CCR5第一和第二胞外環(huán)特異性結(jié)合短肽對(duì)大鼠結(jié)腸炎的炎癥細(xì)胞浸潤及NF撥蔅/TNF撥列藕磐路的影響

宋楊達(dá) 劉思雪 宋銥航 沈溪明 黃花榮 鐘英強(qiáng)

【摘要】目的研究CC趨化因子受體5（CCR5）第一和第二胞外環(huán)特異性結(jié)合短肽對(duì)三硝基苯磺酸（TNBS）誘導(dǎo)的SD大鼠結(jié)腸炎的炎癥細(xì)胞浸潤及NFκB/TNFα信號(hào)通路的影響。方法采用5%TNBS構(gòu)建大鼠結(jié)腸炎模型，分別給予2種CCR5短肽干預(yù)，通過病理細(xì)胞學(xué)分析、蛋白免疫印跡法、PCR等方法分別評(píng)估其組織學(xué)、基因及蛋白質(zhì)水平的變化。結(jié)果與模型組相比，2組給予CCR5拮抗短肽的大鼠均表現(xiàn)為結(jié)腸炎組織學(xué)損傷減輕（P均<005），鏡下可見中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤減少（P均<005）。同時(shí)，NFκB/TNFα信號(hào)通路相關(guān)的蛋白及mRNA表達(dá)水平也較之模型組明顯下降（P均<005）。結(jié)論特異性結(jié)合CCR5第一和第二胞外環(huán)的短肽可明顯抑制TNBS誘導(dǎo)的SD大鼠結(jié)腸炎癥，其機(jī)制可能是通過抑制NFκB/TNFα信號(hào)通路的激活。

【關(guān)鍵詞】CC趨化因子受體5；拮抗肽；炎癥性腸??；核轉(zhuǎn)錄因子κB；腫瘤壞死因子α

Effects of antagonistic peptides specifically binding to the first and second extracellular loops of CCR5 on inflammatory cell infiltration and NFκB/TNFα signaling pathway in rats colitisSong Yangda， Liu Sixue， Song Yihang， Shen Ximing， Huang Huarong， Zhong Yingqiang Department of Gastroenterology， Sun Yatsen Memorial Hospital， Sun Yatsen University， Guangzhou 510120， China

Corresponding author， Zhong Yingqiang， Email： zhongyingqiang@126com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of the specific binding of antagonistic peptides to the first and second extracellular loops of CC chemokine receptor 5（CCR5） upon the inflammatory cell infiltration and NFκB/TNFα signaling pathway in SD rats with colitis induced by trinitrobenzene sulfonic acid （TNBS） MethodsThe experimental SD rat models with colitis were induced by 5% TNBS， and intervened by two antagonistic peptides of CCR5 Pathological cytological analysis， western blot and PCR were performed to examine the histological changes of colon， proteins and mRNA levels of the NFκB/TNFα signaling pathway Results Compared with model group， the histological injuries of colitis were alleviated after administration of two antagonistic peptides of CCR5 （both P<005） The infiltration of neutrophils， lymphocytes and macrophages in rats treated with GH and HY peptides was significantly reduced （all P<005） Besides， the expression levels of the proteins and mRNAs related to the NFκB/TNFα signaling pathway were also significantly downregulated （all P<005） ConclusionsAntagonistic peptides specifically binding to the ECL1 and ECL2 of CCR5 can evidently inhibit the inflammation in SD rats with TNBSinduced colitis， probably by suppressing the activation of the NFκB/TNFα signaling pathway

【Key words】CC chemokine receptor 5； Antagonistic peptide； Inflammatory bowel disease；

