條斑紫菜優(yōu)良品系的基因芯片表達譜分析

陳淑吟+陸勤勤+張美如+陳國耀+許廣平

摘 ? ?要：利用基因芯片表達譜比較不同特色條斑紫菜品系的基因差異表達，分析其基因與性狀差異相關性。結果顯示：（1）篩選出在06DO、L0601與HAI等3個樣本有共同表達的差異基因900個，占篩選基因總數(shù)（19 884個）的4.53%;樣本06DO與L0601共有500個差異表達基因，與HAI的差異表達基因780個;L0601與HAI有最多差異共表達基因（972個），但差異表達水平較低;L0601在不同組中皆有較多差異表達優(yōu)勢基因。（2）將這些差異表達基因進行GO功能富集分類，主要涉及蛋白質代謝、光合作用、離子綁定、營養(yǎng)物質合成過程等分類;屬于細胞組成的功能基因很少;不同組比較得到的差異表達基因的功能與富集分類表現(xiàn)出的與品系自身特色性狀有一定相關性。

關鍵詞：條斑紫菜;基因芯片表達譜;優(yōu)良品系;差異表達基因

中圖分類號：Q949.29+1 ? ? ?文獻標識碼： A ? ? ? ? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.04.002

Expression Profiles Analysis of Gene Chip between New Fine Varieties of Pyropiayezoensis

CHEN Shu-yin， LU Qin-qin， ZHANG Mei-ru， CHEN Guo-yao， XU Guang-ping

（Marine Fisheries Research Institute of Jiangsu Province， Nantong，Jiangsu 226007，China）

Abstract：In this study， using agilent gene expression profile chip， the gene differential expression between new high quality varieties with the free conchoce lisgermplasm （sporophytes） was examined. The results indicated that 900 co-expression different genes were obtained from the three groups， they accounted for 4.53% of the total number of genes （19 884）. There were differences in 500 genes between the 06DO and the L0601， likewise， 780 genes between the 06DO and the HAI， and 972 genes between the L0601 and HAI. Using GO， these DEG genes were initially classified into different categories， including response to photosynthesis， response to stress， protein synthesis and transcription， and so on. The results show that the different characters of strains are involves in many changes of variety related genes. This study will contribute to provide some useful clues to illuminate the molecular genetics mechanism of the different characters between the strains.

Key words： Pyropiayezoensis; gene chip expression profiles; fine varieties; differentially expressed genes

條斑紫菜（Pyropiayezoensis）為我國長江以北、日本和韓國等沿海地區(qū)栽培的一種大型紅藻，其生產(chǎn)在我國及世界的海藻產(chǎn)業(yè)中占有重要經(jīng)濟地位。有關條斑紫菜豐富的遺傳資源、優(yōu)良品系選育及其相關遺傳性狀的功能基因等研究，對于遺傳育種發(fā)展非常有用。隨著測序技術的快速應用，為基于DNA水平的紫菜分子遺傳學研究提供了高效率技術支持。目前，條斑紫菜中已克隆并應用研究了多個抗性相關功能基因[1-2]。牛建峰等[3]通過條斑紫菜低覆蓋度全基因組測序，得出26 629個預測基因。為研究鑒定出Pyropiatenera在高溫脅迫下的基因表達情況，San等[4]進行高溫條件下的條斑紫菜轉錄組研究，得到了368 334條EST序列，并分析得到已知功能的大部分轉錄本屬于heat shock protein family。Nakamura等[5]利用454測序技術對條斑紫菜進行了基因組測定，獲得了2 069個已知基因及預測CDS序列10 327條。而利用條斑紫菜已有的這些大量的EST、CDS等序列，來尋找與其生長發(fā)育、抗病和抗逆性相關的基因更是一種快速有效的方法。以紫菜等大型海洋藻類（Seaweeds）價值性狀篩選為目標的分子育種設計研發(fā)，將有助于提高藻類栽培可靠性[6]。針對選育的具特色性狀的優(yōu)良新種質，相關表型特征、性能指標等的遺傳機制研究備受關注，尤其是與品種產(chǎn)量、抗性相關的重要經(jīng)濟性狀調控機理的研究，已成為近年來國家發(fā)展農業(yè)產(chǎn)業(yè)的重點內容。

