鹿藥的質(zhì)量標準研究

崔譽文 劉銀環(huán) 熱薩萊提·圖爾孫 毛昭琦 宋小妹

中圖分類號 R284.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）20-2786-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.20.11

摘 要 目的：建立鹿藥的質(zhì)量標準。方法：從原植物形態(tài)、性狀特征、顯微特征、薄層色譜（TLC）等方面對藥材進行定性鑒別；測定藥材的水分、灰分、浸出物；采用高效液相色譜法測定藥材中（25S）-17α-羥基-5α-螺甾烷-9-烯-3β-O-β-D-葡萄吡喃糖基-（1→2）-[β-D-木吡喃糖基（1→3）]-β-D-葡萄吡喃糖基（1→4）-β-D-半乳吡喃糖苷（SJ-13）的含量，色譜柱為Waters SunFire C18，流動相為乙腈-水（35 ∶ 65，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為203 nm，柱溫為20 ℃，進樣量為10 μL。結(jié)果：原植物為多年生草本植物，高30～60 cm；藥材表面呈棕色至棕褐色，具皺紋；顯微特征為表皮1列細胞；藥材粉末呈灰黃色，含大量草酸鈣針晶。藥材樣品的TLC圖斑點大部分清晰，分離度好；藥材中水分為5.26%～8.88%，總灰分為4.60%～28.86%，酸不溶性灰分為1.56%～23.39%，水浸出物為23.84%～51.26%，醇浸出物為22.65%～57.36%；SJ-13檢測進樣量線性范圍為8.92～31.22 ?g（r=0.999 9），精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD均小于1%，加樣回收率為97.0%～99.2%（RSD=0.8%，n=6），耐用性試驗的RSD均小于1%，10批藥材樣品中SJ-13的含量范圍為4.40～29.80 mg/g。結(jié)論：初步擬定鹿藥藥材中水分不得過11%，總灰分不得過35%，酸不溶性灰分不得過28%，水浸出物不得少于19%，醇浸出物不得少于18%，SJ-13含量不得少于4.40 mg/g；該試驗所建標準可用于鹿藥的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 鹿藥；質(zhì)量標準；顯微特征；薄層色譜法；含量測定；高效液相色譜法

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the quality standard of Smilacina japonica. METHODS： S. japonica was identified qualitatively in respects of original plant morphology， character， microscopic identification， TLC， etc. The moisture， ash and extract of medicinal materials were determined. The content of （25S）-17α-hydroxy-5α-spirostane-9-ene-3β-O-β-D-glucopyranoyl-（1→2）-[β-D-xylanosyl（1→3）]-β-D-glucopyranoyl（1→4）-β-D-galactopyranoside（SJ-13） was determined by HPLC. The determination was performed on Waters SunFire C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-water（35 ∶ 65，V/V） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 203 nm and the column temperature was 20 ℃. The sample size was 10 μL. RESULTS： The original plant was perennial herbal， with height of 30-60 cm. The surface of the medicinal material was brown to brownish brown， with wrinkle and 1 row cells in epidermis. The powder of medicinal material was grayish yellow and contained large amount of acicular crystal. TLC spots were clear and well-separated. The content of moisture was 5.26%-8.88%； the content of total ash was 4.60%-28.86%； the acid-insoluble ash was 1.56%-23.39%， water extract was 23.84%-51.26% and alcohol extract was 22.65%-57.36%. The linear range of SJ-13 were 8.92-31.22 ?g（r=0.999 9）. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 1%. The average recoveries were 97.0%-99.2%（RSD=0.8%，n=6）. RSD of durability test was lower than 1%. The content of SJ-13 was 4.40-29.80 mg/g in 10 batches of medicinal samples. CONCLUSIONS： The content of water， total ash， acid insoluble components should not exceed 11%， 35%， 28%； the content of water extract， alcohol extract and SJ-13 should not be less than 19%， 18% and 4.40 mg/g， respectively. Established standard can be used for the quality control of S. japonica.

