知母飲片、水煎劑和配方顆粒HPLC指紋圖譜相關(guān)性研究

摘要：為了考察知母飲片、水煎劑和配方顆粒之間化學(xué)成分的差異，采用HPLC法對三者的指紋圖譜進(jìn)行了相關(guān)性研究。選用Inertsil ODS-3柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈為流動(dòng)相A，1%醋酸為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫，流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為265 nm，采集時(shí)間為100 min，分別建立10 批知母飲片、10批知母水煎劑與10批知母配方顆粒的指紋圖譜。結(jié)果顯示，10批知母配方顆粒HPLC 指紋圖譜的9個(gè)指紋峰均可在飲片中得到追蹤，相似度均大于0.95，從9個(gè)共有峰中指認(rèn)出芒果苷，知母飲片、水煎劑和配方顆粒的主要化學(xué)成分基本相同。本研究所建立的指紋圖譜方法重復(fù)性、穩(wěn)定性好，可用于飲片、配方顆粒生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：中藥藥劑學(xué)；知母飲片；水煎劑；配方顆粒； HPLC；指紋圖譜

中圖分類號(hào)：R917文獻(xiàn)標(biāo)志碼：Adoi： 10.7535/hbgykj.2018yx03012

知母為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bunge的干燥根莖，具有滋陰降火、潤燥滑腸等功效[1]，其主要成分有薩爾薩皂苷元、嗎爾考皂苷元等，黃酮類有芒果苷、異芒果苷，多糖類有4種知母多糖（Anemarn A，B，C，D），生物堿類有膽堿、尼克酰胺及有機(jī)酸等[2-3]。知母配方顆粒是以符合《中華人民共和國藥典》2015年版規(guī)定的知母飲片為原料，水作為提取溶媒，經(jīng)減壓濃縮、噴霧干燥、制粒加工而成，具有服用方便、便于攜帶、療效確切等優(yōu)點(diǎn)。第3期李軍山：知母飲片、水煎劑和配方顆粒HPLC指紋圖譜相關(guān)性研究河北工業(yè)科技第35卷但知母飲片經(jīng)加工制成配方顆粒后，失去了傳統(tǒng)飲片的特征。為了全面客觀地評價(jià)傳統(tǒng)飲片、水煎劑與配方顆粒之間的關(guān)聯(lián)性，采用HPLC 法分別建立了知母飲片、水煎劑和配方顆粒的指紋圖譜，比較三者之間的差別，為配方顆粒臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐。

1主要儀器與試劑

日本島津LC-20A高效液相色譜儀，賽多利斯CP225D 型電子分析天平，山東濟(jì)寧JCX-250超聲提取器。

知母對照藥材（批號(hào)為121070-201105），芒果苷對照品（批號(hào)為111607-201503），購自中國食品藥品檢定研究院；10批知母飲片來源見表1（編號(hào)為S1—S10），經(jīng)河北省食品藥品檢驗(yàn)所鑒定為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bunge的干燥根莖；10批知母配方顆粒（編號(hào)為B1—B10）見表2，由神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。相似度計(jì)算軟件采用2012 版中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1溶液制備

2.1.1對照品溶液的制備

取芒果苷對照品10.85 mg，精確稱定，置于200 mL容量瓶中，加入稀乙醇（取乙醇529 mL，加水稀釋至1 000 mL）溶解并定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.2飲片供試品溶液的制備

取知母飲片粉末（過3號(hào)篩）1 g，精密稱定，加入70 %（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，共計(jì)109.65 g，超聲1 h，放冷，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，然后以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min。過濾，即得。

2.1.3水煎劑供試品溶液的制備

取不同產(chǎn)地的合格知母飲片100 g，加9倍水浸泡30 min，然后加熱煎煮30 min，藥液用0.074 mm（200目）篩過濾。將藥渣再加7倍水煎煮，藥液用0074 mm（200目）篩過濾。合并2次濾液，真空旋蒸，于75 ℃旋至半干，然后放入烘箱烘干。將所得膏粉稱重，研細(xì)，用藥匙精確稱取0.5 g膏粉，加入70%的甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲0.5 h，放冷，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，即得。