基因芯片（Gene chip）表達譜具有通量高、速度快的特點，可以同時檢測多個試驗樣本，并對功能基因一次性進行大規(guī)模定量分析。作為研究基因功能的重要手段，基因表達譜芯片已被廣泛應用于揭示大量基因的表達和調控情況，為利用生物技術手段提高物種抗逆境脅迫能力提供依據(jù)。通過檢測基因表達的改變情況，對差異基因進行進一步的功能研究，基因芯片這一優(yōu)勢是其他技術不能達到的[7]。

本研究中，借助已公布的條斑紫菜22 431條EST序列（NCBI數(shù)據(jù)庫）、紫菜屬其他種類的相應基因DNA序列信息，采用包含近20 000個基因探針的Agilent新型基因芯片，檢測、比較兩個條斑紫菜優(yōu)良新品系的差異表達基因，查找可能與其品系突出性狀表現(xiàn)相關的功能基因，為優(yōu)良品系遺傳學研究提供基礎依據(jù)。

1 ? ?材料和方法

1.1 ? ?樣品材料與RNA提取

用于試驗的樣本材料為國家紫菜種質庫保有，并為同時間、同一培育條件下的無污染自由絲狀體階段樣本。品系編號及特性見表1。

取樣本絲狀體組織50～250 mg，經(jīng)無菌水清洗干凈并吸去水分后，采用試劑盒mirVanaTM RNA Isolation Kit（Applied Biosystemp/n AM1556）提Total RNA。使用QIAGEN RNeasyR Kit純化總RNA。樣本的總RNA利用NanoDrop ND-2000（Thermo Scientific）定量，由Agilent Bioanalyzer2100（Agilent Technologies）檢測RNA完整性。

1.2 ? ?條斑紫菜Oligo芯片設計與訂制

從NCBI數(shù)據(jù)庫下載紫菜屬（Porphyra）的EST序列及Nucleotide序列等，結合文獻中預測的基因序列一起歸并，利用cdhit軟件處理，閾值設置為0.95，序列相似性在95%以上的保留最長的1條序列，得到非冗余序列21 855條用于探針設計。每條序列設計1條探針，共設計長度60 mer探針19 827條。隨機選取500條探針重復10次，其余19 327條探針重復2次，另有安捷倫（Agilent）對照探針數(shù)（陽性對照+陰性對照）1 417條。

1.3 ? ?芯片雜交與掃描

RNA質檢合格后，總RNA反轉錄成雙鏈cDNA，再進一步合成用Cyanine-3-CTP（Cy3）標記的cRNA。cRNA在配制好的片段化混合液中60 ℃溫浴30 min進行片段化，冰浴1 min，加入2X GEx Hybridization Buffer 混勻，上芯片，65 ℃、17 h、10 r·min-1滾動雜交。雜交后芯片于洗液中洗脫，利用Agilent Scanner G2505C（Agilent Technologies）掃描儀掃描，分辨率為5 μm，掃描儀自動以100%和10%PMT各掃描1次，兩次結果Agilent軟件可自動合并得到原始圖。

1.4 ? ?數(shù)據(jù)分析與差異表達基因篩選

采用Feature extraction 軟件（Version10.7.1.1， Agilent technologies）處理原始圖像提取原始數(shù)據(jù)，接著利用Genespring軟件（Version 12.5;Agilent technologies）進行Quantile標準化。標準化后的數(shù)據(jù)進行過濾，在用于比較的每組樣本中至少有一組100%標記為Detected的探針留下進行后續(xù)分析。

利用差異倍數(shù)Fold change（FC）值進行篩選，標準為FC值>= 2.0，表示組間差異倍數(shù)大于或等于2，負值表示下調，F(xiàn)C（abs）表示組間差異倍數(shù)的絕對值。對樣本結果進行比較，當FC（abs）大于 2 或小于 0.5 時，視為差異表達基因發(fā)生有意義表達變化。差異表達基因分別提交GO（GeneOniology）數(shù)據(jù)庫，按GO的3個Ontology，分別描述基因的分子功能（Molecular function，MF）、所處的細胞位置（Cellular component，CC）、參與的生物過程（Biological process，BP），對差異基因進行GO功能分類注釋，判定差異基因主要影響的生物學功能或通路。

