金邊也門鐵花葉性狀差異表達(dá)基因的cDNA-AFLP分析

劉和平 何業(yè)華 林劍波 張俊麗

摘要：【目的】篩選金邊也門鐵花葉性狀相關(guān)差異表達(dá)基因，為深入探索也門鐵葉色形成的分子調(diào)控機(jī)制打下基礎(chǔ)?！痉椒ā炕赾DNA擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)（cDNA-AFLP），利用64對(duì)EcoR I和Mse I選擇性擴(kuò)增引物組合分析金邊也門鐵葉片綠色與黃色部分組織cDNA，經(jīng)篩選、回收、克隆、測(cè)序和BLAST比對(duì)分析獲得差異表達(dá)基因?！窘Y(jié)果】利用64對(duì)引物組合共擴(kuò)增出1726條可分辨的條帶，并獲得58條差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄衍生片段（TDFs），其中12條TDFs為特異性表達(dá)。12條特異性TDFs中，5條TDFs具有同源序列，另外7條TDFs無同源序列，為未知功能基因。在葉片黃化部位特異表達(dá)同源性為96%的TDFs序列M8E3B-2和M8E3B-3與大麗花花葉病毒Holland包涵體蛋白基因、紫莖澤蘭明脈病毒基因、洋丁香黃化卷葉病毒基因等花椰菜花葉病毒科病毒基因具有較高的同源性?！窘Y(jié)論】M8E3B-2和M8E3B-3兩條TDFs序列或來源于一種花椰菜花葉病毒科病毒基因，且有可能參與了金邊也門鐵花葉葉色性狀的形成過程。

關(guān)鍵詞： 也門鐵;花葉性狀;cDNA-AFLP;差異表達(dá)基因

中圖分類號(hào)： S687.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）11-2129-07

cDNA-AFLP analysis on differentially expressed genes related to floral leaf characters of Dracaena fragrans cv. lindenii

LIU He-ping1，2，3， HE Ye-hua2*， LIN Jian-bo1， ZHANG Jun-li1

（1Yangjiang Polytechnic，Yangjiang， Guangdong 529500，China; 2College of Horticulture， South China Agricultural University， Guangzhou? 510642， China; 3Institute of Fruit Science in Maoming， Maoming， Guangdong? 525000， China）

Abstract：【Objective】Differentially expressed genes related to floral leaf characters of Dracaena fragrans cv. lindenii were selected to provide reference for further? research into the molecular regulation mechanisms in the formation of leaf color of D. fragrans（L.） Ker-Gaw. 【Method】Based on the cDNA-amplified fragment length polymorphism（cDNA-AFLP）， 64 pairs of EcoR I and Mse I selective amplification primer groups were used to investigate the cDNA of green and yellow parts of D. fragrans cv. lindenii leaves using cDNA-AFLP analysis. Then the differentially expressed genes were obtained via screening， recovery， cloning， sequencing and Blast alignment. 【Result】Sixty-four pairs of primer combinations amplified 1726 distinguishable bands. Of which， 58 differentially expressed transcript-derived fragments（TDFs） were identified. Out of the 58 TDFs， 12 specifically expressed TDFs were obtained. Among the twelve TDFs， five shared homologous sequence， and the other seven had no homologous sequence and were unknown functional genes. Two TDFs sequence（M8E3B-2 and M8E3B-3） whose specific expression homology in yellow part of leaves was 96%? shared high homology with cauliflower mosaic virus genes such as Dahlia mosaic virus Holland inclusion body，? Eupatorium vein clearing virus gene and Cestrum yellow leaf curling virus. 【Conclusion】These results suggest that M8E3B-2 and M8E3B-3 TDFs sequences may both derive from one kind of cauliflower mosaic virus gene， and may be involved in the formation process of floral leaf color characters in D. fragrans cv. lindenii.