KEYWORDS Smilacina japonica； Quality standard； Microscopic identification； TLC； Content determination； HPLC

鹿藥為百合科鹿藥屬多年生草本植物鹿藥（Smilacina japonica A. Gray）的干燥根及根莖，俗稱偏頭七，分布于我國西北、西南、東北和華北等地，資源較豐富[1-4]。該藥材氣微，性溫，微甘、苦，具有祛風(fēng)除濕、補氣益腎、活血調(diào)經(jīng)等功效，民間常用于治療偏正頭痛、癆傷、月經(jīng)不調(diào)、陽痿、跌打損傷、風(fēng)濕疼痛、乳癰等癥[5]。鹿藥主要成分包括甾體皂苷、黃酮類化合物及其他微量成分[6-8]，具有抗腫瘤、抗氧化等藥理作用[9-11]。近年來，有關(guān)鹿藥的化學(xué)成分、含量測定及生物活性的研究較少。因此，本試驗從原植物形態(tài)、性狀特征、顯微特征、薄層色譜（TLC）等方面對鹿藥藥材進行了定性鑒別，并對其水分、灰分、浸出物等常規(guī)檢測項目進行了考察，同時測定了其中含量較高的甾體皂苷化合物（25S）-17α-羥基-5α-螺甾烷-9-烯-3β-O-β-D-葡萄吡喃糖基-（1→2）-[β-D-木吡喃糖基（1→3）]-β-D-葡萄吡喃糖基（1→4）-β-D-半乳吡喃糖苷（SJ-13）的含量，旨在為建立和完善其質(zhì)量標準提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1100型高效液相色譜儀，包括二極管陣列檢測器（美國Agilent公司）；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京科偉永鑫實驗儀器設(shè)備廠）；GB204型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；SB-3200D型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DFY-200A型高速萬能粉碎機（上海比朗儀器有限公司）；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；OSB-2100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；SX2-4-10型馬弗爐（天津瑪福爾科技有限公司）；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）。

1.2 試劑

SJ-13對照品（本課題組自制；對照文獻[12]，經(jīng)碳譜、氫譜驗證其結(jié)構(gòu)；經(jīng)高效液相色譜法測定，純度為98%）；乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

10批鹿藥藥材樣品收集于陜西省境內(nèi)太白山地區(qū)（詳見表1），經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室王繼濤高級實驗師鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 原植物形態(tài)

原植物為多年生草本植物，高30～60 cm。根莖橫走，多為圓柱狀，直徑6～10 mm，有時具膨大結(jié)節(jié)。莖中部以上具粗伏毛。葉互生，4～9枚；葉柄長3～15 mm；葉片紙質(zhì)，卵狀橢圓形、橢圓形或長圓形，長6～13 cm，寬3～7 cm，先端短漸尖，基部圓形，兩面疏被粗毛或近無毛。圓錐花序長3～6 cm，具粗短毛；花單生，花梗長2～6 mm，花被片6，分離或僅基部稍合生，長圓形或長圓狀倒卵形，長約3 mm，白色；雄蕊6，花絲基部貼生于花被片上，花藥??；子房3室，花柱與子房近等長，柱頭幾不裂。漿果近球形，直徑5～6 mm，熟時紅色，具1～2顆種子?；ㄆ?～6月，果期8～9月。原植物形態(tài)見圖1。

2.2 性狀特征

藥材干燥根莖略呈結(jié)節(jié)狀，稍扁，長6～15 cm，直徑0.5～1 cm。表面棕色至棕褐色，具皺紋，先端有一至數(shù)個莖基或芽基，周圍密生多數(shù)須根。硬，不易折斷；斷面不平，白色或類白色。須根細長，達8 cm，直徑至1 mm，表面黃白色，可見小絨毛，質(zhì)脆，易斷，斷面類白色或白色。氣微，味甜，嚼之黏牙。以根莖粗壯、斷面白色、粉性足者為佳。藥材外觀見圖2。

2.3 顯微特征

2.3.1 根橫切面 表皮為1列淡黃色扁圓形或長圓形細胞，徑向排列，外壁稍厚，微木化，有的形成根毛。皮層寬廣，約占根的3/4，由13～17列大小不等的薄壁細胞組成，細胞圓形或類圓形，胞間隙明顯。皮層散有大型黏液細胞，內(nèi)含草酸鈣針晶，有的薄壁細胞中含草酸鈣方晶，內(nèi)皮層明顯。中柱約占根的1/4，木質(zhì)部束6～9個，韌皮部與木質(zhì)部交互排列，髓部為多角形薄壁細胞，詳見圖3。

2.3.2 根莖橫切面 表皮為1列棕黃色或黃色細胞，排列緊密，外壁加厚，微木化，內(nèi)含淡黃色物。皮層較窄，約占橫切面的1/5，由13～15列薄壁細胞組成，散有較大型的黏液細胞，內(nèi)含草酸鈣針晶，部分薄壁細胞中含草酸鈣方晶。內(nèi)皮層明顯。中柱約占4/5，由圓形或類圓形薄壁細胞組成，散有大型黏液細胞，內(nèi)含草酸鈣針晶；維管束散在，周木型或外韌型，在內(nèi)皮層內(nèi)側(cè)排列成一圈，詳見圖4。