2 ? ?結果與分析

2.1 ? ?芯片試驗結果評估

試驗制備的 RNA 的純度、濃度、完整性和總量均符合后續(xù)研究要求，見表2。另外，利用 Agilent 軟件對雜交芯片掃描圖進行質量分析，表明芯片樣本背景信號值與噪點值都在適當范圍內，芯片數(shù)據(jù)質量較高。芯片數(shù)據(jù)的散點圖評估得出各組數(shù)據(jù)總體分布趨勢正常。

2.2 ? ?差異表達基因篩選與GO富集分類

根據(jù)基因芯片上的序列信息，及在NCBI數(shù)據(jù)庫中查詢表達序列的功能信息，共獲得差異未篩選基因19 884個，其中有注釋基因10 913個（占54.88%）。表3為各組比較的結果統(tǒng)計，在3個樣本中皆有表達的差異基因為900個，其中注釋基因486個，C組差異表達基因數(shù)最多（1 710個），3組得到的差異表達基因總共有2 252個（表3）。從基因差異水平的分布統(tǒng)計表4中得出，A組差異水平最大，其下調表達幅度最大，C組上調表達基因最多。

利用基因富集分析與GO分類標準從CC、BP、MF等3方面對差異表達基因的功能注釋分類，結果表明：基因的GO富集結果主要表現(xiàn)在為MF和BP兩大類，其生物學功能均比較集中，主要與光合作用、蛋白質代謝等相關，同時不同組間的差異表達基因富集上各有側重，A組比較中，沒有屬于CC的基因分類，C組中沒有屬于MF的基因分類。

2.2.1 ? ?A組（06DO / L0601）的分析 ? ?兩樣本差異表達基因1 221個，占總基因（19 884個）表達比為6.14%。其中，得到注釋基因有617個，包括上調的252個基因（54.53%），及下調的有注釋基因365個（48.22%）（表3）。上調幅度FC≥10的注釋基因中，Cell wall-associated hydrolase表達量最大（412.98），其次是Reverse transcriptase family protein（210.22），Ankyrin repeat-containing protein（100.39），見表5。在上調幅度最大前50個基因中，有28個為蛋白質直接關系基因。在757個下調表達差異基因分布中，差異倍數(shù)小于-10的有104個（13.74%），小于-30的有32個，可見在L0601樣本中優(yōu)勢表達的基因數(shù)量較多，且處于較高水平。這些優(yōu)勢基因中有過半與蛋白質（Protein）直接相關，如：Zinc finger bed domain-containing protein 1-like（-39.23）、60s ribosomal protein（-41.04）、40s ribosomal protein（-39.61）、zinc transporter（-44.05）、 heat shock protein 70（HSP）（-33.53）。這些功能基因中，鋅指結構基因具很重要的調控功能，負責與DNA結合而改變基因的表現(xiàn)功能[8];核糖體蛋白質相關基因，主要參與蛋白質的生物合成;HSP則主要與抗旱、高溫等逆境脅迫密切聯(lián)系[9]，大量研究表明該基因的高水平表達有助于提高植物的耐熱性[10]，L0601為高溫脅迫篩選得到，在這方面具有更高優(yōu)勢。品種06DO在其它方面具有優(yōu)勢表達基因及表達水平，從這些差異表達基因中反映兩品系間差異性狀與蛋白質代謝密切聯(lián)系。

將這些差異表達基因通過GO分析獲得MF與BP兩大功能分類（圖1，圖2）。其中：屬于MF的有33類（62.26%），主要是DNA聚合酶、化合物活性及離子綁定等相關分子功能;屬于BP的有20類（37.74%），多種分子功能有序組成，主要包括有DNA復制、營養(yǎng)物質合成過程等。比較分析的結果表明有關CC的差異基因表達不明顯。

