三羧酸循環(huán)，而乳酸水平的升高可以逆反饋，抑制丙酮酸轉(zhuǎn)化成乳酸；丙酮酸作為三羧酸循環(huán)的起始底物，丙酮酸水平增加又進(jìn)一步促進(jìn)檸檬酸水平的升高[28]。因此檸檬酸和乳酸水平的升高能促進(jìn)能量代謝，從而促進(jìn)機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。Coda等[23]研究發(fā)現(xiàn)乳糖在乳酸鏈球菌的作用下，可以產(chǎn)生乳酸，檸檬酸等，降低生境內(nèi)氧化還原電位和pH值，起到抑制部分致病菌、有害菌和腐敗菌增長的作用。此外，乳酸鏈球菌能產(chǎn)生乳酸鏈球菌素，對大腸桿菌素和金黃色葡萄球菌素等具有一定的拮抗作用[14]。因此，將乳酸鏈球菌用于保健食品，可以增強(qiáng)機(jī)體對致病菌的抵抗力。本試驗中發(fā)現(xiàn)添加葉綠素顯著促進(jìn)乳酸鏈球菌產(chǎn)乳酸、檸檬酸水平，說明葉綠素可以通過增加乳酸和檸檬酸水平對人體健康產(chǎn)生積極的作用。

2.2.3 葉綠素對乳酸鏈球菌產(chǎn)短鏈脂肪酸水平的影響

乳酸鏈球菌絕大多數(shù)代謝產(chǎn)物都對人體有益，尤其是短鏈脂肪酸，如乙酸與肥胖的相互作用，丙酸是糖酵解的底物，丁酸的抗癌作用[12]。添加葉綠素培養(yǎng)乳酸鏈球菌24 h后，檢測乳酸菌短鏈脂肪酸的含量，結(jié)果如圖4所示。

圖4 葉綠素對乳酸鏈球菌產(chǎn)短鏈脂肪酸水平的影響Fig.4 Effect of chlorophyll on the content of short chain fatty acids by Lactic streptococci

圖4為葉綠素對乳酸鏈球菌代謝短鏈脂肪酸的影響，其中主要檢測到乙酸、丙酸和正戊酸。如圖4（A）所示，和未添加葉綠素的對照組相比，添加葉綠素對乳酸鏈球菌產(chǎn)乙酸水平無顯著性影響（P＞0.05）；但圖4（B、C）中，添加葉綠素2 h后，和對照組相比，丙酸水平微量升高、正戊酸水平顯著升高（P＜0.05）。添加葉綠素促進(jìn)乳酸鏈球菌代謝產(chǎn)物丙酸、正戊酸水平升高，與乳酸鏈球菌OD值的增大呈現(xiàn)正相關(guān)，可能葉綠素通過促進(jìn)乳酸鏈球菌數(shù)量的增加，促進(jìn)其代謝產(chǎn)物的增加[8]。Kageyama等[29]進(jìn)行動物實驗研究表明，無菌小鼠腸道上皮細(xì)胞由于能量不足會發(fā)生自噬現(xiàn)象，影響上皮細(xì)胞的完整性，而添加丙酸后腸道細(xì)胞自噬現(xiàn)象消失，說明丙酸能給小腸上皮細(xì)胞提供能量，從而減少細(xì)胞凋亡。此外，丙酸還是糖酵解的底物，能有效促進(jìn)糖酵解過程，促進(jìn)能量代謝[15]。因此，添加葉綠素后增加乳酸鏈球菌產(chǎn)丙酸水平，有利于人體營養(yǎng)健康。Donohoe等[30]研究發(fā)現(xiàn)短鏈脂肪酸的種類和數(shù)量和人體健康具有一定的相關(guān)性。過敏性疾病患兒在早期與正常兒童腸道中的腸道菌群有明顯差異，所以短鏈脂肪酸的種類和數(shù)量也表現(xiàn)出明顯的差異，過敏性疾病患兒腸道中丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸的水平均比正常兒童低。因此，建議多過敏性患者攝入葉綠素，促進(jìn)體內(nèi)短鏈脂肪酸的生成。

3 結(jié)論

本研究通過體外添加葉綠素培養(yǎng)乳酸鏈球菌發(fā)酵24 h，發(fā)現(xiàn)葉綠素的添加顯著促進(jìn)乳酸鏈球菌增殖，且0～2 h為乳酸鏈球菌的有效增殖期。此外，葉綠素促進(jìn)乳酸鏈球菌產(chǎn)代謝物水平增加，其中有機(jī)酸水平上，草酸水平顯著降低，乳酸、檸檬酸水平顯著升高；短鏈脂肪酸水平上，正戊酸水平顯著增加，丙酸水平輕微增加，乙酸水平則無顯著性差異。綜合以上結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn)葉綠素影響了乳酸鏈球菌的生長及代謝，證明葉綠素具有一定的生物活性，可以和乳酸鏈球菌協(xié)同發(fā)揮促進(jìn)健康的作用。