2.3.3 須根橫切面 表皮為1列扁圓形排列緊密細胞，外被角質(zhì)層。皮層占根面積大部分。內(nèi)皮層1列細胞排列緊密整齊。初生木質(zhì)部為多束，呈星角狀，和初生韌皮部相間，排列成輻射維管束，詳見圖5。

2.3.4 粉末 灰黃色。草酸鈣針晶隨處可見，散在或成束存在于類圓形或長圓形黏液細胞中，針晶束長約10.5～64 ?m，直徑約3 ?m，少數(shù)稍粗。導(dǎo)管主要為螺紋導(dǎo)管，也有具緣紋孔導(dǎo)管、孔紋導(dǎo)管，直徑8～25 ?m。薄壁細胞隨處可見，類圓形或長圓形，近無色。淀粉粒單粒呈類球形，臍點點狀。復(fù)粒由2～3個分粒組成。

2.4 TLC鑒別

稱取藥材樣品粉末1 g，加70%乙醇溶液20 mL，回流提取1.5 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加70%乙醇溶液1 mL使溶解，靜置，取上清液作為供試品溶液。取SJ-13對照品10 mg，加甲醇10 mL使溶解，制成對照品溶液。按 2015年版《中國藥典》（四部）TLC法[13]試驗，吸取上述2種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（6.5 ∶ 3.5 ∶ 1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置日光燈下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置上10批藥材樣品均出現(xiàn)相同顏色斑點，顏色深淺不一，大部分清晰，分離度好，說明不同地點收集的藥材樣品該成分含量存在一定差異，詳見圖6。

2.5 水分測定

分別取10批藥材樣品粉末適量，精密稱定，按2015年版《中國藥典》（四部）通則0832水分測定法的第二法（烘干法）[13]測定其中水分，每批平行測定3次，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，藥材樣品中水分為5.26%～8.88%，平均值為6.46%。初步擬定鹿藥藥材水分不得過11%。

2.6 灰分測定

分別取10批藥材樣品粉末適量，精密稱定，按2015年版《中國藥典》（四部）通則2302灰分測定法[13]測定其中總灰分和酸不溶性灰分，每批平行測定3次，詳見表2。結(jié)果表明，藥材樣品中總灰分為4.60%～28.86%，平均值為15.61%，酸不溶性灰分為1.56%～23.39%，平均值為11.04%。初步擬定鹿藥藥材總灰分不得過35%，酸不溶性灰分不得過28%。

2.7 浸出物測定

分別取10批藥材樣品粉末適量，精密稱定，按2015年版《中國藥典》（四部）通則2201浸出物測定法[13]測定其中水浸出物和醇浸出物，每批平行測定3次，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，藥材樣品中水浸出物為23.84%～51.26%，平均值為43.18%；醇浸出物為22.65%～57.36%，平均值為43.81%。初步擬定鹿藥藥材水浸出物不得少于19%，醇浸出物不得少于18%。

2.8 含量測定

2.8.1 色譜條件 色譜柱：Waters SunFire C18（150 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動相：乙腈-水（35 ∶ 65，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：203 nm；柱溫：20 ℃；進樣量：10 μL。

2.8.2 對照品溶液的制備 精密稱取SJ-13對照品8.92 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得。

2.8.3 供試品溶液的制備 稱取藥材樣品粉末2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇溶液20 mL，密塞，搖勻，稱定質(zhì)量，100 ℃下加熱回流提取1.5 h，放冷，再次稱定質(zhì)量，用70%乙醇溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.8.4 系統(tǒng)適用性試驗 取上述對照品溶液、供試品溶液各適量，按“2.8.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖7。結(jié)果，理論板數(shù)按SJ-13峰計不低于5 000；基線分離良好，分離度大于1.5。

2.8.5 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.8.2”項下對照品溶液10、15、20、25、30、35 ?L，按“2.8.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以SJ-13進樣量（x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程y=41 312x-42 107（r=0.999 9）。結(jié)果表明，SJ-13檢測進樣量線性范圍為8.92～31.22 ?g。

