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    黃桷蘭乙醇溶液對(duì)小鼠止癢作用的初步研究

    2018-09-10 22:28:55張銳凌瑜雙
    關(guān)鍵詞:黃桷乙醇溶液組胺

    張銳 凌瑜雙

    〔摘要〕 目的 探討黃桷蘭乙醇溶液是否對(duì)蚊癢小鼠有治療作用。方法 選擇健康成年昆明小鼠60只,雌雄各半,在其耳后注射磷酸組胺建立瘙癢模型。根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分組,每組10只,將不同濃度組(高、中、低)的黃桷蘭乙醇溶液和其他處理組的藥物涂抹于小鼠耳后,觀察并記錄用藥后30 min之內(nèi)小鼠的搔抓次數(shù)和搔抓潛伏期;斷頭取血,用ELISA法檢測(cè)血清中IL-6的濃度;取耳后皮膚制作病理切片觀察炎癥細(xì)胞浸潤、增生程度;用SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 低濃度(0.02 g/mL)的黃桷蘭乙醇溶液可以明顯減少搔抓次數(shù)(P<0.05),高濃度(0.5 g/mL)的黃桷蘭乙醇溶液對(duì)炎癥細(xì)胞的浸潤、增生有顯著的抑制作用,各組間血清IL-6濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 黃桷蘭乙醇溶液對(duì)小鼠瘙癢有一定的抑制作用,且低劑量溶液止癢效果好,但尚需在以后的研究中擴(kuò)大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步研究,進(jìn)而探討黃桷蘭乙醇溶液的作用機(jī)制。

    〔關(guān)鍵詞〕 瘙癢;黃桷蘭;組胺;IL-6

    〔中圖分類號(hào)〕R285.5 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號(hào)〕doi:10.3969/j.issn.1674-070X.2018.05.005

    Preliminary Study of Antipruritic Effect of Huangjuelan Ethanol Solution on Mice

    ZHANG Rui1, LING Yushuang2, LIANG He3, XIONG Qiang1, DIAO Hua1, WANG Yang4*

    (1.College of Public Health and Administration, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China; 2. Center for Disease Control and Prevention of Bishan District, Chongqing 402760, China; 3. Xiangtan Health Supervision Institute, Xiangtan, Hunan 411100, China; 4. Experimental Teaching and Management Center, Chongqing Medical University, Chongqing 401331, China)

    〔Abstract〕 Objective To explore the antipruritic effect of Huangjuelan ethanol solution on the mosquito biting model mice. Methods 60 mice, half male and half female, were selected and 10 mice in each group. Itching model was established through the intradermal injection of histamine phosphate at the back of mouse ear. Different concentrations of Huangjuelan ethanol solution and other treatment were applied on the mouse ear, scratching frequency and scratching latency were observed and recorded within 30 minutes at the wake of intradermal injection of histamine phosphate. All the mice were sacrificed by cutting heads, blood was collected. Serum concentration of IL-6 was detected with ELISA. Skin tissues of mice ear were collected to prepare for the pathological section, inflammatory cell infiltration as well as hyperplasia degree was observed under microscope. SPSS 20.0 was used for statistical analysis. Results The low concentration of Huangjuelan ethanol solution (0.02 g/mL) reduced the scratching frequency significantly (P<0.01), while high concentration of Huangjuelan ethanol solution (0.5 g/mL) could significantly inhibit the inflammatory cell infiltration and hyperplasia of mouse ear. No significant difference in serum IL-6 concentration was observed among these groups (P>0.05). Conclusion Huangjuelan ethanol solution has a certain inhibitory effect on itching in mice, and low concentration of Huangjuelan solution shows better inhibitory effect. Therefore, it is still necessary to increase the sample size in future studies, and then to explore the mechanism of action of ethanol solution of this plant.

    〔Keywords〕 itching; Huangjuelan ethanol solution; histamine; IL-6

    瘙癢是主要由化學(xué)介質(zhì)、機(jī)械損傷和熱刺激等因素引起的一種非常不愉快的感覺,在一定程度上給患者的生理、心理及社會(huì)活動(dòng)等方面造成嚴(yán)重的影響,從而降低患者生活質(zhì)量[1]。瘙癢會(huì)導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)抓痕、色素沉著。不僅如此,瘙癢還能使人們出現(xiàn)尷尬、煩悶、焦慮、抑郁等情緒波動(dòng),間接影響人們的身體健康,進(jìn)而嚴(yán)重影響人們的日常生活[2-4]。目前對(duì)瘙癢的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,但組胺被認(rèn)為是人類瘙癢的主要介質(zhì)之一,其在各類蕁麻疹、昆蟲咬傷反應(yīng)、表皮肥大細(xì)胞增生病或藥物性皮炎所引起的瘙癢中起介導(dǎo)作用[5]。

