阿莫西林克拉維酸鉀片含量測(cè)定方法的改進(jìn)

張靜巖 張煒 任風(fēng)芝 張雪霞 王海燕 孟令茹

摘要：為解決實(shí)際應(yīng)用中克拉維酸鉀峰與后相鄰雜質(zhì)的分離度達(dá)不到要求的問題，建立了一種同時(shí)測(cè)定阿莫西林克拉維酸鉀片中阿莫西林和克拉維酸鉀含量的新方法，采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）， Ultimate AQ-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以pH值為4.4的0.05 mol/L磷酸二氫鈉緩沖液為流動(dòng)相，柱溫為35 ℃，流速為1.0 mL/min ，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm 。結(jié)果表明：阿莫西林和克拉維酸鉀兩主峰與相鄰雜質(zhì)得到完全基線分離，分離度大于1.5；克拉維酸鉀對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為0.050 0～0.500 1 mg/mL時(shí)與峰面積的線性關(guān)系良好（r=0.999 8），平均回收率（n=9）為100.14%，RSD值為0.24%；阿莫西林對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為0.100 0～1.000 1 mg/mL時(shí)與峰面積的線性關(guān)系良好（r=0.999 9），平均回收率（n=9）為100.45%，RSD值為017%。與原有的《中華人民共和國(guó)藥典》方法相比，新的阿莫西林克拉維酸鉀片含量測(cè)定方法專屬性好，準(zhǔn)確度高，操作簡(jiǎn)便快捷，結(jié)果可靠，可作為一種質(zhì)量控制方法。

關(guān)鍵詞：色譜分析；阿莫西林；克拉維酸鉀；含量測(cè)定；高效液相色譜法

中圖分類號(hào)：R9781+1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：Adoi： 10.7535/hbgykj.2018yx04013

阿莫西林克拉維酸鉀片是葛蘭素史克（GSK）公司研制的由阿莫西林三水化合物和克拉維酸鉀組方的復(fù)方制劑，屬于國(guó)家基本藥物[1-2]。其中阿莫西林為廣譜青霉素類抗生素，克拉維酸鉀為競(jìng)爭(zhēng)性廣譜β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，兩者合用，可保護(hù)阿莫西林免受β-內(nèi)酰胺酶的水解，使對(duì)阿莫西林耐藥并產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌仍然對(duì)阿莫西林敏感，從而不影響阿莫西林的殺菌效果[3-4]，臨床上廣泛應(yīng)用于敏感菌引起的上呼吸道感染、下呼吸道感染、泌尿系統(tǒng)感染、軟組織及皮膚感染以及其他感染。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA） 明確規(guī)定在2018年底前需完成對(duì)“阿莫西林克拉維酸鉀片”及其原研制劑的一致性評(píng)價(jià)工作[5-9]。目第4期張靜巖，等：阿莫西林克拉維酸鉀片含量測(cè)定方法的改進(jìn)河北工業(yè)科技第35卷前，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)該藥品進(jìn)行了含量、雜質(zhì)和溶出曲線等對(duì)比研究?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《藥典》）2015版[10]所述方法在含量測(cè)定部分指出，記錄色譜圖譜應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)圖譜一致，但對(duì)分離度并未有具體的要求，而在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)克拉維酸鉀峰與后相鄰雜質(zhì)的分離度達(dá)不到要求。本文在《藥典》2015版分析方法及相關(guān)文獻(xiàn)＼[10-20＼]的基礎(chǔ)上，對(duì)阿莫西林克拉維酸鉀片含量的測(cè)定方法進(jìn)行了改進(jìn)，采用水相柱對(duì)樣品組分進(jìn)行分離，通過色譜條件優(yōu)化實(shí)現(xiàn)純緩沖鹽相作為流動(dòng)相，從而達(dá)到綠色環(huán)保檢測(cè)的要求，操作簡(jiǎn)便，且最終的分離度符合要求，效果較好。

1主要儀器與試藥

Aglient 1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司提供）；色譜柱Ultimate AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，月旭科技（上海）股份有限公司提供）；BP211D電子天平（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)提供）。

