艾灸對荷瘤胃癌大鼠外周血中CD3—CD161+NK 與CD3+CD161+NKT含量的影響

歐陽里知　譚靜

〔摘要〕 目的 探討艾灸對荷瘤模型大鼠外周血中CD3-CD161+NK（Nature kill cell，自然殺傷細胞）、CD3+CD161+NKT（Nature kill T cell，自然殺傷T細胞）含量的影響。方法 50只健康SD大鼠，雌雄各半，隨機分為空白組、假手術組、模型組、艾灸組、紅外組5組，每組10只。采用Walker-256細胞株來源的瘤組織原位種植法制備胃癌模型。造模成功后艾灸組進行中脘、足三里等穴位懸灸，紅外組進行腹背部胃體表投影區(qū)域的短波紅外線照射，每次20 min，每日1次，連續(xù)21 d。期間密切觀察大鼠行為學變化，記錄體質量、飲食、飲水情況。第22天，各組大鼠禁食不禁水12 h后，眼眶采血，流式細胞法測外周血中CD3-CD161+NK、CD3+CD161+NKT含量變化。結果 與空白組比較，模型組大鼠成模后體質量、食量明顯降低，外周血中CD3+CD161+NKT增加（P<0.05）。與模型組比較，艾灸組大鼠干預中、后期體質量，食量增加，外周血中CD3-CD161+NK、CD3+CD161+NKT增加（P<0.05）。與紅外組比較，艾灸組大鼠體質量、食量、外周血中CD3-CD161+NK、CD3+CD161+NKT增加更明顯（P<0.05）。結論 艾灸能增加胃癌SD大鼠體質量，恢復食量，改善胃癌大鼠狀態(tài)，其機制可能與外周血中CD3-CD161+NK、CD3+CD161+NKT含量增加，細胞免疫增強有關。

〔關鍵詞〕 胃癌；艾灸；模型大鼠；CD3-CD161+NK；CD3+CD161+NKT

〔中圖分類號〕R245.8；R735.2 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.05.014

Effect of Moxibustion on CD3-CD161+ NK and CD3+CD161+ NKT in Peripheral

Blood of Tumor Bearing Gastric Carcinoma Rats

OUYANG Lizhi， TAN Jing， ZHAO Huan， PENG Zhuojun， DAI Liwen， CHEN Yupan， LI Tielang， LIN Yaping*

（Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To discuss the effect of moxibustion on CD3-CD161+NK and CD3+CD161+ NKT in peripheral blood of tumor bearing gastric carcinoma rats. Methods 50 healthy SD rats were randomly divided into 5 groups： blank group， control group， model group， moxibustion group and infrared group， 10 rats in each group， half male and half female. Walker-256 cells were used to prepare gastric carcinoma model by situ implantation of tumor tissue. Moxibustion group was given suspended moxibustion at zhongwan （CV12）， Zusanli （ST36）. The infrared group was given short wave infrared radiation for 20 minutes on the stomach and lower back， once daily. The changes of behavior were observed， and body mass， diet and drinking water were recorded. At the 22nd day， after fasting for 12 hours， orbital blood of rats were collected. The changes of CD3-CD161+ NK and CD3+CD161+ NKT in peripheral blood were determined by flow cytometry instrument. Results Compared with blank group， the body mass and eating capacity in model group decreased significantly （P<0.05）， and CD3+CD161+ NKT in peripheral blood increased （P<0.05）. Compared with model group， quality and eating capacity of rats in later period treatment improved in moxibustion group obviously （P<0.05）， and CD3-CD161+NK， CD3+CD161+ NKT in peripheral blood increased （P<0.05）. Compared with infrared group， the improvement of body mass and eating capacity was more obvious in moxibustion group， and CD3-CD161+NK， CD3+CD161+ NKT increased in peripheral blood （P<0.05）. Conclusion Moxibustion could increase body mass， recover eating capacity， and improve state of SD rats with gastric carcinoma. The mechanism may be related to the increase of CD3-CD161+ NK and CD3+CD161+ NKT in peripheral blood and enhancement of NK cell immunization.

