HPLC法測定腎樂膠囊中阿魏酸含量

王歡歡，黃曉舞（解放軍總醫(yī)院制劑中心，北京 100853）

腎樂膠囊是解放軍總醫(yī)院非標(biāo)準(zhǔn)制劑品種，由水蛭、當(dāng)歸、黨參等五味中藥組成，具有活血化瘀，益氣養(yǎng)血，健脾利濕的功效。用于慢性腎小球腎炎或伴腎功能不全早、中期，證屬氣虛血瘀兼水濕者，癥見神疲乏力，腰酸腰痛，面色無華或晦暗，面浮肢腫，納呆，舌質(zhì)淡暗或有瘀點瘀斑，苔薄白或膩，脈沉細(xì)或細(xì)弱。該藥在臨床應(yīng)用多年，質(zhì)量可靠，療效顯著。腎樂膠囊現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)制定時間較早，要求比較低，為了更好的控制其內(nèi)在質(zhì)量，有必要對原有標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提高。本研究采用HPLC法對腎樂膠囊中阿魏酸含量進(jìn)行測定，旨在更好的控制腎樂膠囊的質(zhì)量。

1 儀器與材料

XS105型電子天平（梅特勒精密儀器有限公司）；Agilent 1260液相色譜儀（美國Agilent公司）； KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；列孔型電熱恒溫水浴鍋（天津市中環(huán)科技開發(fā)公司）。

腎樂膠囊（解放軍總醫(yī)院自制，批號：SL170501、SL170502、SL170503）；阿魏酸對照品（含量按99.0%計，中國食品藥品檢定研究院，批號：110773-201614）。甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為高純水。

2 方法

2.1 色譜條件[1-3]

色譜柱：Agilent EclipseXDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-1%醋酸水溶液（3 : 7）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：313 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論塔板數(shù)按阿魏酸峰計應(yīng)不低于1500。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸對照品13.10 mg（批號：110773-201614，含量按99.0%計），置100 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋到刻度，搖勻；精密量取5 mL，置50 mL的棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含12.97 μg的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取裝量差異項下的內(nèi)容物，研細(xì)，取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理40 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 取不含黨參、陳皮和當(dāng)歸藥材的陰性樣品，按“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液。

2.3 專屬性實驗

取上述對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。結(jié)果顯示，供試品中阿魏酸與對照品在相同保留時間處有相同色譜峰，峰形良好，與其他組分峰基線分離度較好，且陰性樣品無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取貯備液適量，分別加甲醇稀釋配成不同濃度對照品溶液。分別精密量取貯備液和不同濃度對照品溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得阿魏酸線性回歸方程：y=899395.323x+ 40187.336（r= 0.9999）。結(jié)果表明：阿魏酸的濃度在2.5938 μg·mL-1～ 64.8450 μg·mL-1范圍內(nèi)峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度實驗

取阿魏酸對照品溶液（濃度為12.97 μg·mL-1）適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，阿魏酸峰面積RSD為0.62%（n= 6），表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性實驗

精密稱取批號SL170501供試品6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算含量。結(jié)果表明阿魏酸含量平均值為0.0480 mg·粒-1，RSD為1.58%（n= 6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 中間精密度實驗

取本品（批號：SL170501）細(xì)粉適量，在不同時間，由不同的實驗人員，使用不同的儀器（Agilent 1200液相色譜儀），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算含量。結(jié)果表明，含量測定中間精密度實驗阿魏酸平均含量為0.0480 mg·粒-1，RSD為1.15%（n=12），表明該方法測定本品含量中間精密度良好。

圖1 高效液相色譜圖A – 阿魏酸對照品；B – 供試品；C – 陰性樣品；1 – 阿魏酸Fig 1 HPLC chromatograms A – ferulic acid control; B – test sample; C – negative reference substance; 1 – ferulic acid

