• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    草莓應(yīng)答炭疽菌侵染的轉(zhuǎn)錄組分析

    2020-06-08 10:55:23陳哲黃靜趙佳梁宏
    植物保護(hù) 2020年3期
    關(guān)鍵詞:差異表達(dá)基因草莓

    陳哲 黃靜 趙佳 梁宏

    摘要 本研究以栽培草莓為材料,用炭疽菌對植株進(jìn)行侵染,對健康草莓和患病草莓進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析(RNA-seq),共得到86 988個(gè)序列以及2 127個(gè)差異表達(dá)基因。利用GO數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)基因進(jìn)行了聚類分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要聚類在光合作用、氧化還原過程、氧化還原酶活性、碳固定過程以及糖代謝過程等方面。同時(shí),利用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)基因影響的通路進(jìn)行注釋后發(fā)現(xiàn),炭疽菌侵染主要影響了光合作用、倍半萜和三萜生物途徑、類黃酮生物合成、谷胱甘肽代謝和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)水平。挑選了20個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR,結(jié)果有19個(gè)基因的表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄測序結(jié)果一致。本研究獲得的草莓應(yīng)答炭疽菌侵染轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息,將有助于豐富草莓抗炭疽病的調(diào)控機(jī)制。

    關(guān)鍵詞 草莓; 炭疽菌; 轉(zhuǎn)錄組分析; 差異表達(dá)基因

    中圖分類號(hào): S 436.63

    文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A

    DOI: 10.16688/j.zwbh.2019096

    Transcriptomics analysis of strawberry response to

    Colletotrichum theobromicola infection

    CHEN Zhe, HUANG Jing, ZHAO Jia, LIANG Hong

    (Biotechnology Research Center, Shanxi Academy of Agriculture Sciences, Taiyuan 030031, China)

    Abstract

    In this study, we analyzed the response of strawberry plants(Fragaria×ananassa) to infection with Colletotrichum theobromicola using the next-generation sequencing (RNA-seq) and investigated the alterations in gene expression between the healthy and infected plants. We have identified 86 988 unigenes, of which 2 127 were differentially expressed in the fungi-infected plants (DEGs). The unigenes were annotated and classified with Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) analyses. The DEGs annotated to the GO database were distributed in many functional types, including photosynthesis, oxidation-reduction process, oxidoreductase activity and growth, development and metabolism. The KEGG pathway analysis of these genes suggested that strawberry disease caused by C.theobromicola may affect multiple processes including photosynthesis, sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis, flavonoid biosynthesis, glutathione metabolism and plant hormone signal transduction. In order to validate our DGE data, 20 DEGs with annotations were selected for qRT-PCR analysis. Among them,19 out of 20 DGEs exhibited a consistent expression pattern between RNA-Seq and qRT-PCR.The comprehensive transcriptome information obtained in this study will help to understand the regulatory mechanisms involved in strawberry response to C.theobromicola infection.

    Key words

    strawberry; Colletotrichum theobromicola; transcriptomics analysis; differentially expressed genes

    炭疽病的病原菌為炭疽菌屬Colletotrichum的多種真菌[1],其中可以侵染草莓的病原菌多是C.acutatum復(fù)合種[2](C.nymphaeae、C.cuscutae、C.godetiae、C.salicis和C.simmondsii)和C.gloeosporioides復(fù)合種[3](C.fructicola和C.theobromicola)。炭疽病可在草莓、蘋果、梨、棗、柑橘和虎耳草等多種植物中發(fā)生,給這些植物的生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。近年來,炭疽病在草莓生產(chǎn)中發(fā)生日趨嚴(yán)重,已經(jīng)成為草莓苗期甚至整個(gè)生長期的主要病害,是設(shè)施草莓移栽后成活率低的主要原因之一,給草莓生產(chǎn)帶來了嚴(yán)重影響。目前, 生產(chǎn)上針對炭疽病的防治主要有化學(xué)防治及一些微生物防治的方法,前者易造成藥物殘留、環(huán)境污染等問題,后者則往往以預(yù)防為主。種植抗性品種是防治草莓炭疽病最根本的方法,這樣才能從源頭上解決炭疽病侵染[4]。

    植物在逆境脅迫下,轉(zhuǎn)錄水平上的基因表達(dá)會(huì)發(fā)生很大的改變。近年來轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(RNA-seq)發(fā)展成為研究逆境應(yīng)答、挖掘新基因及代謝途徑確定的重要技術(shù)之一[5]。張明偉等研究發(fā)現(xiàn)野生稻基因?qū)胂礧6023在受到白葉枯菌侵染后,差異表達(dá)基因主要富集在次生代謝產(chǎn)物的生物合成、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及糖代謝途徑等方面,并從中挖掘出了多個(gè)抗病基因[6]。劉之慧等發(fā)現(xiàn),不同配比的紅藍(lán)光對草莓組培苗有機(jī)物的積累與代謝、光合作用、葉綠素的產(chǎn)生與代謝、植物激素的產(chǎn)生均有明顯作用[7]。張小芳等發(fā)現(xiàn)耐旱型野生大豆受到干旱脅迫后,其差異表達(dá)基因廣泛涉及糖、脂類、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子代謝、能量代謝以及次生代謝過程,代謝途徑則涉及植物-病原體互作、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA降解和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等[8]。

    本研究用膠孢炭疽菌侵染草莓根部,待草莓發(fā)病后,對健康草莓和患病草莓進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,找到二者在轉(zhuǎn)錄水平基因表達(dá)的差異,分析參與植物抗病過程的相關(guān)基因和途徑,為草莓抗病品種的選育提供一些理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 供試草莓和炭疽菌菌株供試草莓品種為‘紅顏。

    供試真菌草莓炭疽菌C.theobromicola TAN-9為中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院張國珍老師贈(zèng)送。

    1.2 培養(yǎng)基

    PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂15~20 g,蒸餾水1 000 mL,自然pH。

    1.3 病原菌侵染試驗(yàn)

    將健康、生長狀態(tài)一致的2葉1心草莓幼苗移植到滅菌基質(zhì)中,處理組(D)和對照組(CK)各15株。待移苗成功10 d后對處理組草莓進(jìn)行傷根處理,并澆灌濃度為1×106 個(gè)/mL草莓炭疽菌TAN-9的孢子懸浮液;對照組澆灌無菌水。此后,結(jié)合草莓生長狀態(tài)和基質(zhì)干濕情況,每隔5~7 d進(jìn)行補(bǔ)施病原菌,一共澆灌3次。