克拉維酸化學(xué)對(duì)照品（批號(hào)為130429-201307，含量為95.0%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同），中國(guó)藥品生物制品檢定所提供）；阿莫西林化學(xué)對(duì)照品（批號(hào)為130409-201011，含量為85.8%，中國(guó)食品藥品檢定研究院提供）；阿莫西林克拉維酸鉀系統(tǒng)適用性對(duì)照品（批號(hào)為130588-201202，中國(guó)食品藥品檢定研究院提供）；阿莫西林克拉維酸鉀片 （規(guī)格為0.375 g，批號(hào)為170201，170202，170203，自制）；水為超純水；磷酸二氫鈉（批號(hào)為20140728，優(yōu)級(jí)純，天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心提供）。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱為Ultimate AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為005 mol/L磷酸鹽緩沖液（0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液，取磷酸二氫鈉7.8 g，加水900 mL使之溶解，用10%磷酸溶液或氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至（4.4±0.1），加水稀釋至1 000 mL），檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，進(jìn)樣體積為20 μL，柱溫為35 ℃，流速為1.0 mL/min，分離度不低于2.0，色譜圖見圖1。

2.2溶液的配制

阿莫西林克拉維酸鉀系統(tǒng)適用性對(duì)照品溶液的配制：精密稱取適量阿莫西林克拉維酸鉀系統(tǒng)適用性對(duì)照品，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成0.8 mg/mL的溶液。

對(duì)照品溶液的配制：精密稱取適量克拉維酸對(duì)照品和阿莫西林對(duì)照品，加水超聲溶解，制成含克拉維酸0.25 mg/mL和含阿莫西林0.50 mg/mL的溶液。

供試品溶液的配制：另取阿莫西林克拉維酸鉀10片，研細(xì)，精密稱取適量，加水超聲溶解，制成含克拉維酸0.25 mg/mL和含阿莫西林0.50 mg/mL的溶液，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取阿莫西林克拉維酸鉀系統(tǒng)適用性對(duì)照品溶液、阿莫西林克拉維酸對(duì)照品溶液、供試品溶液，以及高溫、光照、酸堿和氧化的強(qiáng)制降解樣品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)所述方法進(jìn)行分析，記錄色譜圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在該色譜條件下，所有強(qiáng)降解產(chǎn)物與兩主峰分離度良好，未見輔料干擾，克拉維酸保留時(shí)間為9.82 min，阿莫西林保留時(shí)間約為21.75 min，輔料無吸收峰。表明該方法的專屬性良好。

2.4線性范圍考察

取克拉維酸對(duì)照品26.32 mg、阿莫西林對(duì)照品58.28 mg，精密稱定，用超純水配制成含克拉維酸0500 1 mg/mL和含阿莫西林1.000 1 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確移取儲(chǔ)備液1，2，4，6和8 mL，分別置于10 mL量瓶中，用超純水稀釋定容至刻度，搖勻，得到克拉維酸質(zhì)量濃度分別為005，010，020，030，040，050 mg/mL和阿莫西林質(zhì)量濃度分別為010，020，040，060，080，100 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別吸取20 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖。以對(duì)照品峰面積A為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到克拉維酸的線性方程為A=36 136 625.041 1C+112 292.364 4（r=0.999 8） ，表明克拉維酸在質(zhì)量濃度為0.050 0～0.500 1 mg/mL時(shí)與峰面積的線性關(guān)系良好；阿莫西林的線性方程為A=29 999 898.274 0C+64 788.391 8（r=0.999 9），表明阿莫西林在質(zhì)量濃度為0100 0～1000 1 mg/mL時(shí)與峰面積的線性關(guān)系良好。結(jié)果見表1。

2.5回收率試驗(yàn)

按處方比例稱取輔料和阿莫西林原料制成的無克拉維酸鉀的空白輔料，分成9等份，3 份為一組，分別精密加入一定量的克拉維酸鉀對(duì)照品，充分混

合均勻后置于100 mL 量瓶中，按“2.1”項(xiàng)所述方法進(jìn)行分析，記錄色譜圖。按處方比例稱取輔料和克拉維酸鉀原料制成的無阿莫西林的空白輔料，分成9等份，3 份為一組，分別精密加入一定量的阿莫西林對(duì)照品，充分混合均勻后置于100 mL 量瓶中，按“2.1”項(xiàng)所述方法進(jìn)行分析，記錄色譜圖。結(jié)果見表2。