〔Keywords〕 gastric carcinoma； moxibustion； model rats； CD3-CD161+ NK； CD3+CD161+ NKT

胃癌（gastric carcinoma），是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其早期癥狀不顯著，可見不明原因的上腹部不適、隱痛、噯氣、泛酸、食欲減退及輕度貧血等類似胃十二指腸潰瘍或慢性胃炎癥狀。晚期見腹痛、惡心嘔吐、厭食等癥狀，體征見明顯增大的胃或臍周結節(jié)及板狀樣腫塊、消化性潰瘍、Virchows結節(jié)（左鎖骨上結節(jié)）、腹水、黑便、體質量下降及惡性貧血，嚴重影響人類生活、生存質量。腫瘤的發(fā)生發(fā)展，與機體免疫功能有著密切的聯系，本研究以CD3-CD161+NK與CD3+CD161+NKT在外周血的表達為指標，探討艾灸對胃癌的作用及與CD3-CD161+NK和CD3+CD161+NKT的關系，并與紅外治療對比觀察，欲揭示艾灸激發(fā)機體內源性保護機制對胃癌的治療作用。

1 材料與分組

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康SPF級SD雄性大鼠6只，體質量160～180 g，用于模型制備；健康SPF級SD大鼠50只，雌雄各半，體質量（209±19） g，用于分組實驗。以上動物由中國食品藥品檢定研究院提供[合格證號：SCXK（京）2014-0013]，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院SPF級動物實驗中心。實驗環(huán)境的濕度50%～70%，溫度20～25 ℃。實驗全程均遵循中華人民共和國科技部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》以及相關動物實驗倫理學規(guī)定進行大鼠的干預處理。

1.1.2 施灸材料 艾條（直徑0.7 cm，長沙艾醫(yī)生物科技）；自制大鼠艾灸架。

1.1.3 主要試劑 戊巴比妥鈉（Biotobbed）；PBS溶液（中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院提供）；紅細胞溶解液、淋巴細胞分離液（華美生物）；CD3-APC（美國eBioscience公司） CD161- PerCP-eFluorTM 710 （美國eBioscience公司）。

1.1.4 主要儀器 流式細胞儀（LSRII型，美國Becton Dickinson公司）；6002B型紅外線治療儀（徐州天飛電子設備有限公司）；低速離心機（LD5-10B型，北京京立）。

1.1.5 動物分組 隨機數字表法，將50只健康SPF級SD大鼠分為正常組和造模組，正常組20只，造模組30只。正常組分為空白組和假手術組，每組10只；造模成功后，再將造模組分為模型組、艾灸組和紅外組，每組10只?？瞻捉M正常飼養(yǎng)，模型組、艾灸組和紅外組造胃癌模型，假手術組行胃癌模型模擬術（開腹、刺激胃壁、關腹，皮下注射青霉素），模型成功后開始干預，綁縛固定各組大鼠（腹、背隔日交替綁于鼠板），艾灸組行穴位懸灸，紅外組行紅外照射，空白組、假手術組和模型組僅綁于鼠板固定，各組每次操作20 min，每日1次，持續(xù)21 d。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模方法 采用Walker-256細胞株來源的癌組織原位種植法復制大鼠胃癌模型[1-4]：0.3 mL（2×107個/mL）Walker-256細胞的懸液注射入3只（體質量160～180 g）大鼠腹腔，7 d后形成癌性腹水；處死大鼠，收集腹水中癌細胞，調整濃度為5×106個/mL，取3只體質量160～180 g的大鼠，于前、后肢皮下注射0.2 mL；7 d后可見注射部位形成大小約2 cm×2 cm×2 cm的皮下實體瘤；處死實體瘤大鼠，取5 cm×5 cm×5 mm大小的瘤組織移植于模型組、艾灸組、紅外組大鼠胃竇部胃壁，關腹，青霉素40萬U溶解后0.2 mL/只皮下注射。假手術組模擬瘤組織移植過程。

7 d后剖腹探查，胃壁種植區(qū)形成直徑約1 cm腫瘤，表面光滑，邊界清晰，無明顯臟器侵犯。

1.2.2 艾灸方法 施灸穴位選取中脘、關元、足三里（雙）為一組，另一組為脾俞（雙）、胃俞（雙）。穴位定位參考李忠仁主編《實驗針灸學》常用動物穴位定位法結合擬人法選取。艾灸組造模成功后，兩組穴位隔日交替施灸。施灸時，將大鼠仰/俯臥位固定于鼠板上，將艾條固定在自制艾條架，點燃艾條，調整艾條燃點至穴位垂直上方2～3 cm，使表皮溫度達42 ℃左右，大鼠實驗溫度計實時監(jiān)測，及時調整艾條燃點與穴位的距離。每次20 min，每日1次，連續(xù)干預21 d。