2.1.4配方顆粒供試品溶液的制備

將知母配方顆粒研細(xì)，取約0.1 g，加入70%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲0.5 h，放冷，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，過濾，即得。

2.2色譜條件[4-16]

色譜柱：Inertsil ODS-3 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，1%醋酸為流動(dòng)相B，梯度洗脫條件見表3，檢測波長為265 nm，流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1系統(tǒng)適用性及專屬性試驗(yàn)

取對照品溶液，飲片、水煎劑、配方顆粒供試品溶液和陰性樣品溶液進(jìn)行檢測，考察實(shí)驗(yàn)方法的適用性及專屬性，結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，樣品中各個(gè)峰分離較好，峰形對稱，且陰性無干擾，表明方法的適用性及專屬性良好。

2.3.2精密度試驗(yàn)

按照2.1項(xiàng)方法制備知母配方顆粒的供試品溶液，進(jìn)樣6 次。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各主要指紋峰相對保留時(shí)間及相對峰面積的RSD值為0.58%～1.62%，表明儀器的精密度良好。

2.3.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照2.1 項(xiàng)方法制備知母配方顆粒的供試品溶液，分別于制備后的0，2，4，6，8，10 h 時(shí)檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各主要指紋峰相對保留時(shí)間及相對峰面積的RSD值為0.86%～1.05%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4重復(fù)性試驗(yàn)

按照2.1 項(xiàng)方法制備6 份知母配方顆粒的供試品溶液，依前述方法測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各主要指紋峰相對保留時(shí)間及相對峰面積的RSD值為072%～172%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.4樣品測定

分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液各10 μL，按照擬訂的色譜條件進(jìn)行測定，記錄100 min的色譜圖。

3結(jié)果與討論

31指放圖譜的建立

參照《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）》，分別進(jìn)行知母飲片、知母水煎劑、知母配方顆粒HPLC 指紋圖譜測定，色譜圖見圖2—圖4。

3.2參照峰的選擇與共有指紋峰的標(biāo)定

設(shè)定積分參數(shù)如下： 積分起止時(shí)間為10～100 min，斜率靈敏度為5，峰寬為0.03，最小峰的峰面積占總峰面積的比例大于1%。通過比對知母飲片、水煎劑、配方顆粒的指紋圖譜，選定三者均有的9個(gè)指紋峰作為共有峰。采用2012版指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件自動(dòng)匹配知母配方顆粒HPLC 圖譜的相關(guān)參數(shù)，共有指紋峰面積均大于色譜峰總面積的90%。通過與對照品色譜圖比較可知，在指紋圖譜的9個(gè)共有峰中，峰3為知母素。分析結(jié)果見表4。

3.3相似度分析

采用2012版指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件計(jì)算相似度。以10批知母飲片、水煎劑、配方顆粒指紋圖譜生成共有模式為對照，計(jì)算飲片、水煎劑、配方顆粒的相似度，結(jié)果見表5，關(guān)聯(lián)指紋圖譜見圖5。

3.4方法選擇

比較了甲醇-1%磷酸、乙腈-1%磷酸、乙腈-1%醋酸3種流動(dòng)相梯度洗脫的效果。結(jié)果表明，以乙腈-1%醋酸為流動(dòng)相梯度洗脫，峰形及分離度均較好。全波長掃描顯示，在265 nm處有吸收峰，此檢測波長色譜圖的色譜峰數(shù)量較多，峰形和分離度較好。柱溫分別選用25，30，35 ℃，進(jìn)樣分析結(jié)果顯示，30 ℃的峰形及分離度較好。

3.5特征峰鑒別

采用梯度洗脫，以便檢測出不同極性成分。本方法共檢出知母飲片、水煎劑、配方顆粒的9個(gè)主要特征峰，相似度均在0.97以上，說明知母飲片、水煎劑、配方顆粒較穩(wěn)定。飲片-水煎劑、飲片-配方顆粒、水煎劑-配方顆粒間的相似度均在0.95以上，表明知母飲片與知母水煎劑、知母配方顆粒在化學(xué)成分上的一致性。采用對照品對照，鑒別峰3為芒果苷峰。