2.8.6 精密度試驗 取“2.8.2”項下對照品溶液適量，按“2.8.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，SJ-13峰面積的RSD為0.39%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.8.7 穩(wěn)定性試驗 取“2.8.3”項下供試品溶液（編號：S3）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、10、12 h時按“2.8.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，SJ-13峰面積的RSD為 0.37%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8.8 重復(fù)性試驗 精密稱取藥材樣品（編號：S3）粉末適量，共6份，按“2.8.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.8.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算藥材樣品含量。結(jié)果，SJ-13含量平均值為29.60 mg/g，RSD為0.30%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8.9 加樣回收率試驗 取已知含量藥材樣品（編號：S6）粉末適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量濃度的SJ-13對照品溶液適量，按“2.8.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.8.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結(jié)果，加樣回收率為97.0%～99.2%（RSD=0.8%，n=6），詳見表3。

2.8.10 耐用性試驗 （1）色譜柱考察。精密稱取藥材樣品（編號：S4）粉末適量，按“2.8.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.8.1”項下色譜條件[色譜柱分別設(shè)置為Waters SunFire C18（150 mm×4.6 mm，5 ?m）、Inertsil ODS-3 C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）、Hypersil ODS-2 C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）]進樣測定，記錄峰面積并計算藥材樣品含量，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，色譜柱發(fā)生一定程度變化時，本方法能滿足試驗要求，耐用性良好。（2）流動相考察。精密稱取藥材樣品（編號：S4）粉末適量，按“2.8.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.8.1”項下色譜條件[流動相乙腈-水比例（V/V）分別設(shè)置為21 ∶ 79、35 ∶ 65、45 ∶ 55]進樣測定，記錄峰面積并計算藥材樣品含量，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，流動相發(fā)生一定程度變化時，本方法能滿足試驗要求，耐用性良好。（3）流速考察。精密稱取藥材樣品（編號：S5）粉末適量，按“2.8.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.8.1”項下色譜條件（流速分別設(shè)置為0.8、1.0、1.2 mL/min）進樣測定，記錄峰面積并計算藥材樣品含量，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，流速發(fā)生一定程度變化時，本方法能滿足試驗要求，耐用性良好。（4）檢測波長考察。精密稱取藥材樣品（編號：S5）粉末適量，按“2.8.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.8.1”項下色譜條件（檢測波長分別設(shè)置為198、200、203 nm）進樣測定，記錄峰面積并計算藥材樣品含量，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，檢測波長發(fā)生一定程度變化時，本方法能滿足試驗要求，耐用性良好。（5）柱溫考察。精密稱取藥材樣品（編號：S5）粉末適量，按“2.8.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.8.1”項下色譜條件（柱溫分別設(shè)置為20、25、30 ℃）進樣測定，記錄峰面積并計算藥材樣品含量，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，柱溫發(fā)生一定程度變化時，本方法能滿足試驗要求，耐用性良好。

2.8.11 藥材樣品含量測定 取10批藥材樣品粉末各適量，分別按“2.8.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.8.1”項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積并計算藥材樣品含量，結(jié)果見表5。由表5 可知，10批藥材樣品中SJ-13含量在4.40～29.80 mg/g之間，平均含量為17.43 mg/g?？紤]到不同產(chǎn)地、不同采收期采集的藥材樣品的含量差異，暫定鹿藥藥材按干燥品計算含SJ-13不得少于4.40 mg/g。

3 討論

本試驗參考相應(yīng)標準[13]對樣品藥材的水分、灰分和浸出物進行了檢測。根據(jù)檢測結(jié)果，建議鹿藥藥材按干燥品計算水分不得過11%，總灰分不得過35%，酸不溶性灰分不得過28%，水浸出物不得少于19%，醇浸出物不得少于18%。

有文獻表明，SJ-13在鹿藥藥材中含量較高，建議在標準中采用SJ-13作為主要指標，進行TLC鑒別和含量測定[14-15]。本試驗結(jié)果表明，以SJ-13為對照品進行TLC鑒別，其色譜分離度好、方法可行；SJ-13含量測定的方法學(xué)驗證均符合要求。在SJ-13含量測定的預(yù)試驗中，筆者曾考察了不同波長下甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%磷酸溶液、乙腈-2%磷酸溶液作為流動相時對SJ-13含量測定的影響，發(fā)現(xiàn)采用203 nm波長、流動相為乙腈-水（35 ∶ 65，V/V）測定SJ-13時，分離度好、有較強紫外吸收。根據(jù)檢測結(jié)果，建議鹿藥藥材按干燥品計算含SJ-13不得少于4.40 mg/g。

綜上所述，本試驗所建標準可用于鹿藥的質(zhì)量控制。

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（收稿日期：2017-12-12 修回日期：2018-03-06）

（編輯：張 靜）