將33個MF中的GO基因集歸類到5條代謝通路，其中包括3個單一的代謝路徑，其一為：GO：0008270、GO：0043169、GO：0046872、GO：0046914及GO：0008270位于同一代謝路徑，以基因集GO：0043167末節(jié)（Ion binding）連接到GO：0005488（Binding）節(jié)點;其二為：GO：0003964、GO：0034061、GO：0016779、GO：0016772及GO：0016740（Ransferase activity），再連接到催化活性GO：0003824（Catalytic activity）節(jié)點;其三為：GO：0004190、GO：0004175（或GO：007001）、GO：0070011、GO：0008233及GO：0016787（Hydrolase activity），或由GO：0004519、GO：0004518、GO：0016788到GO：0016787。這些節(jié)點中，GO：0016740、GO：0016787、GO：0005488處于關鍵代謝位置。

BP中，主要功能分類多包括Macromolecule metabolic process（GO：0043170）、Nitrogen compound metabolic process （GO：0006807）及Organic cyclic compound metabolic process（GO：1901360），這些過程與高分子、氮或有機環(huán)狀化合物代謝相關;并且這些代謝路徑呈現(xiàn)相互交錯，處于較近層次。

2.2.2 ? ?B組（06DO /HAI）的分析 ? ?兩樣本差異表達基因共有1 598個，占篩選基因總數(shù)的8.04%，其中共有的差異表達基因為1 334個。有功能注釋的占56.82%（908個），690個未知功能基因（Unknown function）占到43.18%。FC≥5的差異表達基因218個;FC≥10的共有85個。

在有共表達的注釋780個差異基因中，與蛋白質合成相關基因占有較大比例，上調基因中前50個基因中有23個為蛋白質直接相關基因，包括：Protein product、Reverse transcriptase family protein，見表6;下調幅度最大的50個中，有33個與蛋白質直接相關，如：40s ribosomal proteins13-like、Retrotransposon-derived protein peg10-like、Pol polyprotein、Retrotransposonnucleocapsid protein等。這方面與A組結果相似，而且在上調或下調的差異表達基因中，有部分基因分別與A組相同的（表6中，標為灰色基因）。上調表達量最大的前50個基因中，有16個基因，如：Reverse transcriptase family protein，下調前50個基因中有12個相同，如40s ribosomal protein s13-like，這些基因可能與品系的優(yōu)勢作用基因或反映品系的性能趨勢;此外，06DO上調差異基因也同樣多在相對較低差異水平，只有4.32%的基因FC≥10;HAI中優(yōu)勢表達基因，其中有 6.47% 的基因FC≥10以上。

將差異表達的注釋基因（56.82%）進行GO 功能富集分類，有43.32% 屬于BP，共27類（占總的24.61%），主要涉及光合作用及營養(yǎng)鹽代謝方面（圖3）;52.65%屬于MF，共38類（占總的29.91%），主要涉及有機雜環(huán)化合物質合成、利用等（圖4）;只有3% 屬于CC（占總的1.7%），共有4類，包括：Chloroplast stroma、 Chloroplast、Plastid stroma及Apoplast等葉綠體及質體方面細胞組件。從這些GO富集得到的基因功能分類中也不少與A組的相同，如：BP中有10類相同的，MF中有11類功能相同的，見圖3、圖4。

2.2.3 ? ?C組（L0601/HAI）的結果分析 ? ?本組比較得到1 933個差異表達基因，其中有注釋的1 073個（55.56%）。兩者雖然有較多差異表達基因，但差異表達水平較低。其中，上調基因共表達的644個預測功能基因中，F(xiàn)C>10的有21個，F(xiàn)C >5的90個;下調的328個基因中，F(xiàn)C < -10的只有4個，F(xiàn)C < -5的有19個。上調或下調幅度最大的50個差異基因中，皆有過半為蛋白質直接相關基因，如Predicted protein，Actin，Zinc finger protein等（表7）。

從GO歸類得到的功能總共有12類，分屬于BP與CC，且均是與光合作用相關的細胞組件及生物學過程（見表8），這反映出樣品L0601與HAI的性狀較為相近。另外，從這兩樣本在分別與06DO的比較中發(fā)現(xiàn)也有不少相同的差異表達基因，這些相同的差異表達基因可能是各個品系的特色性狀相關的品系優(yōu)勢基因，如Zinc transporter、Zinc finger bed domain- containing protein 1-like、Zinc finger protein 524、Heat shock protein70、Fructose- bisphosphatase均在L0601中為優(yōu)勢基因。在B組與C組的比較中，HAI樣本均表現(xiàn)有較大優(yōu)勢基因的有：40s ribosomal protein s13-like、60s ribosomal protein、Cell wall-associated partial、Conserved domain protein、Desumoylatingisopeptidase 1-like、Elongation factor tugtp-binding domain-containing protein 1等。