Key words： Dracaena fragrans（L.） Ker-Gaw.; floral leaf character; cDNA-AFLP; differentially expressed gene

0 引言

【研究意義】也門鐵[Dracaena fragrans（L.） Ker-Gaw.]又稱香龍血樹，是龍舌蘭科（Agavaceae）龍血樹屬（Dracaena）常綠喬木，原產(chǎn)于幾內(nèi)亞和埃塞俄比亞，我國(guó)引種栽培后已發(fā)展成為重要的盆栽觀葉植物，市場(chǎng)上主要有金心也門鐵（D. fragrans cv. massangeana）、金邊也門鐵（D. fragrans cv. lindenii）和普通也門鐵（D. fragrans cv.）3個(gè)品種。其中，金心也門鐵和金邊也門鐵是普通也門鐵的葉色嵌合體變異種，其葉片上的黃色和綠色條紋相間排列，色彩明亮、觀賞周期長(zhǎng)，具有較高的觀賞價(jià)值和特殊園林用途，已成為園林造景的優(yōu)選物種（何業(yè)華等，2008）。然而，也門鐵花葉品種在離體繁殖過程中其不定芽變異較嚴(yán)重，致使苗木生產(chǎn)成本居高不下。cDNA擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)（cDNA-AFLP）是將擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）和RT-PCR相結(jié)合檢測(cè)基因差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究工具，具有多態(tài)性高、假陽(yáng)性低、重復(fù)性高、模板需求量少且能準(zhǔn)確反映基因時(shí)空表達(dá)差異等優(yōu)點(diǎn)（Bachem et al.，1998），已成功應(yīng)用于鑒定與植物胚胎發(fā)育（Bachem et al.，2000）、形態(tài)發(fā)生（Kwon et al.，2004;Bruggmann et al.，2005;鐘文娟等，2017）、信號(hào)傳導(dǎo)（Bove et al.，2005）和抗逆性狀表達(dá)（Hmida-Sayari et al.，2005;張亮行等，2016）等相關(guān)的功能基因或分子標(biāo)記。應(yīng)用cDNA-AFLP篩選金邊也門鐵花葉性狀差異表達(dá)基因，有助于開展其葉色嵌合體顏色變異分子調(diào)控機(jī)理研究。因此，了解也門鐵花葉性狀相關(guān)基因的差異表達(dá)，對(duì)其葉色嵌合穩(wěn)定性保持、工廠化組培育苗及新品種培育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】已有研究表明，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、基本培養(yǎng)基種類、AgNO3和栽培基質(zhì)等因素會(huì)影響也門鐵的離體再生（易清等，2007）。何業(yè)華等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，金心也門鐵和金邊也門鐵在離體培養(yǎng)過程中其嵌合體性狀極不穩(wěn)定。陳麗文等（2013）研究認(rèn)為，以芽繁芽的方式進(jìn)行繼代增殖能極大降低金心也門鐵組培繁殖過程中的變異率。張北壯等（2014）的研究結(jié)果顯示，溫度是影響金心也門鐵開花的主要環(huán)境因子。吳顏洲等（2015）通過形態(tài)學(xué)觀察、致病力測(cè)定和分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，引起廣州地區(qū)金心也門鐵葉斑病的病原菌為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum Schl.）。劉新亮等（2017）研究表明，葉色突變體已成為分子生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)等的良好試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛷V泛應(yīng)用于遺傳模式、色素合成、光合作用、細(xì)胞結(jié)構(gòu)與發(fā)育等基礎(chǔ)研究。本課題組近年來聚焦也門鐵變異規(guī)律、細(xì)胞學(xué)及葉綠素合成等內(nèi)容，系統(tǒng)研究其花葉顏色變異性狀。易清等（2007）通過建立也門鐵離體繁殖體系，發(fā)現(xiàn)金邊也門鐵分化率較高、苗生長(zhǎng)勢(shì)差，避免脫分化形成愈傷組織及減少或阻止愈傷組織再分化是減少也門鐵嵌合體品種發(fā)生變異的關(guān)鍵;何業(yè)華等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，也門鐵嵌合體性狀變異率主要受芽增殖方式影響，且由腋芽分化方式產(chǎn)生的芽變異率最低;劉和平等（2011）、劉和平和何業(yè)華（2012）研究發(fā)現(xiàn)，金邊也門鐵葉片變異部分的黃色細(xì)胞沒有完整的葉綠體結(jié)構(gòu)，葉綠體破壞嚴(yán)重，基粒降解，片層膜結(jié)構(gòu)降解，葉綠素合成在膽色素原（Porphobili-nogen，PBG）與尿卟啉原III（Uroorphyrinogen III，Urogen III）間受阻，導(dǎo)致顏色發(fā)生變化;而金心也門鐵葉片變異部分的黃色細(xì)胞葉綠體退化程度相對(duì)較輕，形狀呈圓形，結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，基粒扭曲，葉綠素總含量較低，葉綠素合成在UrogenⅢ與原卟啉間受阻?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，針對(duì)也門鐵嵌合體葉色變異性狀形成的分子遺傳調(diào)控機(jī)制研究鮮見報(bào)道，與該變異過程相關(guān)的功能基因亦未明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】應(yīng)用cDNA-AFLP從轉(zhuǎn)錄水平探索金邊也門鐵嵌合體葉片顏色變異性狀相關(guān)基因的差異表達(dá)，基于EcoR I和Mse I雙酶切系統(tǒng)，利用64對(duì)選擇性擴(kuò)增引物組合，對(duì)葉片黃色和綠色部分進(jìn)行差異表達(dá)分析，旨在鑒定出與葉色變異性狀相關(guān)的功能基因，為進(jìn)一步探究其調(diào)控分子遺傳機(jī)制打下良好基礎(chǔ)，亦為花葉植物的分子遺傳學(xué)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