    蟲咬皮炎,又稱丘疹性蕁麻疹,指昆蟲叮咬人類皮膚而引起的炎性皮膚病,常于好發(fā)部位出現(xiàn)局部紅腫、丘疹、風(fēng)團(tuán)或淤點(diǎn),表面可出現(xiàn)水皰及大皰,皮損中心可見叮咬痕跡[6-7]?,F(xiàn)今針對(duì)蟲咬性皮炎的治療方法主要包括內(nèi)服抗組胺藥物、適當(dāng)選用外用安撫止癢藥物等。常用的外用止癢藥物如爐甘石洗劑等,效果比較理想,但是在使用后,殘留在皮膚表面的藥物會(huì)影響個(gè)人美觀,給社交活動(dòng)造成不便。而某些外用藥如復(fù)方醋酸地塞米松乳膏(俗名皮炎平),含有一定劑量的糖皮質(zhì)激素。長期大量使用糖皮質(zhì)激素會(huì)導(dǎo)致局部皮膚變黑萎縮、引起毛囊炎、毛細(xì)血管擴(kuò)張及血糖升高、血壓升高等不良反應(yīng)[8]。內(nèi)服的抗組胺藥物如抗組胺H1和H2受體拮抗劑等,常有不同程度的副反應(yīng),包括嗜睡、眩暈、口干及胃腸道不適等。大多數(shù)止癢藥物單獨(dú)應(yīng)用時(shí)療效往往不夠理想,藥物的聯(lián)用可能會(huì)引起其他更嚴(yán)重的不良反應(yīng)[9]。黃桷蘭(Michelia alba DC),又稱白蘭花,含有氧代黃心樹寧堿,柳葉木蘭堿,白蘭花堿,黃心樹寧堿等成分,其新鮮花瓣含0.7%揮發(fā)油,油中主要成分為芳樟醇、甲基丁香油酚和苯乙醇[10-11]。研究表明,黃桷蘭的部分成分如芳樟醇具有抗炎作用[12],但黃桷蘭在民間作為止癢的偏方的作用[10]還尚未證實(shí)。因此,研究價(jià)廉易得的天然植物黃桷蘭的止癢作用及其機(jī)理,具有重要的臨床意義。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    6周齡的昆明小鼠,雌雄各半,體質(zhì)量18~22 g,由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(渝)2012-001]。

    磷酸組胺(上海源葉生物科技有限公司); 皮炎平(華潤三九醫(yī)藥股份有限公司);IL-6 ELISA小鼠血清檢測(cè)試劑盒96T(韻博生物科技有限公司);黃桷蘭鮮花(重慶醫(yī)科大學(xué)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室提供);黃桷蘭乙醇溶液儲(chǔ)備液(0.5 g/mL)(由100 g新鮮黃桷蘭花溶于200 mL無水乙醇中制成);1 g/mL的黃桷蘭乙醇溶液(由黃桷蘭乙醇溶液儲(chǔ)備液蒸餾水5倍稀釋而成);0.02 g/mL的黃桷蘭乙醇溶液(由0.1 g/mL的黃桷蘭乙醇溶液蒸餾水5倍稀釋而成);Bouin氏固定液(由5 mL冰醋酸、25 mL甲醛溶液和75 mL飽和苦味酸水溶液配置成);其余試劑均為分析純。

    1.2 方法

    1.2.1 動(dòng)物分組 健康成年昆明小鼠60只,雌雄各半,根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分組,每組10只。分為黃桷蘭乙醇溶液高、中、低三個(gè)濃度組,模型組,生理鹽水組,陽性藥物(皮炎平)組。

    1.2.2 建立瘙癢模型 用脫毛劑(硫化鋇和滑石粉按3∶7比例混合后由蒸餾水配置而成)脫去小鼠耳后毛發(fā),面積為1.5 cm×2.0 cm,并用紗布蘸蒸餾水清潔、擦干。40 min后,分別在6組小鼠的去毛部位皮下注射0.05%磷酸組胺溶液0.1 mL。

    1.2.3 給藥 用醫(yī)用棉簽連續(xù)兩次于注射部位涂抹給藥,每次給藥量為2 mL。黃桷蘭乙醇溶液高劑量組、中劑量組、低劑量組給藥濃度分別為0.5 g/mL、0.1 g/mL、0.02 g/mL;模型組未給予任何處理;生理鹽水組給予0.9%氯化鈉;陽性藥物組涂抹0.25 g皮炎平膏劑。