    在處理組接種病原菌50 d后進(jìn)行樣品采集?;疾∪~柄的選擇:截取包含病斑的10 mm長的葉柄段,病斑長度為5.1~10.0 mm。每株草莓只收集1個(gè)葉柄,5株草莓即5個(gè)葉柄段為1組,處理組和對照組各3組重復(fù)。采集到的樣品在液氮迅速冷凍,-80℃冷藏備用。

    1.4 轉(zhuǎn)錄組分析

    1.4.1 草莓葉柄RNA提取

    將采取的樣品用干冰盒包裝好,送上海派森諾生物科技股份有限公司提取 RNA和測序。利用瓊脂糖凝膠電泳和Agilent 2100 Bioanalyzer檢測RNA完整性。

    1.4.2 草莓葉柄cDNA文庫構(gòu)建和質(zhì)控

    用Oligo(dT)磁珠富集總RNA中帶有polyA結(jié)構(gòu)的mRNA,采用離子打斷的方式,將RNA打斷成200~300 bp片段。以RNA為模板,用6堿基隨機(jī)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈,并以第一鏈cDNA為模板合成第二鏈cDNA,第二鏈cDNA合成時(shí),其中的堿基T,被替換成U,從而達(dá)到鏈特異性文庫的目的。

    文庫構(gòu)建完成后,采用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫片段富集,之后根據(jù)片段大小進(jìn)行文庫選擇,文庫大小在300~400 bp。接著,通過Agilent 2100 Bioanalyzer對文庫進(jìn)行質(zhì)檢,再對文庫總濃度及文庫有效濃度進(jìn)行檢測。然后根據(jù)文庫的有效濃度以及文庫所需數(shù)據(jù)量,將含有不同Index序列的文庫按比例進(jìn)行混合。混合文庫統(tǒng)一稀釋到2 nmol/L,通過堿變性,形成單鏈文庫。

    1.4.3 高通量測序

    草莓葉柄的轉(zhuǎn)錄組分析: 利用第二代測序技術(shù),基于Illumina HiSeq測序平臺(tái),對庫進(jìn)行雙末端 (paired-end,PE)測序。將測序得到的原始讀序(raw reads)經(jīng)過截除reads中的測序接頭以及引物序列,過濾低質(zhì)量值數(shù)據(jù)等處理,獲得高質(zhì)量的干凈讀序(clean reads),確保數(shù)據(jù)質(zhì)量。進(jìn)行堿基組成和堿基質(zhì)量分析,控制數(shù)據(jù)質(zhì)量。

    提取每個(gè)基因下最長的轉(zhuǎn)錄本作為該基因的代表序列,稱為Unigene。對 Unigene 進(jìn)行基因功能注釋?;蚬δ茏⑨屗玫降臄?shù)據(jù)庫包括NR(NCBI non-redundant protein sequences)、GO (gene ontology)、KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genome)、eggNOG(evolutionary genealogy of genes: non-supervised orthologous groups)、Swiss-Prot。

    1.4.4 差異基因的篩選

    采用DESeq對基因表達(dá)進(jìn)行差異分析,篩選差異表達(dá)基因條件為:表達(dá)差異倍數(shù)|log2FoldChange|>1,顯著性 P-value<0.05。

    1.4.5 差異表達(dá)基因的GO功能顯著性富集分析

    采用BLAST2 GO軟件將差異基因映射到GO數(shù)據(jù)庫的各個(gè)分類,計(jì)算每個(gè)分類中的差異基因數(shù)目,以整個(gè)基因組為背景,采用超幾何分布計(jì)算差異基因顯著富集的GO分類信息。

    1.4.6 差異表達(dá)基因的 KEGG 通路富集顯著性分析

    將差異基因與KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,獲得差異表達(dá)基因主要參與的代謝途徑和信號(hào)通路。以整個(gè)基因組為背景,采用超幾何分布計(jì)算差異基因顯著富集的通路。

    1.4.7 差異表達(dá)基因的熒光定量PCR(qRT-PCR)驗(yàn)證

    綜合分析NCBI數(shù)據(jù)庫,并結(jié)合本研究轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)提供的信息,對轉(zhuǎn)錄組中20個(gè)可能與植物抗性或者病原菌侵染過程等機(jī)制相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析,并對其進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。

    利用 Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)qPCR引物,以草莓β-actin作為內(nèi)參基因(表1)。用PrimeScriptTM 1st stand cDNA Synthesis Kit將檢測合格并定量的草莓葉柄總RNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。熒光定量PCR反應(yīng)體系(20 μL): cDNA 1 μL、上下游引物各 0.8 μL、2×SYBR real-time PCR premixture 10 μL,加超純水補(bǔ)足至20 μL。熒光定量PCR的擴(kuò)增條件為 95℃預(yù)變性5 min,95℃變性 15 s,60℃延伸 30 s,循環(huán) 40 次。每份樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。整個(gè)流程由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 病原菌侵染草莓植株

    ‘紅顏草莓在接種病原菌45 d后,葉柄開始發(fā)病,在接種50 d后處理組中超過半數(shù)的草莓葉柄出現(xiàn)了明顯的紅褐色病斑(圖1),此時(shí)采集樣品進(jìn)行分析。

    2.2 測序數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

    通過RNA-seq技術(shù)對健康草莓葉柄(CK1、CK2、CK3)和患病草莓葉柄(D1、D2、D3)的6個(gè)樣品進(jìn)行分析,獲得的序列數(shù)據(jù)見表2。

    將上述序列進(jìn)行拼接和分析,共獲得86 988個(gè)Unigene序列。 分別在NR數(shù)據(jù)庫、GO數(shù)據(jù)庫、KEGG數(shù)據(jù)庫、eggNOG數(shù)據(jù)庫和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中對Unigene序列進(jìn)行比對分析,發(fā)現(xiàn)有4 364個(gè)序列全部獲得注釋(表3)。

    2.3 差異表達(dá)基因的篩選

    將健康草莓葉柄(CK)與患病草莓葉柄(D)的差異基因進(jìn)行雙向聚類分析(圖2),結(jié)果顯示聚類結(jié)果良好。對二者差異基因的表達(dá)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),顯著差異表達(dá)基因的數(shù)目是2 127個(gè),其中上調(diào)表達(dá)數(shù)量是1 021個(gè),下調(diào)表達(dá)基因數(shù)量是1 106個(gè),上調(diào)表達(dá)基因數(shù)量略低于下調(diào)表達(dá)基因。大量的基因在草莓響應(yīng)炭疽病時(shí)呈現(xiàn)差異表達(dá)模式,表明草莓響應(yīng)炭疽病是多基因共同作用的復(fù)雜過程。