Nuclear factorκB； Tumor necrosis factorα

炎癥性腸病（IBD）是一組慢性腸道非特異性免疫炎癥性疾病，其病理生理的本質(zhì)是在腸道中有大量的各種炎癥細(xì)胞浸潤以及由其引發(fā)的各種炎癥因子的釋放，造成腸道黏膜的損傷與上皮細(xì)胞修復(fù)并存。CC趨化因子受體5（CCR5）是趨化因子受體的一種，其可調(diào)節(jié)各種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促使多種炎癥細(xì)胞的趨化與激活，在IBD、哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種自身免疫性疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮重要的作用[15]。核轉(zhuǎn)錄因子κB（NFκB）作為炎癥與免疫反應(yīng)的重要調(diào)控因子，同樣參與了IBD的病理生理發(fā)展過程[6]。在我們前期的研究中發(fā)現(xiàn)，CCR5與IBD密切相關(guān)，在活動(dòng)期IBD腸黏膜中高表達(dá)，并采用噬菌體肽庫展示技術(shù)，已成功篩選出2條分別與CCR5第一、第二胞外環(huán)特異性結(jié)合的生物活性模擬肽[78]。本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究這兩條短肽對(duì)三硝基苯磺酸（TNBS）誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎的炎癥細(xì)胞浸潤及NFκB/TNFα信號(hào)通路的影響。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年雌性SpragueDawley（SD）大鼠40只，重量（200±20）g，購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理批準(zhǔn)編號(hào)為IACUCDB160313，飼養(yǎng)條件為SPF級(jí)。

二、主要試劑與儀器

5%TNBS購自Sigma公司；Trizol RNA提取試劑盒、Premix Taq PCR試劑盒及Realtime PCR試劑盒購自Takara公司；NFκB通路抗體試劑盒[包括兔抗鼠IKKβ， PhosphoIKK α/β（Ser176/180）， p65， Phosphop65（Ser536）， IκBα以及PhosphoIκBα（Ser32）抗體]購自Cell Signaling Technology公司；兔抗鼠TNFα，βactin抗體購自Novus公司；CCR5第一、第二胞外環(huán)的兩條活性模擬短肽由上海吉爾生化有限公司合成，純度為95%，其序列分別為GHWKVWL（簡稱GH），HYIDFRW（簡稱HY）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Light Cycler96）。

三、方法

1實(shí)驗(yàn)分組

SD大鼠在經(jīng)過1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機(jī)分為以下4組：正常對(duì)照組（Normal組）、模型組（Model組）、GH短肽治療組（GH組）、HY短肽治療組（HY組）。

2IBD動(dòng)物模型的建立

在經(jīng)典的TNBS造模方法的基礎(chǔ)上稍加改動(dòng)[9]。具體方法大致為：造模前大鼠禁食不禁水24 h，10%水合氯醛麻醉，經(jīng)石蠟油潤滑后，將16號(hào)大鼠灌胃針由肛門輕輕插入腸腔約8 cm，緩慢灌入預(yù)先配好的灌腸液（按大鼠100 mg/kg的TNBS與等體積乙醇混合而成），灌入完畢后保持大鼠倒置5 min，然后將大鼠以頭低尾高約呈30°的體位放回于籠中墊料上，自然蘇醒，恢復(fù)自由飲食。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用委員會(huì)以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

3給藥與取材

在經(jīng)TNBS造模后的第3日，2個(gè)治療組分別經(jīng)大鼠尾靜脈給予GH短肽（35 mg/kg）和HY短肽（25 mg/kg），而正常對(duì)照組和模型組的大鼠則用尾靜脈注射09%生理鹽水代替。給藥時(shí)間為每日1次，連續(xù)7 d給藥。給藥濃度的選擇則是根據(jù)我們先前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[10]。在TNBS造模后的第14日，通過10%水合氯醛以腹腔注射過量麻醉藥處死大鼠，取大鼠全結(jié)腸，沿腸系膜剪開后，用預(yù)冷生理鹽水清洗。之后在模型及治療組的病變邊緣處和正常對(duì)照組的對(duì)應(yīng)腸段取材，所取組織一部分用于病理學(xué)檢測；另一部分于-80°冰箱保存，用于后續(xù)的分子生物學(xué)檢測。

4組織學(xué)評(píng)價(jià)