2.8 回收率實驗

精密稱取本品（批號：SL170501，含量：0.0480 mg·粒-1）細(xì)粉約0.5 g，置具塞錐形瓶中，加入濃度為10.4049 μg·mL-1的阿魏酸對照品溶液（阿魏酸對照品批號：110773-201614，含量按99.0%計）5 mL，再精密加入甲醇20 mL，稱定重量，超聲處理40 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得，平行制備6份供試品溶液。按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算回收率。結(jié)果見表1。

2.9 穩(wěn)定性實驗

取“2.2.2”項下供試品溶液，室溫放置，分別于0、4.0、7.5、11.0、15.5、20.5、26.0、35.0 h按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，供試品中阿魏酸峰面積RSD為1.24%（n= 8），表明供試品溶液室溫放置35 h內(nèi)穩(wěn)定。

表1 回收率測定結(jié)果. n = 6Tab 1 Results of recovery test. n = 6

2.10 含量測定

取三批中試樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果. n = 3Tab 2 Results of contents determination of samples. n = 3

3 討論

3.1 專屬性考察

在含量測定專屬性實驗中，取缺當(dāng)歸的陰性樣品，結(jié)果陰性樣品溶液的色譜圖中在與對照品溶液色譜圖中相應(yīng)的位置有相同的色譜峰出現(xiàn)，表明陰性樣品干擾本品阿魏酸的測定。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)[1,4]，處方中黨參、陳皮藥材中也含有阿魏酸，為進(jìn)一步確定干擾來源，分別取當(dāng)歸、黨參、陳皮和茯苓藥材細(xì)粉各約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，照供試品處理方法依法制備供試品溶液，與對照品溶液，按上述色譜條件，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明，茯苓中不含阿魏酸，當(dāng)歸、黨參和陳皮中均含有阿魏酸，故將標(biāo)準(zhǔn)修訂為測定黨參、陳皮和當(dāng)歸中總阿魏酸含量。

3.2 提取方法和時間考察

在含量測定過程中發(fā)現(xiàn)，供試品采用乙酸乙酯超聲提取時，樣品結(jié)塊，分散不均勻，影響本品含量的準(zhǔn)確測定，故在原標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，對供試品的處理方法進(jìn)行篩選，優(yōu)化，使本品含量能準(zhǔn)確測定。比較了不同提取溶劑[5-8]（水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、甲醇、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇和95%乙醇）對樣品含量的影響，結(jié)果除采用乙醇提取，供試品溶液色譜圖中主峰前延，影響含量準(zhǔn)確測定，其它溶劑供試品色譜圖中，主峰峰形良好，且與相鄰雜質(zhì)峰分離度符合要求，不干擾本品含量測定，且甲醇提取時，樣品在提取過程中不結(jié)塊，分散均勻，能將供試品中阿魏酸提取完全，故確定本品的提取溶劑為甲醇。同時考察了不同提取時間（10、20、30、40、50、60 min）對含量的影響，試驗結(jié)果表明，超聲40 min時，本品中阿魏酸能提取完全，故確定本品提取時間為40 min。

3.3 系統(tǒng)耐用性考察

為了考察微小變動因素對本品含量測定的影響，調(diào)節(jié)流速（0.9、1.0、1.1 mL·min-1）、柱溫（25、30、35 ℃）和流動相比例（30 : 70、33 : 67、27 : 73）進(jìn)行試驗，含量分別為：0.0477 mg·粒-1、0.0483 mg·粒-1、0.0475 mg·粒-1、0.0491 mg·粒-1、0.0477 mg·粒-1、0.0482 mg·粒-1、0.0470 mg·粒-1（RSD為1.41%，n= 7），結(jié)果表明在測試條件有微小變動時，測定結(jié)果基本不受影響，此測試條件的耐用性良好。

3.4 含量限度考察

根據(jù)以上含量測定數(shù)據(jù)，結(jié)合大生產(chǎn)工藝因素和不同批次間藥材含量的高低變化，以及成品片重差異范圍等影響含量變化因素，為確保成品質(zhì)量，暫定本品每粒含黨參、陳皮和當(dāng)歸以阿魏酸（C10H10O4）計,不得少于0.0450 mg。