    2.4 差異表達(dá)基因的GO富集分析

    對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO數(shù)據(jù)庫分析,一共比對到了1 122個(gè)GO功能條目,篩選出p值小于0.01的68個(gè)條目進(jìn)行后續(xù)分析。 這68個(gè)條目分為3大類功能,生物學(xué)過程(biological process)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function),每類功能分別包括26個(gè)、14個(gè)和10個(gè)功能亞組,圖3展示了每類功能之下的10個(gè)功能亞分組。

    分析發(fā)現(xiàn),感染炭疽菌的草莓葉柄的光合作用過程受到了極大的影響,這一結(jié)果和病癥相對應(yīng)。炭疽菌侵染到草莓葉柄處,逐漸積累到一定程度時(shí)會(huì)在葉柄外部出現(xiàn)紅褐色病斑,嚴(yán)重影響正常的光合作用,進(jìn)而草莓的很多生長代謝過程也會(huì)出現(xiàn)異常。分子功能中的氧化還原酶活性功能,還有生物學(xué)過程中的氧化還原過程都富集了大量的差異表達(dá)基因等,這二者都是植物抗逆反應(yīng)中重要的環(huán)節(jié)[9],說明在草莓應(yīng)答炭疽病的過程中,氧化還原反應(yīng)很可能發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用。

    2.5 差異表達(dá)基因的 Pathway 富集分析

    利用KEGG數(shù)據(jù)庫可以分析差異表達(dá)基因參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。本研究中有556個(gè)DEGs映射到154個(gè)pathway,圖4中展示差異顯著的前20個(gè)通路,包括光合作用、碳代謝、光合生物中的碳固定、光合作用觸角蛋白質(zhì)、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、類黃酮生物合成、谷胱甘肽代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、牛磺酸和次?;撬岽x、氨基酸的生物合成、苯丙醇生物合成、細(xì)胞色素P450對外源物的代謝、藥物代謝細(xì)胞色素P450、乙醛和二羧酸代謝、甲烷代謝、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、糖酵解/糖異生、戊糖磷酸途徑以及倍半萜和三萜生物合成。

    從差異表達(dá)基因的富集程度可以看出,其主要還是集中在植物正常生長的代謝途徑中,包括光合作用、牛磺酸和次?;撬岽x、倍半萜和三萜生物途徑等,這表明病原菌的入侵嚴(yán)重干擾了植物的正常生長,尤其是光合作用。同時(shí),與植物抵御非生物及生物脅迫有關(guān)的途徑,包括類黃酮生物合成、谷胱甘肽代謝以及植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)都有差異表達(dá)基因的富集,而在類黃酮途徑中更是有超過三分之一的基因出現(xiàn)了變化,充分說明炭疽菌侵染后,觸發(fā)了草莓體內(nèi)的抗性反應(yīng)[1011],而類黃酮途徑可能起到了關(guān)鍵性的作用。

    2.6 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

    利用實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證,選取了20個(gè)基因進(jìn)行驗(yàn)證。分析結(jié)果顯示(圖5),有19個(gè)差異表達(dá)基因的表達(dá)趨勢和轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致,表明 RNA-Seq 分析結(jié)果可靠。雖然差異基因的表達(dá)倍數(shù)略有不同,但這可能與兩種檢測方法的檢測范圍和靈敏度不同有關(guān)。

    19個(gè)差異表達(dá)基因中包含10個(gè)上調(diào)基因和9個(gè)下調(diào)基因。上調(diào)基因包括:1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶(ACS)、2-氨基乙硫醇雙加氧酶(ADO)、過氧化物酶21(POD21)、無色花色苷雙加氧酶(LDOX)、查爾酮合酶(FrCHS5)、查爾酮黃酮異構(gòu)酶3(CHI3)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶F11(GST F11)、MYB、苯丙氨酸解氨酶1(PAL1)和呼吸爆發(fā)氧化酶同源蛋白A(RhoA);下調(diào)基因有:NF-X1型鋅指蛋白(NF-XL1)、色氨酸合酶α鏈(trpA)、生長素誘導(dǎo)蛋白15A(AX15A)、細(xì)胞分裂素脫氫酶5(CKX5)、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亞基(gpL2)、類胡蘿卜素雙加氧酶4(CCD4)、9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶1(NCED1)、核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(rbcL)和葉綠體果糖-1,6-二磷酸酶Ⅰ(cfbI)。

    從表達(dá)量上分析,在上調(diào)和下調(diào)基因中各有3個(gè)表達(dá)量倍數(shù)超過40倍的基因。ACS、POD21和ADO基因,在處理組中表達(dá)倍數(shù)分別是對照組的927、586和326倍;而trpA、AX15A和CKX5在對照組的表達(dá)量則是處理組的49、252和271倍。

    3 討論

    草莓炭疽病是草莓在生長期內(nèi)面臨的主要威脅之一[1213],直接影響其生長發(fā)育,給草莓產(chǎn)量和品質(zhì)帶來極大危害,培育抗炭疽病的草莓品種是防控病害的最直接有效的方法,能從源頭上預(yù)防炭疽病的發(fā)生[14]。病原菌在侵入寄主植物后,二者在共同進(jìn)化及相互識(shí)別過程中形成了錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系。病原菌從植物獲得營養(yǎng)的同時(shí)也激發(fā)了植物體內(nèi)一系列生理生化反應(yīng),增強(qiáng)其抗病性,從而達(dá)到抵制病原菌入侵的目的。近年來,越來越多的研究者從轉(zhuǎn)錄組水平上揭示植物抗病系統(tǒng)中的代謝通路以及分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò),不僅有助于篩選與鑒定關(guān)鍵作用基因,也為抗病性育種提供了有力支持[1517]。

    本研究利用高通量測序手段,在轉(zhuǎn)錄組水平上分析健康草莓葉柄和患炭疽病草莓葉柄的差異表達(dá)基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn)草莓應(yīng)答病原菌的過程中,共有2 127個(gè)基因表達(dá)出現(xiàn)顯著差異,其中有1 021個(gè)差異基因的表達(dá)水平顯著升高,1 106個(gè)差異基因的表達(dá)水平顯著下降。GO數(shù)據(jù)庫和KEGG數(shù)據(jù)庫分析顯示,當(dāng)炭疽病菌在進(jìn)入草莓體內(nèi)后,草莓植株的正常生長受到了極大的影響,多個(gè)代謝通路的基因表達(dá)發(fā)生了改變。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組差異基因分析結(jié)果,挑選了20個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR檢測,有19個(gè)基因的表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致,說明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)真實(shí)可靠,可以進(jìn)行后續(xù)分析。通過差異基因和代謝通路進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)本研究中‘紅顏草莓應(yīng)答炭疽菌主要涉及活性氧的平衡調(diào)節(jié)、乙烯的生物合成以及植物正常發(fā)育等生理過程。