4結(jié)語

本研究所建立的指紋圖譜分析方法重復(fù)性和穩(wěn)定性好，可用于飲片、配方顆粒生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制。中藥配方顆粒已失去飲片外觀形態(tài)及顯微特性，難以進(jìn)行直觀鑒別，且僅將某成分含量限度作為配方顆粒質(zhì)量控制指標(biāo)較難全面反映配方顆粒的整體面貌[17-20]。而中藥指紋圖譜能最大限度獲取有用的化學(xué)信息，較全面地反映從飲片加工到配方顆粒整個(gè)生產(chǎn)過程中化學(xué)成分方面的細(xì)微差異，有效控制中藥產(chǎn)品質(zhì)量。

中藥配方顆粒提取方式與傳統(tǒng)湯劑的煎煮方法相同，符合中醫(yī)藥傳統(tǒng)用藥的方式，提取出的藥效成分與傳統(tǒng)湯劑的藥效成分近似。但在傳統(tǒng)湯劑合煎過程中，存在藥效成分的相互作用，如增溶助溶、拮抗抑制等，而中藥配方顆粒為單煎提取制粒，因此，對于配方顆粒與傳統(tǒng)合煎湯劑的物質(zhì)基礎(chǔ)差異及其導(dǎo)致的藥效區(qū)別均有待進(jìn)行更為深入的研究。

參考文獻(xiàn)/References：

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：212-213.

[2]王穎異，郭寶林，張立軍. 知母化學(xué)成分的藥理研究進(jìn)展[J].科技導(dǎo)報(bào)，2010，28（12）：110-115.

WANG Yingyi， GUO Baolin， ZHANG Lijun.Pharmacological functions of chemicals in Rhizoma Anemarrhenae[J]. Science & Technology Review， 2010，28（12）：110-115.

[3]趙子劍，胡曉娟，張恩戶，等. 知母藥理作用的文獻(xiàn)再評價(jià)[J].中成藥，2012，34（7）：1350-1353.

[4]黨小平，毛春芹，陸兔林，等. HPLC法測定生知母和鹽知母中芒果苷和菝葜皂苷元[J].中草藥，2009，40（2）：236-238.

[5]梁雷，邊寶林，王宏潔. 不同產(chǎn)地知母藥材中芒果苷和知母皂苷BⅡ的含量測定[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（16）：49-51.

LIANG Lei，BIAN Baolin，WANG Hongjie.Determination of mangiferin and timosaponin BⅡ in Anemarrhenae Rhizoma from different areas[J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，2010，16（16）：49-51.

[6]容穗華，林海，高妮. 不同產(chǎn)地知母有效成分含量的HPLC法測定[J].現(xiàn)代醫(yī)院，2011，11（6）：7-9.

RONG Suihua，LIN Hai，GAO Ni. Determination of effective components in Anemarrhenae Rhizoma from different areas by HPLC[J]. Modern Hospital，2011，11（6）：7-9.

[7]沙東旭，劉兆妍，張滿來，等. HPLC-ELSD 測定知母中知母皂苷BⅡ的含量[J].藥物分析雜志，2009，29（12）：2106-2109.

SHA Dongxu ， LIU Zhaoyan， ZHANG Manlai ， et al. HPLC-ELSD determination ftimosaponin BⅡ in Anemarrhena asphodeloides Bge[J].Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis，2009，29（12） ：2106-2109.

[8]宋坤，陸兔林，季德.不同產(chǎn)地、不同炮制品知母中菝葜皂苷元含量的比較研究[J].中國藥師，2009，12（10）：1338-1340.

SONG Kun，LU Tulin，JI De.Comparative studies on contents of sarsasapogenin among radix Anemarrhenae from different sources and processings[J]. China Pharmacist， 2009，12（10）：1338-1340.

[9]鐘可，王文全，靳鳳云，等. HPLC-ELSD法同時(shí)測定河北產(chǎn)道地藥材不同物候期知母中知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ的含量[J].中華中醫(yī)藥雜志，2013，28（6）：1710-1713.

