蠐螬不同途徑給藥對干性年齡相關(guān)性黃斑變性模型Caspase—3、FasL、TNF—α、NF—κB表達(dá)的影響

譚涵宇　李建超

〔摘要〕 目的 研究蠐螬提取物口服和滴眼兩種途徑對年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）模型干預(yù)機(jī)制。方法 采用光損傷方法建立干性AMD活體模型，分別予以蠐螬提取物口服和滴眼，用藥4周后，觀察其對各細(xì)胞層半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cysteine aspastic acid-specific protease 3，Caspase-3）、核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、跨膜蛋白（Fas ligand，F(xiàn)asL）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）表達(dá)的影響。結(jié)果 與空白組比較，模型組視網(wǎng)膜組織中的Caspase-3表達(dá)明顯下降，F(xiàn)asL、TNF-α、NF-κB表達(dá)均增強(qiáng)（P<0.05），口服組和滴眼組組織中各項指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與模型組比較，口服組和滴眼組中Caspase-3表達(dá)明顯升高，F(xiàn)asL、TNF-α、NF-κB表達(dá)明顯降低；與口服組比較，滴眼組所有指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 蠐螬提取物對感光細(xì)胞等細(xì)胞凋亡具有調(diào)節(jié)作用，表現(xiàn)為早期抑制，晚期促進(jìn)。其調(diào)節(jié)作用可能是通過抑制或促進(jìn)細(xì)胞凋亡關(guān)鍵因子Caspase-3表達(dá)實現(xiàn)的，同時通過抑制炎癥相關(guān)因子FasL、TNF-α、NF-κB表達(dá)對慢性炎癥具有抑制作用。

〔關(guān)鍵詞〕 蠐螬提取物；給藥途徑；年齡相關(guān)性黃斑變性；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；腫瘤壞死因子α；跨膜蛋白；核轉(zhuǎn)錄因子κB

〔中圖分類號〕R285.5；R774.1 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.05.003

Effect of Different Drug Administration Approaches of Grub on the Expression of Caspase-3，

FasL， TNF-α and NF-κB of Age-Related Macular Degeneration Models

TAN Hanyu1， LI Jianchao1，2*， PENG Jun1， WEN Xiaojuan1， ZHOU Yasha1， PENG Qinghua1*

（1. Key Discipline of Ophthalmology of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China；

2. Department of Ophthalmology， Shaanxi Hospital of TCM， Xi'an， Shaanxi 7100001， China）

〔Abstract〕 Objective To study the interventional mechanism of oral administration and eye drops of the grub extract on the age-related macular degeneration （AMD） model. Methods A Dry AMD living model was established by light damage method. Models were given grubs extract oral administration and eye drops respectively. After 4 weeks， the expression of cysreine aspastic acid-specific protease 3 （Caspase-3）， nuclear factor-κB （NF-κB）， Fas ligand （FasL）， tumor necrosis factor-α （TNF-α） was observed. Results Compared with the blank group， the expression of Caspase-3 in the retina tissue of model group decreased significantly， and the expression of FasL， TNF-α and NF- κB increased （P<0.05）. Compared with the blank group， all indexes of the oral and eye drops groups had no significant difference （P>0.05）. Compared with the model group， the expression of Caspase-3 increased significantly in the oral group and the eye drops group， and the expression of FasL， TNF-α and NF-κB decreased significantly. Compared with the oral group， there was no significant difference in all indicators in the eye drops group （P>0.05）. Conclusion Grub extract has regulating action on photoreceptor cells apoptosis， such as performance for early suppression and lately acceleration. Its regulating effect is probably achieved by inhibiting or promoting the expression of Caspase-3. Grub extract shows inhibiting effect on chronic inflammation by inhibiting the expression of related inflammation factors， such as FasL， TNF-α， NF-κB.

〔Keywords〕 grub extract； administration route； age-related macular degeneration； cysreine aspastic acid-specific protease-3； tumor necrosis factor-α； fas ligand； nuclear factor-κB