    3.1 活性氧平衡與草莓應(yīng)答炭疽病密切相關(guān)

    正常條件下,植物體內(nèi)活性氧 ROS 的生成和清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài),當(dāng)植物遭遇脅迫時(shí),穩(wěn)態(tài)被破壞,大量的 ROS (主要由NADPH氧化酶催化產(chǎn)生,NADPH氧化酶由Rbohs編碼合成[18])迅速累積,使植物細(xì)胞受到氧化損傷[19]。為了維持平衡,植物會(huì)通過兩種方式清除活性氧,第一種是酶促清除系統(tǒng),通過抗氧化酶(SOD、GST、CAT和POD等)將活性氧分解;第二種是非酶系統(tǒng)的抗氧化次級(jí)代謝物,他們可以與活性氧發(fā)生反應(yīng),直接清除ROS,例如多酚、類黃酮、類胡蘿卜素等[20]。

    根據(jù)本研究結(jié)果,我們認(rèn)為草莓接種炭疽菌后,上述兩種方式都會(huì)開始工作,進(jìn)行活性氧的清除。在酶促清除系統(tǒng)中,草莓主要通過體內(nèi)過氧化物氧化酶POD21來進(jìn)行。POD是活性氧酶促清除系統(tǒng)中常見的酶,可以分解體內(nèi)產(chǎn)生的H2O2,它與植物的抗逆境能力有著密切的聯(lián)系。大豆在重度干旱脅迫下,葉片內(nèi)POD活性最高[21];馬鈴薯[22]和番茄[23]在受到病原菌侵染后,葉片POD活性較未接種對照均有顯著提高。在本試驗(yàn)中其表達(dá)量在炭疽菌侵染后升高到對照的586倍,足以證明POD21在活性氧清除過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用。

    在第二種方式中,草莓體內(nèi)主要起作用的則是類黃酮物質(zhì)。類黃酮代謝途徑是植物抵抗病原菌的防衛(wèi)反應(yīng)之一,有實(shí)驗(yàn)證實(shí),海島棉在接種枯萎病菌之后,類黃酮代謝通路中的多個(gè)相關(guān)基因表達(dá)量發(fā)生了顯著升高,同時(shí)認(rèn)為此通路與海島棉的抗性相關(guān)[24]。在本試驗(yàn)中,類黃酮代謝途徑(包括上游的苯丙烷類代謝途徑)的相關(guān)基因PAL1、LDOX、FrCHS5與CHI3均在處理組中發(fā)生了上調(diào),因此推測當(dāng)草莓受到病原菌侵染,上述基因發(fā)生上調(diào),加速了類黃酮物質(zhì)[10]的積累,從而清除ROS,維持ROS的平衡,緩解了炭疽菌給植物帶來的氧化傷害,增強(qiáng)了草莓對病菌的抗性。

    值得注意的是,草莓被炭疽菌侵染后,2-氨基乙硫醇雙加氧酶ADO的表達(dá)量上升到對照的326倍。ADO可以將半胱氨酸氧化成次牛磺酸(hypotaurine, HT),后者在動(dòng)物體內(nèi)是一種強(qiáng)抗氧化劑[25];盡管次?;撬嵩谥参镏械难芯亢苌?,但是也有類似的作用。有研究證實(shí),水稻幼苗經(jīng)過HT的處理能夠降低堿脅迫下葉片中活性氧的積累,緩解其對幼苗生長的抑制作用[26]。ADO表達(dá)量的大量增加,很可能預(yù)示著其在應(yīng)答過程中會(huì)起到一定的關(guān)鍵作用,所以說其作用機(jī)制是值得關(guān)注的一個(gè)新的研究點(diǎn),它能否對活性氧平衡發(fā)揮作用則需要進(jìn)一步的研究探索。

    3.2 ACS在草莓應(yīng)答炭疽病中發(fā)揮作用

    乙烯是植物體內(nèi)一種重要的氣態(tài)激素,參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的多個(gè)過程,也在植物響應(yīng)生物和非生物脅迫過程中起重要的調(diào)控作用。ACS是乙烯生物合成過程的關(guān)鍵調(diào)控酶,它催化SAM(S-腺苷甲硫氨酸)合成乙烯前體ACC(1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸),ACC在 ACC氧化酶的作用下氧化生成乙烯。耿夙的研究發(fā)現(xiàn),在輪紋病菌侵染蘋果果實(shí)后,ACS5a、ACS5b、ACS4被大量誘導(dǎo)表達(dá),乙烯也被大量誘導(dǎo)合成[27]。這和本研究結(jié)果類似,當(dāng)炭疽菌侵染草莓后,ACS基因的表達(dá)量驟然上升到對照的927倍,是所有差異表達(dá)基因中表達(dá)倍數(shù)最高的基因。推測ACS基因的顯著上調(diào)會(huì)導(dǎo)致ACC的過表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)乙烯的合成,而乙烯的累積會(huì)促進(jìn)草莓體內(nèi)逆境脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,起到防御炭疽菌侵害的作用[28]。

    3.3 植物正常生長受到抑制

    色氨酸合酶由兩個(gè)不同的亞基組成,α-亞基和β-亞基依次催化色氨酸生物合成的最后兩個(gè)步驟[29],并且色氨酸合酶還參與了甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝以及苯丙氨酸和酪氨酸的生物合成;生長素誘導(dǎo)蛋白基因編碼合成植物特有的生長素響應(yīng)蛋白 SAUR (small auxin up RNA),而且此基因在生長旺盛的部位表達(dá)量要高于其他部位[30];細(xì)胞分裂素脫氫酶是分解細(xì)胞分裂素的唯一降解酶[3132]。因此,我們推測,當(dāng)炭疽菌侵染草莓后,草莓體內(nèi)涉及正常生長的一些基因發(fā)生了重大改變。色氨酸合酶 α鏈基因trpA的下調(diào),表明色氨酸合酶α-亞基會(huì)受到影響,進(jìn)而影響植物體內(nèi)包括色氨酸在內(nèi)的多個(gè)氨基酸的合成和代謝;AX15A的顯著下調(diào)會(huì)導(dǎo)致SAUR的缺乏,無法響應(yīng)生長素信號(hào);而CKX 5表達(dá)量的下降,導(dǎo)致細(xì)胞分裂素在草莓體內(nèi)失去代謝平衡。所以,這3個(gè)基因的顯著下調(diào),影響了植物激素和氨基酸代謝途徑,最終導(dǎo)致草莓的生長受到阻礙,出現(xiàn)植株矮小、根系不發(fā)達(dá)等現(xiàn)象。