ZHONG Ke， WANG Wenquan， JIN Fengyun， et al.Simultaneous determination of timosaponin AⅢ and timosaponin BⅡ in Rhizoma Anemarrhenae from Hebei in the different phenological periods by HPLC-ELSD[J]. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy，2013，28（6）：1710-1713.

[10]尹茶，吳婷婷，朱東亮，等. HPLC-ELSD 同時(shí)測定知母藥材中4 種主要皂苷的含量[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，2012，30（6）：433-436.

YIN Cha，WU Tingting，ZHU Dongliang， et al.Determination of four major steroid glycosides in Anemarrhena Asphodeloides by HPLC-ELSD[J]. Journal of Pharmaceutical Practice， 2012，30（6）：433-436.

[11]季德，蘇曉楠，黃紫炎，等.HPLC-MS法測定知母鹽炙前后8種成分量變化[J].中草藥，2017，48（9）：1784-1790.

JI De， SU Xiaonan， HUANG Ziyan， et al.Determination of eight constituents in Anemarrhenae Rhizoma before and after salt processing by HPLC-MS[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs， 2017，48（9）：1784-1790.

[12]KIM N，RYU S，LEE D，et al.A metabolomic approach to determine the geographical origins of Anemarrhena Asphodeloides by using UPLC-QTOF MS [J].J Pharm Biomed Anal， 2014，92：47-52.

[13]邱昆成，孫振剛，何倩梅，等.LC-MS-MS 測定配伍黃柏對知母中4種有效成分含量的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2016，22（14）：84-88.

QIU Kuncheng，SUN Zhengang，HE Qianmei，et al.Effects of phellodendri cortex on contents of four ingredients from Anemarrhenae Rhizoma determined by LC-MS-MS[J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae， 2016，22（14）：84-88.

[14]黃玉瑤，張洪坤，路麗，等.一測多評法評價(jià)不同主產(chǎn)區(qū)春知母飲片的質(zhì)量[J].中藥材，2017，40（2）：387-391.

[15]XIE Yuanyuan， WANG Xiuming， WANG Sihuan， et al. Metabolism and pharmacokinetics of major polyphenol components in rat plasma after oral administration of total flavonoid tablet from Anemarrhenae Rhizoma[J].J Chromatogr， 2016，1026：134-144.

[16]NIAN S H， LI H J， LIU E H， et al. Comparison of α-glucosidase inhibitory effect and bioactive constituents of Anemarrhenae Rhizoma and fibrous roots[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis ，2017，145：195-202.

[17]李松林，宋景政，徐宏喜.中藥配方顆粒研究淺析[J].中草藥，2009，40（sup）：1-7.

[18]李軍山，陳鐘，彭新華，等.杜仲不同炮制品配方顆粒的紅外快速鑒別[J].河北工業(yè)科技，2016，33（6）：503-508.

LI Junshan，CHEN Zhong，PENG Xinhua，et al. Rapid identification of different processed products of Eucommia Ulmoides formula granules by FTIR[J]. Hebei Journal of Industrial Science and Technology，2016，33（6）：503-508.

[19]周維，胡昌江，戴德榮，等.丹參飲片、標(biāo)準(zhǔn)水煎劑、配方顆粒HPLC特征圖譜相關(guān)性研究[J].中國現(xiàn)代中藥，2016，18（9）：1100-1102.

ZHOU Wei，HU Changjiang ，DAI Derong， et al.Study on correlation of characteristic HPLC chromatogram of pieces，standard decoction and formula granule of Radix Salviae Miltiorrhizae[J]. Modern Chinese Medicine， 2016，18（9）：1100-1102.

[20]賀愛玲.中藥配方顆粒臨床應(yīng)用現(xiàn)狀分析及展望[J].中國藥事，2017，31（10）：1205-1209.

HE Ailing.On current status and future prospect of clinical application of TCM formula granules[J]. Chinese Pharmaceutical Affairs， 2017，31（10）：1205-1209.第35卷第3期河北工業(yè)科技Vol.35，No.3