3 ? ?結論與討論

基因芯片技術也稱DNA微陣列 （DNAmieroarray），可在短時間內平行地、大量地檢測基因表達水平的變化;通過對來源不同的個體、組織等的基因表達情況進行對比分析，對基因群在這些不同狀況下的變化特征進行描述，來分析比較差異基因的生物學意義。隨著微陣列芯片技術的成熟，基因芯片技術將被用來篩選作物的基因表達水平、基因突變及多態(tài)性，并尋找高產(chǎn)量、抗干旱的相關基因[11-13]。利用基因表達譜分析，結合代謝組學和蛋白組學研究，已在闡明植物抗逆機制和發(fā)掘植物逆境脅迫響應相關基因方面取得重要進展[14]。

生物的遺傳基因決定其生長、物候以及適應性差異。大型海藻的生長，涉及到眾多基因的表達與調控。周曉君等[15]選取 467個單個基因的 EST 制備cDNA表達譜芯片，研究不同世代的條斑紫菜基因表達差異，分析發(fā)現(xiàn) 55個基因在配子體中表達量上調，86個基因在孢子體中表達量上調。王孟強[16]利用462個位點的cDNA芯片研究了條斑紫菜配子體的在不同失水過程中的基因表達，結果有8.74%～11.09%的基因上調，而下調基因的數(shù)量在各個階段變化較大，同時得到了一批與抗失水脅迫相關的基因。為了研究條斑紫菜無性孢子形成過程中的基因表達，Kitade等[17]選擇 4 896 條非重復的 EST 作為探針，結合RT-PCR 或 Northern，分析了條斑紫菜4個不同發(fā)育階段的不同表達候選基因的特異表達。這些研究有助于開發(fā)適應于不同生境與品質需求的優(yōu)良新品種[18-19]。相比野生品系，童冠文通過遺傳力分析得出：5個條斑紫菜栽培品系的配子體長寬比性狀的差異、單位面積濕質量、干質量以及干濕質量比主要跟品系本身有關[20]。而利用基因芯片檢測差異基因表達情況，是一種查找、鑒定相關功能基因，分析品系特色性狀的分子機制的高效技術方法。

本文中兩個優(yōu)良新品系06DO與L0601，系江蘇南通條斑紫菜主產(chǎn)區(qū)人工栽培群體選育的、具有明顯特色的優(yōu)良栽培新品。品系L0601的出苗效果、抗逆水平及栽培生長性狀等均表現(xiàn)良好;06DO新品種具有原藻色澤深、品質優(yōu)良及增產(chǎn)表現(xiàn)等特征。通過以本地優(yōu)勢原種HAI為對照進行比較分析，采用品系在實驗室培育的無污染自由絲狀體樣本，初步分析品系在孢子體階段的基因差異表達。由于06DO是通過誘變獲得，與對照樣本差異最多（見表4），其FC小于-10的下調基因有104個。B與A兩組中，上調或下調的差異表達基因皆有部分相同，上調基因中皆有大量與蛋白質合成等有直接關系的，在下調基因中均有60s ribosomal protein、Heat shock protein等，但差異基因的表達水平及頻率分布均不同;兩組基因集的GO分類也各有異同點，根據(jù)其功能推測與藻類耐旱機理相關，如光合作用相關基因Polyubiquitin等（表5）。由于品系的不同遺傳特性，L0601與 HAI相比較基因差異表達水平較低，且歸集的生物學功能簡單。

目前，紫菜屬已知基因序列信息仍有限，本研究中雖然獲得大量差異基因，但有43.18%基因屬未知功能。楊惠把獲得的序列與數(shù)據(jù)庫比對之后發(fā)現(xiàn)，有 56.6%的Unigene沒有找到同源序列[21]。隨著越來越多的植物全基因組測序的完成，許多重要的功能基因得到克隆和功能解析，為作物改良提供了豐富的基因資源，將對經(jīng)濟植物種類產(chǎn)量、品質、抗性等性狀的改良起到越來越重要的作用[22]。

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