    本文通過RNA-seq分析和qRT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)了一些與草莓應(yīng)答炭疽病相關(guān)的差異表達(dá)基因,其中表達(dá)量有顯著差異的基因有6個(gè),分析推測這些差異基因可能在活性氧平衡、乙烯合成以及植物正常生長過程發(fā)揮了重要作用。那么,這些基因在草莓應(yīng)答病原菌過程中是怎樣發(fā)揮作用的,其調(diào)控機(jī)制又是什么,它們之間又會(huì)形成怎樣的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò),尤其是次?;撬嵩谥参锘钚匝跚宄^程中所起到的作用是十分值得研究的,所以我們需要進(jìn)一步開展分子試驗(yàn)來解決這些深層次的問題。轉(zhuǎn)錄組分析為深入研究植物病原菌互作提供了良好的平臺(tái)[33],可以從整體上了解患病草莓與健康草莓在轉(zhuǎn)錄組水平上的差異表達(dá)基因,有助于挖掘草莓防御炭疽病菌的關(guān)鍵基因,為研究草莓應(yīng)答炭疽病的分子機(jī)理提供重要的基因資源,從而為抗性草莓品種的選育提供有力的科學(xué)理論。

    參考文獻(xiàn)

    [1] 陳哲, 黃靜, 趙佳, 等. 防治草莓炭疽病的芽胞桿菌組合的篩選[J]. 中國生物防治學(xué)報(bào), 2018, 34(4): 582588.

    [2] DAMM U, CANNON P F, WOUDENBERG J H C, et al. The Colletotrichum acutatum species complex [J]. Studies in Mycology, 2012, 73(1):37113.

    [3] WEIR B S, JOHNSTON P R, DAMM U. The Colletotrichum gloeosporioides species complex [J]. Studies in Mycology, 2012, 73(1):115180.

    [4] CHEN Jing, ZHANG Hanping, FENG Mingfeng, et al. Transcriptome analysis of woodland strawberry (Fragaria vesca) response to the infection by strawberry vein banding virus (SVBV) [J]. Virology Journal, 2016, 13(1): 128.

    [5] 張健, 唐露, 張雅潔, 等. 轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在植物水淹脅迫研究中的應(yīng)用[J]. 分子植物育種: 2019(2): 113.

    [6] 張明偉, 徐飛飛, 郝巍, 等. 野生稻基因?qū)胂礧6023對白葉枯菌的抗譜及轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2017, 18(2): 298309.

    [7] 劉之慧, 蔡雯婷, 董清華. 紅藍(lán)光處理草莓組培苗的轉(zhuǎn)錄組測序與分析[J]. 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào), 2017, 32(4): 2835.

    [8] 張小芳, 王冰冰, 徐燕, 等. PEG模擬干旱脅迫下野生大豆轉(zhuǎn)錄組分析[J]. 大豆科學(xué), 2018, 37(5): 681689.

    [9] 劉洪博, 劉新龍, 蘇火生, 等. 干旱脅迫下割手密根系轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 50(6): 11671178.

    [10]潘媛, 陳大霞, 宋旭紅, 等. 基于轉(zhuǎn)錄組測序挖掘國槐花蕾黃酮類物質(zhì)生物合成相關(guān)基因[J]. 中國中藥雜志, 2018, 43(13): 26822689.

    [11]張亞真, 張芬, 王麗鴛, 等. 植物谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶在類黃酮累積中的作用[J]. 植物生理學(xué)報(bào), 2015, 51(11): 18151820.

    [12]谷春艷, 蘇賢巖, 楊雪, 等. 解淀粉芽胞桿菌WH1G與咪鮮胺協(xié)同防治草莓炭疽病[J]. 植物保護(hù), 2018, 44(2): 184189.

    [13]馬世龍, 王國良, 趙君, 等. 大棚‘紅頰草莓病害控制關(guān)鍵技術(shù)[J]. 現(xiàn)代園藝, 2017(6): 6566.

    [14]NAMAI K, MATSUSHIMA Y, MORISHIMA M. Resistance to anthracnose is decreased by tissue culture but increased with longer acclimation in the resistant strawberry cultivar [J]. Journal of General Plant Pathology, 2013, 79(6): 402411.

    [15]梁國平, 李文芳, 馬宗桓, 等. 基于轉(zhuǎn)錄組研究葡萄糖對葡萄試管苗碳代謝的影響[J]. 園藝學(xué)報(bào), 2019, 46(1): 121134.

    [16]王冕. 花生應(yīng)答果腐病病原菌侵染的轉(zhuǎn)錄組和miRNAs研究及抗性相關(guān)基因克隆[D]. 泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2018.

    [17]楊仕美, 喬光, 毛永亞, 等. 基于火龍果轉(zhuǎn)錄組測序的SSR標(biāo)記開發(fā)及種質(zhì)親緣關(guān)系分析[J]. 分子植物育種, 2018, 16(24): 80968110.

    [18]ZHANG Yunting, LI Yali, HE Yuwei, et al. Identification of NADPH oxidase family members associated with cold stress in strawberry [J]. FEBS Open Bio, 2018, 8(4): 593605.

    [19]郭鵬飛, 雷健, 羅佳佳, 等. 柱花草苯丙氨酸解氨酶(SgPALs)對生物脅迫與非生物脅迫的響應(yīng)[J].熱帶作物學(xué)報(bào),2019,40(9):17421751.

    [20]王福祥, 肖開轉(zhuǎn), 姜身飛, 等. 干旱脅迫下植物體內(nèi)ROS的作用機(jī)制[J].科學(xué)通報(bào),2019,64(17):17651779.

    [21]王文佳,李爽,馬澤眾,等.水分脅迫對春大豆葉片保護(hù)酶活性及相對電導(dǎo)率的影響[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2019,35(11):1418.

    [22]胡耀華, 李清宇, 唐翊. 基于高光譜的晚疫病脅迫下馬鈴薯葉片的過氧化物酶活性檢測[J]. 江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2018, 39(6): 683688.