年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD），是一種與年齡有關(guān)的黃斑區(qū)視網(wǎng)膜組織退行性病變，本課題組前期研究證實：蠐螬提取物對大鼠視網(wǎng)膜的光損傷具有保護(hù)作用，可以促進(jìn)HSP79的高表達(dá)，使視網(wǎng)膜視神經(jīng)細(xì)胞得到有效保護(hù)，可減輕組織損傷[1-2]；能增強(qiáng)視網(wǎng)膜組織中堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）的表達(dá)、抑制神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）的表達(dá)，促進(jìn)光凝后的視網(wǎng)膜修復(fù)[3]；能促進(jìn)實驗性有色兔脈絡(luò)膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）中血管生成素1（angiopoietin-1，Angl）的高表達(dá)，減少色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived Factor，PEDF）的表達(dá)，也可以抑制有色家兔CNV中的血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和bFGF，從而抑制CNV的形成[4-5]。蠐螬可通過活化 NF-κB信號通路，有效地減輕光損傷誘發(fā)的光感受器細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮防護(hù)作用[6]。蠐螬還能夠改善視網(wǎng)膜局部微循環(huán)，減輕缺血缺氧對血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害[7]。本實驗擬通過對蠐螬提取物口服、滴眼兩種給藥途徑干預(yù)治療干性AMD模型大鼠眼。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年SD大鼠40只，SPF級，體質(zhì)量180～220 g，實驗前排除全身性及眼部疾患，動物由湖南斯萊克景達(dá)動物實驗有限公司提供，許可證號：SYXK（湘）2013-0004，在湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心清潔級條件下飼養(yǎng)。

1.2 主要藥品及試劑

蠐螬提取物：由湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院提供，分別按藥物制劑工藝制成口服、滴眼劑[8]。

NF-κB一抗兔源性抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：Bs-0465R），TNF-α一抗兔源性抗體（武漢博士德生物工程有限公司，批號：BA0131），F(xiàn)asL一抗兔源性抗體（武漢博士德生物工程有限公司，批號：BA0049），Caspase-3一抗兔源性抗體（武漢博士德生物工程有限公司，批號：BA2142），SP-9000通用型免疫組化染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：WP132713）DAB濃縮型顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：K142415E）。

1.3 主要儀器

裂隙燈顯微鏡（日本托普康公司），YD-A型生物組織攤片機(jī)（上海金迪生物技術(shù)工程有限公司），Motic BA410研究型顯微鏡（麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司），Motic 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司），Leica石蠟切片機(jī)（德國Leica公司），H7700透射電子顯微鏡（日本日立公司），Eppendoff centifuge 58108高速冷凍離心機(jī)（長沙平凡儀器儀表有限公司）。

1.4 分組及干預(yù)

選用8周齡SD大鼠40只隨機(jī)分成A、B、C、D 4組，分別為：空白組（A組）、模型組（B組）、口服組（C組）、滴眼組（D組）。C組予以蠐螬提取物口服劑灌胃，1次/d，5.6 g/（kg·d），D組予以蠐螬提取物局部滴眼，4次/d，A、B、D組每日以生理鹽水2 mL灌胃，A、B、C各組同時予以玻璃酸鈉滴眼液滴眼，4次/d，1滴/次。在造模起分別開始給藥，連續(xù)4周。

1.5 視網(wǎng)膜光損傷模型的建立

采用自制光化學(xué)損傷裝置[6]：在光照架的6個面分別放置1根40 W的白色熒光燈管。調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度，并用ZDS-10型數(shù)字式照度計測定大鼠活動水平多點照度，平均為（2 000±200）1x。動物房的室溫控制在21～24 ℃，光照箱內(nèi)的平均溫度為22～25 ℃。所有實驗動物在12 h明（30～50 1x）及12 h暗環(huán)境下循環(huán)光環(huán)境適應(yīng)7 d，自由攝食水。7 d后光照前先暗適應(yīng)24 h，然后光照12 h（晚上8：00-次日早上8：00），再進(jìn)行暗適應(yīng)12 h，連續(xù)3個循環(huán)，光照時間總計為36 h。大鼠不散瞳，可在光照箱內(nèi)自由活動，光照后送回暗環(huán)境中飼養(yǎng)?？瞻捉M不施行光照試驗。

1.6 取材及指標(biāo)檢測

給藥結(jié)束后，2%戊巴比妥鈉過量（>0.2 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，固定大鼠，摘除眼球，眼球標(biāo)記定位。各組眼球經(jīng)多聚甲醛固定，免疫組化檢測（參照試劑盒說明書操作步驟）核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）、膜表面分子（FasL）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）；采用Motic 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)定量測量， 視網(wǎng)膜各組織細(xì)胞層Caspase-3、FasL、TNF-α、NF-κB等指標(biāo)的陽性積分光密度。

1.7 統(tǒng)計方法

所有實驗數(shù)據(jù)以“x±s”表示，用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。各組間光密度值采用單因素方差分析ANOVA，并進(jìn)行方差齊性檢驗，組間兩兩比較用采用LSD（L）檢驗，Dunnett（E）雙側(cè)控制。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01表示差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蠐螬提取物對視網(wǎng)膜組織Caspase-3表達(dá)的影響