2.6檢測(cè)限和定量限試驗(yàn)

取阿莫西林對(duì)照品適量，加入超純水溶解，配制成質(zhì)量濃度為0.101 1 mg/mL的溶液，然后逐步稀釋至原質(zhì)量濃度的1/100 ，1/500 ，1/1 000，1/5 000 ，1/10 000，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，最小檢出限為10.11 ng/mL（S/N=3），最小定量限為20.22 ng/mL（S/N=10）。

取克拉維酸鉀對(duì)照品適量，加入超純水溶解，配制成質(zhì)量濃度為0.100 4 mg/mL的溶液，然后逐步稀釋至原質(zhì)量濃度的1/100 ，1/500 ，1/1 000，1/2 000，1/5 000，1/10 000，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得最小檢出限為10.04 ng/mL（S/N=3），最小定量限為50.20 ng/mL（S/N=10）。

2.7精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2”項(xiàng)同一對(duì)照品溶液20 μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，以相應(yīng)的色譜峰的面積計(jì)算RSD值，阿莫西林為0.15%、克拉維酸為0.07%（n=6），結(jié)果見表3。結(jié)果表明，儀器的精密度良好。

2.8重復(fù)性試驗(yàn)

取阿莫西林克拉維酸鉀片樣品（規(guī)格為0.375 g，批號(hào)為170201），配制成供試樣品溶液6份，按“2.1”項(xiàng)所述色譜條件重復(fù)測(cè)定阿莫西林和克拉維酸鉀含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同），結(jié)果見表4 。結(jié)果表明，該方法的重復(fù)性良好。

2.9穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同批阿莫西林克拉維酸鉀片樣品（規(guī)格為 0375 g，批號(hào)為170201），按“2.2”項(xiàng)所述方法制備供試品溶液，室溫放置，按“2.1”項(xiàng)色譜條件分別于0，2，4，6和8 h進(jìn)樣分析，記錄供試品溶液各色譜圖的峰面積，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，供試品溶液在8 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

3樣品測(cè)定

按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算克拉維酸鉀和阿莫西林的含量，分別用新方法和《藥典》方法對(duì)3批樣品的含量進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如表6和表7所示。比較表6和表7中2種方法的測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新方法中主峰與雜質(zhì)峰達(dá)到基線分離，分離度大于1.5。

4結(jié)語

1）本文所述新方法采用Ultimate AQ-C18色譜柱、純緩沖鹽A相作為流動(dòng)相進(jìn)行等梯度洗脫，減少了有害溶劑的使用，將對(duì)人體的傷害降到最低，達(dá)到了綠色環(huán)保檢測(cè)的效果。

2）克拉維酸鉀尾部雜質(zhì)被完全分離出，與相鄰雜質(zhì)能夠?qū)崿F(xiàn)完全基線分離，且克拉維酸鉀峰與其前鄰雜質(zhì)峰的分離度達(dá)到3.8，與其后雜質(zhì)峰的分離度達(dá)到5.0；阿莫西林主峰與其前峰的分離度達(dá)到23，與其后峰的分離度達(dá)到7.9，均優(yōu)于《藥典》條件。

3）按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算克拉維酸鉀和阿莫西林的含量，新方法中主峰與雜質(zhì)峰達(dá)到基線分離，分離度大于1.5，較好地解決了《藥典》方法峰型拖尾和分離度不好等問題。新方法的專屬性好，準(zhǔn)確度高，操作簡(jiǎn)便快捷，結(jié)果可靠，可作為質(zhì)量控制方法。

4）本研究雖然相比《藥典》方法分離度好，使用的溶劑綠色環(huán)保，但尚存在不足之處，如分析時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致分析效率較低。未來需要在縮短分析時(shí)間方面加以深入研究，建議采用UPLC進(jìn)行分析，因?yàn)樵诜蛛x色譜峰時(shí)，UPLC的分離度高出HPLC 1倍，甚至更多，分析時(shí)間也縮短為HPLC的1/3，分辨率和靈敏度也能得到有效提高[21]。在條件允許的情況下，采用UPLC對(duì)該品種進(jìn)行分析將是不錯(cuò)的選擇。

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