    [23]張菁, 連清貴, 陳婧, 等. 淡紫擬青霉QLP12對感染灰霉病后番茄植株的促生作用及抗病相關(guān)酶活性變化[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2018, 45(5): 10881095.

    [24]黃啟秀,曲延英,姚正培,等. 海島棉枯萎病抗性與類黃酮代謝途徑基因表達(dá)量的相關(guān)性[J].作物學(xué)報(bào),2017,43(12):17911801.

    [25]TERRIENTE-PALACIONS C, DIAZ I, CASTELLARI M. A validated ultra-performance liquid chromatography with diode array detection coupled to electrospray ionization and triple quadrupole mass spectrometry method to simultaneously quantify taurine, homotaurine, hypotaurine and amino acids in macro-and microalgae [J].Journal of Chromatography A, 2019,1589:8392.

    [26]祝一文,車永梅,趙方貴,等.堿脅迫下H2S參與活性氧代謝和水稻幼苗生長的調(diào)控[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2018,26(7):11241131.

    [27]耿夙. 輪紋病致病菌Botryosphaeria dothidea侵染對蘋果抗性反應(yīng)、乙烯合成和相關(guān)基因表達(dá)的影響[D].泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2016.

    [28]張弢, 董春海. 乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其在植物逆境響應(yīng)中的作用[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2016, 32(10): 1117.

    [29]FLEMING J R, SCHUPFNER M, BUSCH F, et al. Evolutionary morphing of tryptophan synthase: functional mechanisms for the enzymatic channeling of indole [J]. Journal of Molecular Biology, 2018:50675079.

    [30]張歡,楊英杰,李鼎立,等.杜梨根莖葉特異表達(dá)基因的RNA-Seq分析[J].園藝學(xué)報(bào),2018,45(10):18811894.

    [31]張晨, 鄭偉, 周濤, 等. 太子參細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶基因PhCKX的克隆及表達(dá)分析[J]. 分子植物育種, 2018, 16(19): 62426249.

    [32]李志康,嚴(yán)冬,薛張逸,等.細(xì)胞分裂素對植物生長發(fā)育的調(diào)控機(jī)理研究進(jìn)展及其在水稻生產(chǎn)中的應(yīng)用探討[J].中國水稻科學(xué),2018,32(4):311324.

    [33]ZANARDO L G, DE SOUZA G B, ALVES M S. Transcriptomics of plant-virus interactions: a review [J]. Theoretical and Experimental Plant Physiology. 2019, 31:103125.

    (責(zé)任編輯:田 喆)

    收稿日期: 20190302?? 修訂日期: 20190511

    基金項(xiàng)目:山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院特色農(nóng)業(yè)技術(shù)攻關(guān)項(xiàng)目(YGG17067);山西省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(201601D202062)