新鮮組織4%多聚甲醛固定過夜，石蠟包埋，切片（厚度為5 μm），蘇木素伊紅染色后，在顯微鏡下觀察。鏡下的評(píng)價(jià)內(nèi)容包括潰瘍、炎癥程度和范圍以及炎癥細(xì)胞的計(jì)數(shù)。納入計(jì)數(shù)的炎癥細(xì)胞包括中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞，計(jì)數(shù)方法為在×400高倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)獨(dú)立視野，統(tǒng)計(jì)上述各炎癥細(xì)胞的數(shù)目。

5蛋白提取與蛋白免疫印跡法

總蛋白通過RIPA裂解液提取。通過BCA法測定蛋白濃度后，將等量的蛋白樣本與相應(yīng)體積的loading buffer相混合成20 μl體系，加入SDSPAGE凝膠中電泳（初為恒壓60 V，后為恒壓110 V），再轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上（恒流250 mA，100 min，PVDF膜孔徑為045 μm）。接著放入5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，后加入相應(yīng)的一抗（抗體稀釋比例均為1∶1 000），4℃過夜。第2日經(jīng)過TBST洗膜后，加入二抗（抗體稀釋比例為1∶5 000）室溫孵育1 h。最后通過ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，并拍照保存結(jié)果。條帶結(jié)果分析通過ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析比較。以βactin作為總蛋白的內(nèi)參。

6實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄PCR

通過Trizol法提取結(jié)腸組織總RNA，然后通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，合成cDNA。接著加入目標(biāo)基因相對(duì)應(yīng)的引物（引物序列見表1），對(duì)各目標(biāo)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過檢測相結(jié)合SYBR染料的信號(hào)，得到對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)Ct值。PCR的反應(yīng)體系為：1 μl cDNA、5 μl 2×Sybr Green Premix Ex Taq試劑、04 μl正向引物和04 μl反向引物，無菌雙蒸水補(bǔ)足至10 μl。PCR擴(kuò)增參數(shù)為：95℃30 s，95℃5 s，60℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參基因?yàn)棣耡ctin。最后結(jié)果的分析計(jì)算采用2ΔΔCt法計(jì)算各基因表達(dá)的相對(duì)變化[11]。

表1RTPCR的引物序列大鼠基因引物（53）βactinF： GGGAAATCGTGCGTGACATTR： GCGGCAGTGGCCATCTCp105F： GATGGGACGACACCTCTACACATAR： CCCAAGAGTCGTCCAGGTCAp100F： CTGATGGCACAGGACGAGAAR： TGGGCTATCTGCTCAATGACACp65F： CGACGTATTGCTGTGCCTTCR： TTGAGATCTGCCCAGGTGGTAI kappa B激酶F： TACGGTCCCAATGGCTGTTT（IKK）R： GGTATGTGTGAATGGTGCCTGTTNFαF： TGGCGTGTTCATCCGTTCTCTACR： CTACTTCAGCGTCTCGTGTGTTTC四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 220。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSDt檢驗(yàn)。P<005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、CCR5短肽對(duì)大鼠結(jié)腸炎的組織學(xué)和炎癥細(xì)胞浸潤的影響

在顯微鏡下，與正常對(duì)照組相比，模型組可觀察到潰瘍形成，上皮缺損，隱窩損傷，以及累及結(jié)腸黏膜全層的嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，并伴隨著大量的中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，以及一定數(shù)量的巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤（圖1A、B）。在GH短肽治療組和HY短肽治療組中，炎癥則主要局限于黏膜和黏膜下層（圖1C、D），并且與模型組相比，2個(gè)短肽治療組均表現(xiàn)為不同程度的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤程度減少（P均<005），但嗜酸性粒細(xì)胞則無明顯變化。另外，GH短肽治療組和HY短肽治療組各炎癥細(xì)胞的數(shù)量比較差異并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果見表2。