空白組視網(wǎng)膜內(nèi)界膜及內(nèi)核層細(xì)胞漿細(xì)胞核中Caspase-3陽性物質(zhì)表達(dá)較少，呈棕黃色，視網(wǎng)膜各層組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊。模型組視網(wǎng)膜內(nèi)界膜、內(nèi)核層、外核層細(xì)胞漿細(xì)胞核中Caspase-3陽性物質(zhì)表達(dá)明顯，呈棕褐色，視網(wǎng)膜各層組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂?？诜M和滴眼組視網(wǎng)膜內(nèi)界膜、內(nèi)核層細(xì)胞核及細(xì)胞漿中Caspase-3陽性物質(zhì)表達(dá)程度明顯較模型組減少，呈棕黃色，滴眼組減少更為明顯，視網(wǎng)膜各層組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊。見圖1。

2.2 蠐螬提取物對視網(wǎng)膜組織FasL表達(dá)的影響

空白組視網(wǎng)膜各層細(xì)胞漿細(xì)胞核中FasL陽性物質(zhì)表達(dá)較少，呈棕黃色，視網(wǎng)膜各層組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊。模型組各層細(xì)胞漿細(xì)胞核中FasL陽性物質(zhì)表達(dá)明顯，呈棕褐色，視網(wǎng)膜各層組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂?？诜M和滴眼組各層細(xì)胞漿細(xì)胞核中FasL陽性物質(zhì)表達(dá)程度明顯較模型組減少，呈棕黃色，視網(wǎng)膜各層組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊。見圖2。

2.3 蠐螬提取物對視網(wǎng)膜組織TNF-α表達(dá)的影響

空白組視網(wǎng)膜各層細(xì)胞漿中TNF-α陽性物質(zhì)表達(dá)較少，呈淺黃色，視網(wǎng)膜各層組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊。模型組內(nèi)界膜、神經(jīng)纖維層、內(nèi)外叢狀層、內(nèi)顆粒層以及光感受器內(nèi)節(jié)細(xì)胞漿中TNF-α陽性物質(zhì)表達(dá)明顯增多，呈棕褐色，視網(wǎng)膜內(nèi)外顆粒層組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂?？诜M和滴眼組各層細(xì)胞漿中TNF-α陽性物質(zhì)表達(dá)程度明顯較模型組減少，呈棕黃色，視網(wǎng)膜各層組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊。見圖3。

2.4 蠐螬提取物對視網(wǎng)膜組織NF-κB表達(dá)的影響

空白組視網(wǎng)膜內(nèi)界膜、感光細(xì)胞外節(jié)NF-κB陽性物質(zhì)少量表達(dá)，呈淺黃色，視網(wǎng)膜各層組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊。模型組內(nèi)界膜、神經(jīng)纖維層、內(nèi)外叢狀層以及光感受器外節(jié)中NF-κB陽性物質(zhì)表達(dá)較多，呈棕黃色?？诜M和滴眼組內(nèi)界膜、感光細(xì)胞外節(jié)NF-κB陽性物質(zhì)少量表達(dá)，呈淺黃色，視網(wǎng)膜各層組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊。見圖4。

2.5 各組視網(wǎng)膜Caspase-3、FasL、TNF-α、NF-κB的光密度值檢測結(jié)果

給藥4周后檢測，視網(wǎng)膜組織中FasL、TNF-α、NF-κB表達(dá)均增強(qiáng)，經(jīng)蠐螬提取物口服或滴眼后，在一定程度上抑制了其高表達(dá)。與空白組比較，模型組視網(wǎng)膜組織中的Caspase-3表達(dá)明顯下降，F(xiàn)asL、TNF-α、NF-κB表達(dá)均增強(qiáng)（P<0.05），口服組和滴眼組組織中各項指標(biāo)均無顯著性差異（P>0.05）；與模型組比較，口服組和滴眼組中Caspase-3表達(dá)明顯升高，F(xiàn)asL、TNF-α、NF-κB表達(dá)明顯降低（P<0.05）；與口服組比較，滴眼組中Caspase-3、FasL、TNF-α、NF-κB的光密度值均無顯著性差異（P>0.05）。見表1。3 討論

蠐螬為金龜子幼蟲。味咸，微溫，有小毒，歸肝經(jīng)。具有破血、行瘀、散結(jié)、通乳的作用，可治療折損瘀痛、痛風(fēng)、破傷風(fēng)、喉痹、目翳、丹毒、癰疽、痔漏。含有豐富的氨基酸、多肽或蛋白質(zhì)、脂肪、外細(xì)胞糖酶，蔗糖酶等多種酶；Cu、Mn含量非常豐富，Ca、Mg、Cr、Fe、Zn含量其次，K/Na的比值也很高；B族維生素的含量較高，維生素A和維生素E的含量也較豐富[9]。其藥理作用主要有收縮血管、利尿、抗腫瘤、抗菌、保肝等作用。