金邊也門鐵采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)場(chǎng)，為葉色嵌合性狀穩(wěn)定的2年生正常植株，剪取與主脈垂直的同一水平線葉片的正常部分和黃色部分，液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 總RNA提取及雙鏈cDNA合成

利用Trizol試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）提取金邊也門鐵葉片組織總 RNA。用RNase-Free DNAse I [天根生化科技（北京）有限公司]處理總RNA，去除殘留的基因組DNA。雙鏈cDNA合成按照Prime ScriptTM Double Strand cDNA Synthesis Kit（日本TaKaRa公司）說明進(jìn)行操作。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)抽提、沉淀和洗滌后溶于20 μL TE溶液中，濃度調(diào)至20 ng/μL。

1. 3 cDNA-AFLP分析

用EcoR I和Mse I為酶切組合，對(duì)雙鏈cDNA進(jìn)行酶切，以E和M為引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，再以EcoR I選擴(kuò)引物（E1-E8）和Mse I選擴(kuò)引物（M1-M8）組合進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離，銀染法顯示條帶。

1. 4 差異表達(dá)TDF的回收、測(cè)序及分析

差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄衍生片段（Transcript-derived fragments，TDFs）回收采用改進(jìn)的煮沸法。用手術(shù)刀片從聚丙烯酰胺凝膠切取差異條帶，經(jīng)浸泡過夜、加熱煮沸、離心收集后取上清液作為二次PCR擴(kuò)增模板。使用相應(yīng)的選擇性擴(kuò)增引物經(jīng)二次擴(kuò)增、純化、連接和克隆，挑取經(jīng)酶切或質(zhì)粒PCR驗(yàn)證的陽(yáng)性克隆送至華大基因（深圳）科技公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果先在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的GenBank中進(jìn)行BLASTx比對(duì)分析，對(duì)無同源性的TDFs繼續(xù)進(jìn)行BLASTn分析;用DNASTAR和Primer 5.0、Chromas 2.0分析所克隆序列與GenBank中相關(guān)序列的同源性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 金邊也門鐵花葉顏色變異的cDNA-AFLP分析結(jié)果