    致? 謝: 參加本試驗(yàn)部分工作的還有江代禮、譚翰杰、張能和紀(jì)燁斌等同學(xué),特此一并致謝。

    通信作者E-mail:lh1964@126.com

    #為并列第一作者

    猜你喜歡
    差異表達(dá)基因草莓
    愛提問的小草莓
    鹽脅迫對花生硝酸鹽積累及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響
    草莓
    生物信息學(xué)分析患有乳腺癌的乳腺球樣本中與自我更新相關(guān)的關(guān)鍵基因
    草莓
    空腹吃草莓
    條斑紫菜優(yōu)良品系的基因芯片表達(dá)譜分析
    高溫脅迫下草坪草高羊茅差異表達(dá)基因的分子研究
    采草莓
    抑制消減雜交技術(shù)在瓜菜作物研究中的應(yīng)用
    中國瓜菜(2009年4期)2009-09-23 08:46:18
    少妇熟女欧美另类| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 两个人免费观看高清视频| 免费av不卡在线播放| 亚洲av国产av综合av卡| 一边亲一边摸免费视频| av女优亚洲男人天堂| 久久精品国产亚洲av天美| 伦精品一区二区三区| 婷婷色麻豆天堂久久| 九色成人免费人妻av| 好男人视频免费观看在线| 国产亚洲一区二区精品| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 这个男人来自地球电影免费观看 | 欧美+日韩+精品| 久久久久久久久久久丰满| 日韩在线高清观看一区二区三区| 高清黄色对白视频在线免费看| 色吧在线观看| 春色校园在线视频观看| 国产日韩欧美在线精品| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲av日韩在线播放| 午夜福利视频在线观看免费| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 91精品国产国语对白视频| 成人无遮挡网站| 性色avwww在线观看| 五月天丁香电影| 亚洲国产精品成人久久小说| a 毛片基地| 免费看av在线观看网站| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 国产成人91sexporn| 大片电影免费在线观看免费| 中文字幕最新亚洲高清| 日本av手机在线免费观看| 99久久精品国产国产毛片| 韩国av在线不卡| 少妇的逼水好多| 中文天堂在线官网| 搡老乐熟女国产| 少妇熟女欧美另类| 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲av.av天堂| 亚洲国产最新在线播放| 日本欧美视频一区| 亚洲一区二区三区欧美精品| 色哟哟·www| 人妻少妇偷人精品九色| h视频一区二区三区| 天天操日日干夜夜撸| 欧美精品国产亚洲| 99热6这里只有精品| 考比视频在线观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 在线观看免费视频网站a站| 午夜福利网站1000一区二区三区| 午夜激情久久久久久久| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产av一区二区精品久久| 国产永久视频网站| 欧美少妇被猛烈插入视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 久热这里只有精品99| 人成视频在线观看免费观看| 多毛熟女@视频| 欧美精品亚洲一区二区| 人妻一区二区av| 黄片无遮挡物在线观看| 免费大片18禁| 超碰97精品在线观看| 伦精品一区二区三区| 国产精品无大码| 精品少妇久久久久久888优播| 欧美成人精品欧美一级黄| 免费大片黄手机在线观看| av福利片在线| 免费观看的影片在线观看| 日本欧美视频一区| 国产精品偷伦视频观看了| 综合色丁香网| 午夜激情福利司机影院| 免费黄色在线免费观看| 丰满乱子伦码专区| 久久久久人妻精品一区果冻| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲图色成人| 日韩成人伦理影院| 精品熟女少妇av免费看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 午夜久久久在线观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产综合精华液| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 熟女av电影| 国产精品无大码| 黄色毛片三级朝国网站| 在线观看一区二区三区激情| 国产免费一级a男人的天堂| 精品久久国产蜜桃| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产成人免费观看mmmm| 免费黄色在线免费观看| 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 午夜老司机福利剧场| 午夜影院在线不卡| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 日本av手机在线免费观看| 内地一区二区视频在线| 熟女电影av网| 久久ye,这里只有精品| 亚洲av综合色区一区| 岛国毛片在线播放| 色吧在线观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 91精品三级在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 午夜老司机福利剧场| 美女中出高潮动态图| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产成人av激情在线播放 | 国产成人精品福利久久| 国产成人精品婷婷| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 美女国产视频在线观看| 亚洲欧美一区二区三区国产| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 亚洲人成网站在线观看播放| 婷婷色麻豆天堂久久| 久久精品久久精品一区二区三区| 九九爱精品视频在线观看| 国产精品久久久久久久电影| 国产精品三级大全| 久久久久国产精品人妻一区二区| 99re6热这里在线精品视频| 少妇人妻 视频| 国内精品宾馆在线| 国产精品国产av在线观看| 国产黄频视频在线观看| 一二三四中文在线观看免费高清| 老女人水多毛片| 男的添女的下面高潮视频| 黄片播放在线免费| 国产高清三级在线| 国产一区二区三区av在线| 亚洲高清免费不卡视频| 久久久欧美国产精品| 午夜av观看不卡| av卡一久久| 免费少妇av软件| 永久免费av网站大全| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 街头女战士在线观看网站| 国产成人免费无遮挡视频| 欧美精品高潮呻吟av久久| 久久久亚洲精品成人影院| 久久久久久久精品精品| 国产日韩欧美亚洲二区| 日韩人妻高清精品专区| 国产成人av激情在线播放 | 3wmmmm亚洲av在线观看| 黄色视频在线播放观看不卡| 看免费成人av毛片| 亚洲内射少妇av| 91精品国产九色| 高清午夜精品一区二区三区| √禁漫天堂资源中文www| 免费看av在线观看网站| 交换朋友夫妻互换小说| 99久久综合免费| 国产淫语在线视频| 日韩伦理黄色片| 大香蕉97超碰在线| 国产精品.久久久| 午夜激情久久久久久久| 91精品国产九色| 国产av精品麻豆| 精品国产一区二区久久| 久久人妻熟女aⅴ| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产成人91sexporn| 免费观看性生交大片5| 妹子高潮喷水视频| 97超碰精品成人国产| 国产黄色免费在线视频| 男女边吃奶边做爰视频| 在线 av 中文字幕| 天天影视国产精品| 国产av码专区亚洲av| 国产成人91sexporn| 亚洲高清免费不卡视频| 999精品在线视频| 国产又色又爽无遮挡免| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产精品欧美亚洲77777| 国产片特级美女逼逼视频| 午夜免费男女啪啪视频观看| 人人妻人人澡人人看| 人妻少妇偷人精品九色| 成人免费观看视频高清| 国产一区亚洲一区在线观看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 最黄视频免费看| 国产精品一区二区在线不卡| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲av成人精品一区久久| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产一区二区三区av在线| 18禁在线播放成人免费| 下体分泌物呈黄色| 国产色婷婷99| 久久国内精品自在自线图片| 欧美丝袜亚洲另类| 免费看不卡的av| 永久免费av网站大全| 高清av免费在线| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产淫语在线视频| 日本黄大片高清| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 久久韩国三级中文字幕| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 色94色欧美一区二区| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 成人国语在线视频| 美女福利国产在线| 中文字幕免费在线视频6| 一级毛片aaaaaa免费看小| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 街头女战士在线观看网站| 国产精品欧美亚洲77777| 丝瓜视频免费看黄片| 日韩av在线免费看完整版不卡| 好男人视频免费观看在线| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 成人国语在线视频| 久热久热在线精品观看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 久久午夜福利片| 欧美激情 高清一区二区三区| 日韩中文字幕视频在线看片| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲精品自拍成人| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 99国产精品免费福利视频| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲美女搞黄在线观看| 欧美日韩成人在线一区二区| 久久国内精品自在自线图片| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 伦理电影免费视频| 丝袜喷水一区| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 日韩一区二区三区影片| 久久99一区二区三区| 久久韩国三级中文字幕| 欧美激情 高清一区二区三区| 啦啦啦在线观看免费高清www| 中文字幕免费在线视频6| 国产精品国产三级专区第一集| 一本大道久久a久久精品| 九草在线视频观看| 国产高清国产精品国产三级| 国产成人精品一,二区| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产乱来视频区| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 亚洲av福利一区| 亚洲国产精品国产精品| 午夜av观看不卡| 97精品久久久久久久久久精品| 日韩成人av中文字幕在线观看| 少妇精品久久久久久久| 国产熟女午夜一区二区三区 | 午夜福利在线观看免费完整高清在| 高清不卡的av网站| 国产精品不卡视频一区二区| 国产男人的电影天堂91| 伊人久久国产一区二区| 日本午夜av视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 人妻夜夜爽99麻豆av| 99九九在线精品视频| 亚洲在久久综合| 国产高清国产精品国产三级| 国产爽快片一区二区三区| 国产毛片在线视频| 九九爱精品视频在线观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 一级二级三级毛片免费看| 超碰97精品在线观看| 亚洲成色77777| 亚洲国产欧美在线一区| 女性被躁到高潮视频| 亚洲欧美成人精品一区二区| 久久99蜜桃精品久久| 18禁在线无遮挡免费观看视频| av在线老鸭窝| 日韩一本色道免费dvd| 国产综合精华液| 伊人久久国产一区二区| 午夜福利网站1000一区二区三区| 一级二级三级毛片免费看| 婷婷色av中文字幕| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲内射少妇av| 晚上一个人看的免费电影| 日本-黄色视频高清免费观看| 在线观看国产h片| 少妇人妻 视频| 日本爱情动作片www.