二、CCR5兩短肽對(duì)NFκB/TNFα信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

4組間pIKKα、pp65、IκBα、pIκBα、TNFα比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為1108、22340、969、3178、25210，P均<001）。其中，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠pIKK，pp65，pIκBα和TNFα蛋白水平分別約為正常對(duì)照組的13倍、20倍、17倍和17倍，而IκBα蛋白水平則下降（P均<005），提示模型組IκBα的降解和NFκB通路的顯著激活。與此相反，與模型組相比，GH或HY短肽治療均可不同程度地引起pIKK、pp65、pIκBα和TNFα蛋白水平的下降。而短肽治療組和正常對(duì)照組的IκBα水平差異則沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示短肽治療組可抑制IκBα的降解。另外，4個(gè)組的IKK和p65的蛋白水平差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為258和301，P均>005，見圖2）。

三、CCR5短肽對(duì)NFκB/TNFα信號(hào)通路相關(guān)基因的影響

通過Real timePCR測定了包括了p105、p100、p65、IKK和TNFα在內(nèi)的NFκB/TNFα通路相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)水平（圖3）。4組間p105、p100、IKK和TNFα比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為34380、2992、30151和1998，P均<001）。其中，從圖中可知，模型組大鼠p105、p100、IKK以及TNFα的mRNA水平較之正常對(duì)照組升高（P均<001），分別約為正常對(duì)照組的160倍、38倍、80倍和68倍。與此相反，GH組和HY組的大鼠p105、p100、IKK以及TNFα的mRNA水平較之模型組則出現(xiàn)了下降（P均<001）。另外，4組之間p65的mRNA表達(dá)水平差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=313，P>005）。

討論

CCR5是一種G蛋白偶聯(lián)受體，在結(jié)構(gòu)上包含一個(gè)N末端，3個(gè)胞外環(huán)（分別為ECL1，ECL2和ECL3），七次跨膜的α螺旋結(jié)構(gòu)域，3個(gè)胞內(nèi)環(huán)，以及胞內(nèi)的C端，其中胞內(nèi)區(qū)的羧基末端含絲氨酸/蘇氨酸，可發(fā)生磷酸化，從而與G蛋白相偶聯(lián)，參與MAPK、JAKSTAT、NFκB等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控[12]。

在哺乳動(dòng)物中，NFκB家族主要由5種蛋白組成，包括RelA（即p65）、cRel、RelB、NFκB1（p105/p50）和NFκB2 （p100/p52）。其中p105和p100分別為p50和p52的前體。這5種蛋白可任意兩兩組合成同源二聚體或異源二聚體，但以p50p65異二聚體最為常見[13]。在靜息狀態(tài)下，NFκB與抑制性蛋白IκB緊密結(jié)合，以無活性狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中。在炎性信號(hào)的刺激下（如TNFα， LPS， IL1等），IKK可被激活。接著IKK催化IκB發(fā)生磷酸化，進(jìn)而IκB可被泛素標(biāo)記，從而被轉(zhuǎn)運(yùn)到蛋白酶體發(fā)生降解，釋放出游離的NFκB。之后，游離的NFκB便可通過核孔復(fù)合物在核轉(zhuǎn)位序列的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)位入核，對(duì)多種炎癥與免疫相關(guān)基因（包括IL1β和TNFα等）的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮調(diào)控作用[14]。

迄今為止，已有許多研究探索了CCR5與IBD之間的關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)，TAK779（一種非肽類小分子CCR5拮抗劑）可緩解葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的動(dòng)物結(jié)腸炎，抑制單核/巨噬細(xì)胞的浸潤和促炎因子如IL1β和IL6的產(chǎn)生[15]。在人類IBD的研究中也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果：CCR5在人類IBD患者的腸黏膜中高度表達(dá)，且表達(dá)量與疾病的活動(dòng)度相關(guān)[7]。這些實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果均提示了CCR5在IBD發(fā)病過程中所扮演的重要角色，同時(shí)也提示了抑制CCR5可成為IBD治療的新思路。