從圖1可看出，利用Trizol試劑盒提取的金邊也門鐵葉片綠色和黃色部分的總RNA完整性良好、無降解，DNA污染少。從圖2可看出，反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA介于100～2000 bp，呈彌散紡錘狀分布，反轉(zhuǎn)錄效率高。從圖3可看出，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶邊緣清晰，在100～2000 bp呈連續(xù)彌散狀，cDNA酶切充分，連接及預(yù)擴(kuò)增效果較好?？梢姡瑯?gòu)建的cDNA文庫(kù)質(zhì)量較好，可用于cDNA-AFLP分析。

從圖4可看出，64對(duì)引物組合共擴(kuò)增出1726條可分辨的TDFs條帶，其中，有差異的TDFs條帶58條，約占總條帶數(shù)的3.36%。在58條差異TDFs中，有46條存在表達(dá)量差異，即在葉片黃色部分和綠色部分均能獲得擴(kuò)增條帶，但條帶的強(qiáng)弱不同（基因表達(dá)上調(diào)或下調(diào)）;剩余的12條差異TDFs僅在葉片黃色部分或綠色部分獲得擴(kuò)增條帶，存在特異性表達(dá)差異。說明金邊也門鐵葉片cDNA-AFLP圖譜條帶非常豐富，對(duì)其進(jìn)行篩選可有效獲得具有價(jià)值的差異條帶。

2. 2 特異表達(dá)TDFs的回收與克隆

對(duì)獲得的特異性表達(dá)TDFs條帶進(jìn)行回收和二次PCR擴(kuò)增，共得到12條有效序列;特異性表達(dá)TDFs片段主要集中在100～500 bp（圖5），與cDNA-AFLP擴(kuò)增獲得的相應(yīng)條帶大小一致，且回收條帶清晰、單一。對(duì)12條特異性表達(dá)TDFs進(jìn)行克隆和篩選，并以菌落PCR檢測(cè)確認(rèn)陽(yáng)性克隆，結(jié)果表明，所有陽(yáng)性克隆均能擴(kuò)增出目的條帶（圖6），可用于下一步的測(cè)序分析。

2. 3 測(cè)序分析與功能注釋

挑選12條特異性表達(dá)TDFs的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，獲得的序列去除引物和質(zhì)粒序列后，用BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在12條TDFs序列中，7條TDFs在GenBank中無同源序列，可能代表未知功能基因;5條TDFs可匹配到同源序列，其中M8E3L-1、M8E3B-2和M8E3B-3的3條TDFs序列與已知基因序列的同源性較高。M8E3B-2和M8E3B-3序列是M8和E3的引物組合在葉片黃色部分?jǐn)U增的特異表達(dá)TDFs，二者的同源性高達(dá)96%（表2）。

BLAST比對(duì)分析結(jié)果表明，M8E3B-2序列與大麗花花葉病毒Holland包涵體蛋白基因、紫莖澤蘭明脈病毒基因、洋丁香黃化卷葉病毒基因和紫茉莉花葉病毒基因的同源性介于76%～87%;M8E3B-3序列與大麗花花葉病毒Holland包涵體蛋白基因、洋丁香黃化卷葉病毒基因、大麗花花葉病毒內(nèi)含體蛋白基因（VI）和紫莖澤蘭黃脈病毒基因的同源性介于81%～88%（表2）。說明金邊也門鐵葉片黃色部分特異表達(dá)的TDFs序列M8E3B-2和M8E3B-3可能來源于一種花椰菜花葉病毒科病毒基因。

3 討論

基因的差異表達(dá)促使生物體表現(xiàn)出各種特征。研究基因差異表達(dá)的方法很多，其中基于mRNA水平研究差異表達(dá)基因的方法包括消減雜交法（Subtractive hybridization，SH）、cDNA微陣列（cDNA microarray hybridization）、差異顯示PCR（Differential display RT-PCR，DDRT-PCR）、基因芯片技術(shù)、轉(zhuǎn)錄組分析（Transcriptomic analysis）和cDNA-AFLP等（李文雍和陳清軒，2004）。cDNA-AFLP具有假陽(yáng)性低、靈敏度高、重復(fù)性好、無需預(yù)知序列信息等諸多優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)研究不同時(shí)期或不同環(huán)境條件下的基因表達(dá)情況，已廣泛應(yīng)用于植物基因差異表達(dá)、新基因挖掘和抗逆性分子機(jī)理等方面的研究。本研究運(yùn)用cDNA-AFLP對(duì)金邊也門鐵的葉片顏色變異性狀在基因表達(dá)水平上進(jìn)行分析，成功獲得12條特異性表達(dá)TDFs。