在线观看| 亚洲精品第二区| 热99久久久久精品小说推荐| 日韩av不卡免费在线播放| 18禁在线播放成人免费| 亚洲美女搞黄在线观看| 永久网站在线| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产深夜福利视频在线观看| 高清黄色对白视频在线免费看| 成人漫画全彩无遮挡| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 天堂中文最新版在线下载| 国产高清国产精品国产三级| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲av日韩在线播放| 国产片内射在线| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 欧美精品一区二区大全| 精品少妇久久久久久888优播| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 最黄视频免费看| 飞空精品影院首页| 中文欧美无线码| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 日韩av在线免费看完整版不卡| 丝袜脚勾引网站| 国产免费一级a男人的天堂| 日本欧美国产在线视频| 天堂中文最新版在线下载| 美女cb高潮喷水在线观看| 色网站视频免费| videossex国产| 夫妻性生交免费视频一级片| 99九九在线精品视频| 亚洲人成77777在线视频| 国产成人a∨麻豆精品| av有码第一页| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 免费高清在线观看日韩| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 老司机影院毛片| videossex国产| 黑丝袜美女国产一区| 久久午夜福利片| 大陆偷拍与自拍| 99九九在线精品视频| 大陆偷拍与自拍| 一本久久精品| 午夜福利网站1000一区二区三区| a 毛片基地| 22中文网久久字幕| 黄色视频在线播放观看不卡| 一级,二级,三级黄色视频| 少妇 在线观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产日韩欧美视频二区| 国产极品天堂在线| 国产69精品久久久久777片| 国产一区二区三区av在线| 香蕉精品网在线| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲图色成人| 26uuu在线亚洲综合色| 最近的中文字幕免费完整| 久久亚洲国产成人精品v| 成人二区视频| av网站免费在线观看视频| av国产久精品久网站免费入址| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产淫语在线视频| 美女国产视频在线观看| 亚洲人成网站在线播| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 亚洲国产精品成人久久小说| 99国产综合亚洲精品| 国精品久久久久久国模美| h视频一区二区三区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 久热久热在线精品观看| 国产精品无大码| 亚洲精品第二区| 国产精品一区二区在线观看99| 人人澡人人妻人| 国产不卡av网站在线观看| 97超视频在线观看视频| 九九爱精品视频在线观看| 看非洲黑人一级黄片| 日韩一区二区三区影片| 久久久亚洲精品成人影院| 女性被躁到高潮视频| 久久久久久久久久人人人人人人| 精品一区在线观看国产| 亚洲图色成人| 99热国产这里只有精品6| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 能在线免费看毛片的网站| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 好男人视频免费观看在线| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 午夜激情福利司机影院| 午夜av观看不卡| 午夜激情av网站| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产精品久久久久久精品古装| 日韩精品有码人妻一区| 97在线人人人人妻| 大片电影免费在线观看免费| 精品少妇久久久久久888优播| 精品少妇黑人巨大在线播放| 嫩草影院入口| 国产成人精品无人区| 少妇 在线观看| 欧美精品一区二区免费开放| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲国产精品999| 午夜福利,免费看| 有码 亚洲区| 精品亚洲成国产av| 99热网站在线观看| 亚洲精品国产av蜜桃| 这个男人来自地球电影免费观看 | 99热6这里只有精品| 我的老师免费观看完整版| 亚洲,一卡二卡三卡| 欧美丝袜亚洲另类| 啦啦啦啦在线视频资源| 精品国产露脸久久av麻豆| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产日韩欧美在线精品| 这个男人来自地球电影免费观看 | 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 一级毛片aaaaaa免费看小| 在线观看三级黄色| 精品亚洲成国产av| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产一级毛片在线| 黄片无遮挡物在线观看| 国产亚洲一区二区精品| 日韩av不卡免费在线播放| 性色avwww在线观看| 看十八女毛片水多多多| 午夜免费鲁丝| 国产又色又爽无遮挡免| 69精品国产乱码久久久| 在线免费观看不下载黄p国产| 日本免费在线观看一区| 亚洲国产最新在线播放| 18+在线观看网站| 亚洲怡红院男人天堂| 少妇人妻精品综合一区二区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 成人影院久久| 91精品国产九色| 人妻夜夜爽99麻豆av| 99九九在线精品视频| 大香蕉久久网| 大片免费播放器 马上看| 久久久久久久久久成人| 亚洲内射少妇av| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 美女大奶头黄色视频| 2021少妇久久久久久久久久久| 成人免费观看视频高清| 一二三四中文在线观看免费高清| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲无线观看免费| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲人成网站在线观看播放| 国国产精品蜜臀av免费| 精品一品国产午夜福利视频| 久久人人爽人人爽人人片va| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 欧美xxxx性猛交bbbb| 免费看光身美女| 欧美少妇被猛烈插入视频| 十八禁高潮呻吟视频| 精品国产乱码久久久久久小说| 另类精品久久| 国产精品偷伦视频观看了| 韩国av在线不卡| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲精品成人av观看孕妇| 最新的欧美精品一区二区| 国产日韩欧美视频二区| 不卡视频在线观看欧美| 国产精品99久久久久久久久| 日韩强制内射视频| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产不卡av网站在线观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲国产日韩一区二区| 91精品国产国语对白视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产精品久久久久成人av| 91久久精品电影网| 国产日韩欧美视频二区| 亚洲精品视频女| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 熟女人妻精品中文字幕| 日韩av不卡免费在线播放| 一区二区三区免费毛片| av卡一久久| 久久精品人人爽人人爽视色| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 国产av精品麻豆| 国产亚洲精品久久久com| 大话2 男鬼变身卡| 简卡轻食公司| 交换朋友夫妻互换小说| 男人爽女人下面视频在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 成人免费观看视频高清| 中文字幕av电影在线播放| 久久久国产精品麻豆| 好男人视频免费观看在线| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产精品熟女久久久久浪| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产黄色视频一区二区在线观看| 最新的欧美精品一区二区| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产日韩欧美亚洲二区| 黑人高潮一二区| 久久婷婷青草| 中国国产av一级| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 好男人视频免费观看在线| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产精品99久久99久久久不卡 | 26uuu在线亚洲综合色| 老熟女久久久| 久久久久久伊人网av| 日本欧美视频一区| 一级片'在线观看视频| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产黄片视频在线免费观看| 亚洲精品美女久久av网站| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 一级a做视频免费观看| 精品一品国产午夜福利视频| 在线观看国产h片| www.av在线官网国产| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲欧美一区二区三区国产| 欧美日韩视频精品一区| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 3wmmmm亚洲av在线观看| 高清毛片免费看| 五月玫瑰六月丁香| 国产伦理片在线播放av一区| 久久午夜福利片| 久久免费观看电影| 91精品国产九色| 777米奇影视久久| 欧美激情国产日韩精品一区| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 美女视频免费永久观看网站| 色婷婷av一区二区三区视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | av免费在线看不卡| 国产精品人妻久久久久久| 国产成人免费无遮挡视频| 制服丝袜香蕉在线| 欧美丝袜亚洲另类| 国产成人免费观看mmmm| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 视频区图区小说| 中文字幕久久专区| 观看美女的网站| 国产有黄有色有爽视频| 青春草国产在线视频| www.色视频.com| 久热这里只有精品99| 国产av国产精品国产| 国产成人精品久久久久久| 青春草国产在线视频| 精品一区二区免费观看| 欧美97在线视频|