大量的實驗研究發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、色素上皮細(xì)胞均存在細(xì)胞凋亡，視網(wǎng)膜的發(fā)育過程中神經(jīng)細(xì)胞的凋亡對神經(jīng)細(xì)胞的增生、遷移與死亡發(fā)揮著重要的作用，一旦生長與死亡之間的平衡遭到破壞，將導(dǎo)致視網(wǎng)膜的發(fā)育異常[10-13]。目前認(rèn)識的細(xì)胞凋亡的通路主要有兩條：膜受體通路、細(xì)胞色素C釋放和Caspases激活的生物化學(xué)途經(jīng)。不管那條途徑，Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡過程中是起著必不可少的作用，細(xì)胞凋亡的過程實際上是Caspase不可逆有限水解底物的級聯(lián)放大反應(yīng)過程。

本實驗結(jié)果表明：在光損傷4周后，光損傷活體干性AMD動物模型眼Caspase-3的表達(dá)降低，而經(jīng)蠐螬提取液干預(yù)治療后，其表達(dá)又有所恢復(fù)，維持到正常水平。而前期研究顯示：造模1周后，模型組Caspase-3表達(dá)升高，蠐螬提取液可以降低視網(wǎng)膜組織中Caspase-3，兩者結(jié)果似乎存在矛盾。Caspase-3作為細(xì)胞凋亡的效應(yīng)凋亡蛋白酶，對細(xì)胞的凋亡起到承上啟下的作用，因此Caspase-3的表達(dá)與視網(wǎng)膜感光細(xì)胞等細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，其表達(dá)程度在一定程度上反應(yīng)了細(xì)胞凋亡程度。本實驗結(jié)合前期實驗證實：在動物眼光損傷初期，存在Caspase-3高表達(dá)，光損傷導(dǎo)致感光細(xì)胞等細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而在4周后Caspase-3表達(dá)受到抑制。這與Lee等[11]研究：特定波長和強(qiáng)度的綠色光源對鼠視網(wǎng)膜的損傷，發(fā)現(xiàn)持續(xù)光照24 h，感光細(xì)胞喪失25%～50%，隨光照時間延長，感光細(xì)胞喪失，速度明顯減慢，直至2～4周后，感光細(xì)胞處于穩(wěn)定狀態(tài)。幾乎一致，即在光損傷早期即出現(xiàn)感光細(xì)胞凋亡，到后期感光細(xì)胞凋亡維持穩(wěn)態(tài)甚至有所減少。蠐螬提取液在光損傷早期（1周），可以降低Caspase-3的高表達(dá)，而在晚期（4周）可以使低的Caspase-3的有所升高，維持正常水平，從而證實蠐螬提取液對感光細(xì)胞的凋亡早期有抑制作用，而晚期對細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用，其對視網(wǎng)膜組織的細(xì)胞凋亡具有調(diào)節(jié)維持穩(wěn)態(tài)的作用。也正是這種調(diào)節(jié)作用使脫落的感光細(xì)胞外節(jié)及衰老喪失功能的細(xì)胞及殘雜得以有效清除，維持了視網(wǎng)膜組織原有的新陳代謝、有助于重新恢復(fù)細(xì)胞死亡與增殖的平衡。

造模4周后，視網(wǎng)膜組織中的FasL、TNF-α、NF-κB表達(dá)均明顯升高，進(jìn)一步表明大鼠經(jīng)視網(wǎng)膜光損傷4周后，F(xiàn)asL、TNF-α、NF-κB并不是通過調(diào)控細(xì)胞凋亡途徑發(fā)揮作用，而是共同參與了AMD的慢性炎癥過程，F(xiàn)asL、TNF-α、NF-κB作為炎癥相關(guān)因子的共同升高，也反證了AMD光損傷模型眼存在長期的慢性炎癥過程。經(jīng)蠐螬治療后，F(xiàn)asL、TNF-α、NF-κB高表達(dá)得到了抑制，表明蠐螬提取液對光損傷AMD模型眼慢性炎癥過程具有抑制作用，減少了慢性炎癥反應(yīng)對感光細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞的損害。其作用機(jī)制可能是通過對膜受體蛋白FasL的影響，進(jìn)而抑制NF-κB信號通路的活化，減少了巨噬細(xì)胞等對TNF-α等炎性因子的釋放來實現(xiàn)的。

觀察蠐螬提取物口服和滴眼對光損傷誘導(dǎo)活體干性AMD模型眼的影響，對Caspase-3、FasL、TNF-α、NF-κB等表達(dá)的影響效應(yīng)一致。證實蠐螬提取物滴眼亦能在光損傷早期減輕感光細(xì)胞的凋亡，光損傷后期促進(jìn)細(xì)胞凋亡，減輕炎癥反應(yīng)，從而對干性AMD同樣具有良好的治療作用。

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