近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者以失綠突變體植物為材料對(duì)其遺傳性、光合色素組成、葉綠體結(jié)構(gòu)與功能及蛋白質(zhì)組分等進(jìn)行了研究（趙云等，2001;范燕萍等，2006），但這些研究材料的全葉均表現(xiàn)為葉綠素缺乏，而非葉色嵌合體花葉。金邊也門鐵是研究嵌合體花葉植物花葉顏色變異的良好材料，本課題組已從生理水平對(duì)其葉色嵌合體形成機(jī)理進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)其葉片綠色部分與也門鐵葉片的葉綠素a、b及總?cè)~綠素含量無顯著差異，但金邊也門鐵葉片變異（黃色）部分的葉綠素a、b及葉綠素總含量明顯低于葉片綠色部分并導(dǎo)致葉片顏色發(fā)生變化，且葉片黃色部分的葉綠素合成在PBG與Urogen III間受阻（劉和平等，2011），但受阻的機(jī)理目前尚未清楚。

本研究基于64對(duì)引物組合，通過克隆、測(cè)序獲得了2條在葉片黃色部分特異表達(dá)的TDFs序列M8E3B-2和M8E3B-3。經(jīng)BLAST比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)這2條TDFs序列與大麗花花葉病毒Holland包涵體蛋白基因、紫莖澤蘭明脈病毒基因、洋丁香黃化卷葉病毒基因、大麗花花葉病毒內(nèi)含體蛋白基因（VI）和紫茉莉花葉病毒基因等花椰菜花葉病毒科病毒基因具有較高的同源性。已有研究表明，大麗花花葉病毒和紫莖澤蘭明脈病毒等花椰菜花葉病毒科病毒可引起寄主植物葉片產(chǎn)生花葉、明脈和斑駁等癥狀（Nri-singha and Indu，1999;Stavolone et al.，2003;Pahalawatta et al.，2008;Pappu et al.，2008）。病毒侵染后可破壞葉綠體的結(jié)構(gòu)并影響其功能，造成葉綠素含量減少，胡蘿卜素和葉黃素含量增加，產(chǎn)生失綠或黃化變異性狀（赫爾 R，2007）。通過切片觀察，發(fā)現(xiàn)金邊也門鐵花葉黃色部分變異細(xì)胞幾乎沒有葉綠體結(jié)構(gòu)，葉綠體退化十分嚴(yán)重，基粒降解，片層膜結(jié)構(gòu)降解（劉和平和何業(yè)華，2012）。而在葉綠素合成途徑中，ProtoIX在葉綠體基質(zhì)中合成后與膜結(jié)合，之后的Mg-ProtoIX及后續(xù)反應(yīng)均在類囊體膜上進(jìn)行，對(duì)葉綠體的瓦解較敏感。因此，推測(cè)金邊也門鐵葉片黃色部分特異表達(dá)的TDFs序列M8E3B-2和M8E3B-3來源于一種花椰菜花葉病毒科病毒基因，且有可能參與了金邊也門鐵花葉葉色性狀的變異過程。至于該病毒基因以何種機(jī)制導(dǎo)致金邊也門鐵葉色嵌合體的顏色發(fā)生變異，以及是病毒DNA重組整合插入黃化葉片部分的細(xì)胞基因組內(nèi)發(fā)揮作用還是以病毒侵染寄生的形式產(chǎn)生影響，尚需進(jìn)一步研究闡明。

4 結(jié)論

金邊也門鐵葉片黃色部分特異表達(dá)的TDFs序列M8E3B-2和M8E3B-3或來源于一種花椰菜花葉病毒科病毒基因，且有可能參與了金邊也門鐵花葉葉色性狀的變異過程。

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