    1.2.4 小鼠搔抓行為的觀察 注射組胺后立即將小鼠放入自制觀察籠(30 cm×30 cm×45 cm,由6個(gè)小格組成)。觀察小鼠從注射組胺開始到出現(xiàn)第一次搔抓反應(yīng)的時(shí)間即潛伏期,隨后用攝像機(jī)拍攝小鼠30 min內(nèi)活動(dòng)情況。依據(jù)錄像回放,由經(jīng)過培訓(xùn)的人員進(jìn)行搔抓次數(shù)統(tǒng)計(jì)。1次搔抓是小鼠四肢對(duì)耳后涂藥部位的1次或連續(xù)多次搔抓。

    1.2.5 血清IL-6的檢測(cè) 小鼠的搔抓次數(shù)記錄結(jié)束后立即斷頭取血1 mL,靜置至血液分層后以3 500 r/min的速度離心10 min制備血清,放置于-20 ℃的冰箱保存,30 d后用ELISA試劑盒測(cè)定各組小鼠血清中IL-6的濃度。

    1.2.6 HE染色 斷頭取血后取注射部位周圍皮膚切成小塊(面積為1 cm×1 cm)置于Bouin氏固定液(由5 mL冰醋酸、25 mL甲醛溶液和75 mL飽和苦味酸水溶液配置成)中保存1周,1周后做石蠟切片,然后對(duì)石蠟切片進(jìn)行HE染色,觀察并比較各處理組之間的皮膚中炎癥細(xì)胞的數(shù)量及形態(tài)差異。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    用SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。血清中IL-6的濃度服從正態(tài)分布,采用均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示數(shù)據(jù)的集中趨勢(shì)和離散程度,用方差分析對(duì)其進(jìn)行檢驗(yàn);搔抓潛伏期、搔抓次數(shù)及炎癥細(xì)胞數(shù)量不服從正態(tài)分布,采用中位數(shù)和四分位間距表達(dá)數(shù)據(jù)的集中趨勢(shì)和離散程度,用秩和檢驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 行為學(xué)結(jié)果

    2.1.1 搔抓潛伏期 各組小鼠在給予相應(yīng)的藥物處理后,小鼠無明顯的行為學(xué)改變,偶有梳理毛發(fā)和對(duì)面部、腹部等處的搔抓行為,潛伏期過后開始出現(xiàn)搔抓反應(yīng)。其中模型組潛伏期最短,黃桷蘭乙醇溶液低劑量組潛伏期最長。對(duì)搔抓潛伏期進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),P=0.00<0.05,潛伏期不服從正態(tài)分布。故采用隨機(jī)區(qū)組資料秩和檢驗(yàn)對(duì)潛伏期進(jìn)行分析,?字2=6.020,P=0.304>0.05,故差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組搔抓潛伏期如表1所示。

    2.1.2 搔抓次數(shù) 各組30 min搔抓次數(shù)如表2所示,在所記錄到的搔抓反應(yīng)中,搔抓主要集中在注射處及其附近的皮膚。對(duì)搔抓次數(shù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),P=0.031<0.05,搔抓次數(shù)不服從正態(tài)分布。故采用隨機(jī)區(qū)組資料秩和檢驗(yàn)對(duì)搔抓次數(shù)進(jìn)行分析,?字2=32.971,P=0.00<0.05,故總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多重比較結(jié)果如表3所示,在搔抓高峰時(shí),其他各組的搔抓次數(shù)明顯小于模型組(P<0.05);陽性對(duì)照組搔抓次數(shù)明顯低于高劑量組、中劑量組、低劑量組、生理鹽水組(P<0.05);高劑量組搔抓次數(shù)高于低劑量組、生理鹽水組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);生理鹽水組和中劑量組、低劑量組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說明中劑量和低劑量組的效果與生理鹽水類似;隨著注射黃桷蘭乙醇溶液濃度的遞減,搔抓次數(shù)依次減少。

    2.2 HE染色結(jié)果

    2.2.1 黃桷蘭乙醇溶液對(duì)瘙癢小鼠血清IL-6的影響 對(duì)血清中IL-6的濃度進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),P=0.569>0.05,服從正態(tài)分布。故采用隨機(jī)區(qū)組資料方差分析對(duì)血清中IL-6的濃度進(jìn)行分析,F(xiàn)=1.507,P=0.148>0.05,故差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表4。