時(shí)至今日，已有多種CCR5抑制劑被開發(fā)，主要包括趨化因子修飾衍生物，非肽類小分子化合物，單克隆抗體和短肽類化合物[15]。其中本研究所采用的短肽類拮抗劑，它可與CCR5受體的胞外結(jié)構(gòu)高度特異性結(jié)合，親和力及安全性均較高，生產(chǎn)成本較低等優(yōu)勢(shì)。因此，我們通過噬菌體肽庫展示技術(shù)篩選并合成了兩條特異性結(jié)合CCR5胞外環(huán)的短肽，并探究了它們?cè)诖笫蠼Y(jié)腸炎中的治療效果[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，2個(gè)短肽治療組均出現(xiàn)不同程度炎癥明顯范圍縮小，中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤程度的明顯下降。既往研究已發(fā)現(xiàn)CCR5廣泛表達(dá)于樹突狀細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及效應(yīng)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等細(xì)胞膜的表面。結(jié)合這些研究結(jié)果，本研究表明CCR5與結(jié)腸炎的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞遷移浸潤作用密切相關(guān)，而特異性結(jié)合CCR5胞外第一、第二環(huán)的兩條短肽可在一定程度上抑制上述炎癥細(xì)胞的浸潤作用，減輕組織學(xué)損傷。

接下來，蛋白免疫印跡法和PCR的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了GH和HY短肽對(duì)NFκB/TNFα通路的抑制作用，主要表現(xiàn)為抑制IKK、p65以及IκBα的磷酸化，減少p100、p105、IKK和TNFα的表達(dá)，但是p65的總蛋白水平在各組之間并無差異。此前提到，p50p65異二聚體在與IκB解離后，可通過核孔復(fù)合物在NTS的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)位入核，故NFκB通路激活時(shí)，p65的總蛋白水平可保持不變，而表現(xiàn)為核內(nèi)的p65水平升高，因而也解釋了本實(shí)驗(yàn)中p65的總蛋白水平在各組之間無差異的結(jié)果。另外p65基因的表達(dá)在4組之間也沒有明顯差異，也提示了p65基因表達(dá)的穩(wěn)定性以及可能存在著其他對(duì)NFκB通路調(diào)節(jié)的機(jī)制。

值得注意的是，不管是在組織學(xué)、蛋白抑或是基因水平，2條短肽GH和HY組之間都沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。關(guān)于CCR5受體的功能性結(jié)合位點(diǎn)，不同的研究有不同的觀點(diǎn)。早期關(guān)于CCR5與HIV1如何入侵CD4+T細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)CCR5受體的N端和第二個(gè)胞外環(huán)（即ECL2）在HIV1共受體功能中發(fā)揮重要作用。而在2013年，Schnur等通過MRI技術(shù)繪制并研究了CCR5各胞外結(jié)構(gòu)與其天然配體RANTES相結(jié)合的位點(diǎn)和親和力。就單一結(jié)構(gòu)而言，N端和ECL2與RANTES的親和力更高。但是ECL1ECL2共同體與RANTES的親和力明顯強(qiáng)于ECL2單體。這是由于只有ECL1存在時(shí)，ECL2才能保持更穩(wěn)定的構(gòu)象。也就是說，不管是阻斷ECL1還是ECL2中的任意一個(gè)，都可以導(dǎo)致CCR5與配體的結(jié)合力下降。另外，這一發(fā)現(xiàn)也提示了同時(shí)阻斷ECL1和ECL2可能可以更好地抑制CCR5的功能。

因此，本研究的結(jié)果表明CCR5第一、第二胞外環(huán)特異性結(jié)合的拮抗短肽可通過抑制NFκB/TNFα信號(hào)通路，抑制TNBS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎的炎癥細(xì)胞的浸潤，減輕組織學(xué)損傷，所以，CCR5拮抗短肽也許可以成為IBD治療的新方法。通過進(jìn)一步的研究和探索2條短肽的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)以及兩者是否具有協(xié)同作用，將有助于未來CCR5拮抗短肽的臨床應(yīng)用。

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（收稿日期：20180108）

（本文編輯：楊江瑜）