1.2.3 紅外照射方法 紅外組造模成功后，采用紅外治療儀（0.4～3 μm的短波紅外線，強度1，光斑直徑3 cm）隔日交替照射穴位對應的腹、背部胃體表投影區(qū)域，確保表皮溫度達42 ℃左右，大鼠實驗溫度計實時監(jiān)測，及時調整紅外儀探頭與照射部位的距離。每次20 min，每日1次，連續(xù)干預21 d。

1.3 觀察指標及檢測方法

1.3.1 體質量、飼料測量 自造模當日開始，每隔4 d稱量各組大鼠體質量，記錄每日飼料食用量。

1.3.2 外周血中CD3-CD161+NK，CD3+CD161+NKT含量檢測 各組大鼠于干預起第22天，禁食不禁水12 h后，眼眶采血2 mL用于流式檢測。檢測時，取新鮮抗凝大鼠外周血100 ？滋L加入流式管底部，分別加入CD3 APC/CD161 PerCP-eFluorTM 710熒光標記抗體；混勻后室溫避光孵育20 min；加入2 mL紅細胞裂解液，混勻，室溫避光裂解紅細胞10 min；300 g離心5 min，棄上清，加入2 mL PBS混勻，300 g離心5 min，棄上清；加入500 ？滋L PBS混勻用流式細胞儀采用FACS Diva 6.0分析軟件進行分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

所有數據使用SPSS 21.0 for Windows軟件進行分析處理，計量資料以“x±s”表示。所有數據資料進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布者，多組計量資料比較采用單因素方差分析（One way ANOVA）。組間比較，方差齊者用LSD法，不齊者用Games-Howell法檢驗；不符合正態(tài)分布者用秩和檢驗（Kruskal-Wallis）；以P<0.05定義差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量的比較

造模前各造模組大鼠體質量差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。成模后模型組與空白組比較，體質量明顯降低（P<0.05）。干預前期（Day8），艾灸組與模型組體質量比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。干預中、后期（Day12-28），艾灸組體質量較模型組有明顯上升（P<0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠食量的比較

造模前各組大鼠食量差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。成模后，模型組與空白組比較，食量明顯降低（P<0.05）。干預前期（Day8），艾灸組與模型組食量比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。干預中、后期（Day12-28），艾灸組食量較模型組、紅外組有明顯上升（P<0.05）。見表2。2.3 各組大鼠外周血中CD3-CD161+NK，CD3+CD161+NKT含量比較

與空白組比較，模型組CD3+CD161+NKT水平升高（P<0.05）；與模型組比較，艾灸組CD3-CD161+NK，CD3+CD161+NKT含量明顯增加（P<0.05）；紅外組CD3-CD161+NK，CD3+CD161+NKT含量較空白組增加，但艾灸組較紅外組CD3+CD161+NKT含量增加更明顯（P<0.05）。見表3。

3 討論

艾灸是中醫(yī)療法的重要組成部分，幾千年來為人民的保健和治療疾病作出了重要貢獻。《醫(yī)學入門·針灸》：“凡藥之不及，針之不到，必須灸之?！薄睹t(yī)別錄》稱“艾味苦，微溫，無毒，主灸百病”。中醫(yī)學認為艾灸可通過艾葉的藥理作用，溫熱刺激，激活經絡氣血，起到溫補、溫通的作用。故《備急灸法》將艾灸列為保命救人第一要法。現代臨床研究[5-7]顯示：艾灸能通過調節(jié)患者免疫功能，改善胃癌患者倦怠乏力、惡心嘔吐、厭食、腹脹便秘、失眠、消瘦等臨床癥狀；輔助改善進展期胃癌患者生活質量，延長生存期。動物實驗[8-11]顯示：艾灸能促進胃潰瘍大鼠損傷胃黏膜的增殖修復，艾灸足陽明胃經穴預處理對胃黏膜損傷具備保護作用，辰時艾灸相較其他時間對胃黏膜損傷的的修復作用更好；艾灸能明顯抑制小鼠惡性淋巴瘤的生長，延長生存期；艾灸相應腧穴能抑制小鼠實體瘤與腹水瘤的生長，降低荷瘤動物死亡率；表明艾灸對胃黏膜損傷、惡性腫瘤具有較好的治療作用。眾研究從多方面證實艾灸對提高機體免疫力，改善消化系統(tǒng)功能，調節(jié)神經功能，調整多系統(tǒng)功能具有重要作用。同時也證實了艾灸對癌性疼痛有較好緩解作用[5]，能改善患者造血功能，提高白細胞數，減輕放化療引起的免疫（骨髓）抑制，提高機體免疫力，增加抗腫瘤作用[12-14]。