    2.2.2 HE染色鏡下觀察結(jié)果 病理切片用HE染色后 (圖1),可觀察到細(xì)胞核大而圓、染色較深的炎癥細(xì)胞,對(duì)炎癥細(xì)胞數(shù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),P=0.04<0.05,炎癥細(xì)胞數(shù)不服從正態(tài)分布。故采用隨機(jī)區(qū)組資料秩和檢驗(yàn)對(duì)炎癥細(xì)胞數(shù)進(jìn)行分析,?字2=6.971,P=0.223>0.05,故差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。炎癥細(xì)胞觀察結(jié)果如表5所示。

    3 討論

    瘙癢是皮膚科最常見的癥狀之一,是一種能引起搔抓欲望的不愉快感覺。蚊蟲叮咬所致的瘙癢是最常見的一種皮膚源性瘙癢。當(dāng)蚊子叮咬人類時(shí),會(huì)從口器注入唾液。其唾液含有蟻酸(HCOOH)、抗凝血?jiǎng)┘澳壳俺煞植幻鞯牡鞍踪|(zhì)等很多外來物質(zhì)。引起身體的免疫系統(tǒng)會(huì)釋放出一種稱為組織胺的蛋白質(zhì),組胺引起被“咬”部位周圍血管擴(kuò)張,形成小紅疹。組胺可促進(jìn)多種細(xì)胞和組織合成及分泌interleukin-1A(IL-1A),interleukin-1B(IL-1B),interleukin-6(IL-6),interleukin-8(IL-8)或RANTES等促炎細(xì)胞因子及趨化因子, 促進(jìn)過敏-炎癥反應(yīng)[13],引起瘙癢。組胺還會(huì)刺激皮膚中的神經(jīng)末梢,直接引起瘙癢并且釋放P物質(zhì)(SP),SP又會(huì)促肥大細(xì)胞脫顆粒釋放組胺進(jìn)一步引起瘙癢[14]。同時(shí),瘙癢引起的搔抓可導(dǎo)致炎性介質(zhì)的釋放,加大瘙癢的嚴(yán)重程度,從而形成瘙癢-搔抓的惡性循環(huán)[15]。

    蟲咬性皮炎的發(fā)生主要是由于蚊蟲叮咬后體內(nèi)組胺物質(zhì)的升高導(dǎo)致的,因此本次實(shí)驗(yàn)用組胺建立瘙癢模型,進(jìn)而模擬蟲咬性皮炎在體內(nèi)的發(fā)生機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)通過在小鼠耳后皮內(nèi)注射0.05%的磷酸組胺溶液成功建立瘙癢模型。在組胺注射部位涂抹藥物,觀察不同處理組小鼠的搔抓潛伏期以及30 min內(nèi)的搔抓次數(shù),用ELISA法測(cè)定小鼠血清中IL-6濃度,取耳后的皮膚組織制作病理切片,觀察組織中炎癥細(xì)胞的浸潤增生程度。

    從行為學(xué)結(jié)果來看,黃桷蘭乙醇溶液對(duì)小鼠的搔抓反應(yīng)有一定的抑制作用。我們發(fā)現(xiàn)注射低劑量的黃桷蘭乙醇溶液的小鼠搔抓次數(shù)與涂抹生理鹽水的相近,且都低于其他各組,因此低劑量的黃桷蘭乙醇溶液的止癢效果較好。血清ELISA檢測(cè)的結(jié)果表明黃桷蘭乙醇溶液會(huì)降低瘙癢發(fā)生后小鼠血清內(nèi)的IL-6濃度,但結(jié)果沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,分析其原因可能是樣本量較小。病理切片的結(jié)果表明黃桷蘭乙醇溶液可以減少瘙癢模型小鼠體內(nèi)的炎癥細(xì)胞的浸潤和增生,且結(jié)果表明濃度越高其作用效果越好。這和血清學(xué)和行為學(xué)上的結(jié)果有一定的差異,可能由于高劑量組的濃度過高,對(duì)小鼠皮膚產(chǎn)生一定的脂溶性,造成損傷,進(jìn)而導(dǎo)致病理學(xué)結(jié)果和血清學(xué)、行為學(xué)的結(jié)果不一致。

    綜上所述,黃桷蘭乙醇溶液對(duì)蟲咬皮炎引起的瘙癢有一定的抑制作用,且低劑量溶液止癢效果較好。本研究表明黃桷蘭乙醇溶液的止癢機(jī)制可能是其葉中的揮發(fā)性油性成分抑制炎癥細(xì)胞的浸潤和增生,減少炎癥介質(zhì)的釋放來止癢的,但還需要更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證該假設(shè)。

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