本實驗制備大鼠胃癌模型，艾灸足三里、中脘、關元、脾俞、胃俞，觀察對胃癌大鼠的影響，并對比紅外治療組大鼠體質量、食量的改變，結果顯示艾灸對胃癌大鼠體質量增加有一定作用，對胃癌大鼠食量恢復有促進作用。

CDl61是NK細胞和NKT細胞共同表達的特有標志，在免疫調節(jié)中起重要作用；NK細胞（標志物CD3-CD161+）及NKT細胞（標志物CD3+CD161+）可直接殺傷惡變腫瘤細胞和被病毒感染細胞，是機體殺傷清除腫瘤細胞的第一道防線[15-16]；兩者在數量或功能方面的變化，可能影響機體免疫功能，對腫瘤的發(fā)展、預后及轉歸產生影響[17]，因此荷瘤大鼠外周血中CD3-CD161+NK，CD3+CD161+NKT的含量部分反映了機體荷瘤狀態(tài)下非特異性免疫應答的狀態(tài)；而研究顯示：活化的NK細胞能夠更有效地消除腫瘤的生長[18-19]，因而增強NK細胞的含量及其殺傷活性成為很具潛力的機體自身抗腫瘤的免疫治療途徑。NKT細胞具備較廣的抗瘤譜和較強的抗瘤效果，在抗腫瘤免疫治療中前景廣闊[20-21]，NKT細胞通過T細胞受體（TCR）識別樹突狀細胞（DC）的CD1d提呈的α-Galcer，與其表面CD分子分別作用于DC表面相應分子，激活DC產生白細胞介素12（IL-12）和白細胞介素18（IL-18），再作用于NKT細胞表面受體，分泌高水平的白細胞介素4（IL-4）和干擾素γ（IFN-γ）[22]，刺激活化T細胞和巨噬細胞，另外IFN-γ能增強NK細胞殺傷能力，以發(fā)揮免疫調節(jié)、抗腫瘤效應；也有研究證實：NKT細胞能分泌激活NK細胞的IFN-β，通過NKT細胞表面的NK1.1激活NK細胞的殺傷活性[23]，而NK細胞直接執(zhí)行殺傷作用，發(fā)揮抗腫瘤作用。本實驗結果提示模型組可能由于胃壁腫瘤種植，刺激機體反應性CD3+CD161+NK細胞含量增加，初步激發(fā)了機體的非特異性抗腫瘤免疫，但可能由于CD3+CD161+NK細胞含量不足以達到顯著抗腫瘤效應，故對于荷瘤大鼠體質量、食量狀況改善不顯著；而艾灸組CD3-CD161+NK細胞，CD3+CD161+NKT細胞含量增加明顯，結合對各組大鼠體質量、食量變化的觀測，提示NK細胞、NKT細胞含量的增加，強化了機體非特異性抗腫瘤免疫，進而增加大鼠體質量，恢復大鼠食量，對腫瘤大鼠存在一定治療作用。

綜上所述，結合本實驗結果，可以認為：艾灸對于增加胃癌大鼠體質量、恢復食量，改善荷瘤胃癌大鼠生存狀態(tài)，具有一定的治療作用，且效果優(yōu)于紅外線治療，其作用機制可能與外周血中CD3-CD161+NK，CD3+CD161+NKT含量的上升，機體細胞免疫增強相關。但具體細胞免疫途徑及作用機制尚無法經過本實驗數據得以證實。本次實驗的不足在于未檢測外周血中抗腫瘤相關因子含量，CD3-CD161+NK，CD3+CD161+NKT的細胞活性及腫瘤組織周圍CD3-CD161+NK，CD3+CD161+NKT含量與活性，且并未對CD3-CD161+NK，CD3+CD161+NKT含量進行動態(tài)監(jiān)測，以后的研究應加入此類指標的觀測，進一步證明艾灸對胃癌大鼠的治療作用及其與非特異性免疫機制的關系。

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