非小細(xì)胞肺癌患者胸腔積液與外周血ctDNA中EGFR基因突變檢測(cè)的對(duì)比研究

徐敏 何婉 李嵐 朱美琴 陳亦欣 許瑞蓮

【摘要】目的比較晚期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者胸腔積液與外周血循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）中EGFR基因突變間的差異。方法用高通量測(cè)序技術(shù)同時(shí)檢測(cè)22例晚期NSCLC患者的胸腔積液ctDNA與外周血ctDNA的EGFR基因突變情況，以外周血ctDNA為金標(biāo)準(zhǔn)，分析胸腔積液ctDNA對(duì)EGFR基因突變的檢測(cè)效果。結(jié)果以外周血ctDNA檢出的EGFR基因突變結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，胸腔積液ctDNA中檢出NSCLC基因突變的靈敏度為86%～100%，特異度達(dá)94%～100%，與外周血ctDNA結(jié)果的總體符合率為95%～100%，且胸腔積液ctDNA檢測(cè)出的突變豐度高于外周血ctDNA（P=0002）。結(jié)論晚期NSCLC患者胸腔積液和外周血ctDNA中EGFR基因突變檢測(cè)結(jié)果一致，胸腔積液檢測(cè)豐度較高，具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】非小細(xì)胞肺癌；高通量基因測(cè)序；循環(huán)腫瘤脫氧核糖核酸

Comparison of EGFR gene mutation detection between pleural effusion and peripheral blood ctDNA in patients with nonsmall cell lung cancerXu Min， He Wan， Li Lan， Zhu Meiqin， Chen Yixin， Xu Ruilian Department of Medical Oncology， Shenzhen Peoples Hospital， the Second Clinical Medical College of Jinan University， Shenzhen Cancer Institute， Shenzhen 518020， China

Corresponding author， Xu Ruilian， Email： xuruilian@126com

【Abstract】ObjectiveTo compare the differences in the EGFR gene mutation detection between the pleural effusion and peripheral blood circulating tumor DNA （ctDNA） in patients with advancedstage nonsmall cell lung cancer （NSCLC） MethodsThe EGFR gene mutation in the pleural effusion and peripheral blood ctDNA of 22 patients with advancedstage NSCLC were detected by nextgeneration sequencing （NGS） The ctDNA gene detection in the peripheral blood was considered as the golden standard The detection effect of EGFR gene mutation upon the pleural effusion ctDNA was evaluated ResultsThe EGFR gene mutation in the peripheral blood ctDNA was considered as the golden standard The sensitivity of detection of NSCLC gene mutation in pleural effusion ctDNA was 86%100% and the specificity was 94%100% The overall consistent rate with the results of peripheral blood ctDNA was ranged from 95% to 100% The mutation abundance detected in the pleural effusion ctDNA was significantly higher than that in the peripheral blood ctDNA（P=0002） ConclusionsThe outcomes of EGFR gene mutation are consistent between the pleural effusion and peripheral blood of patients with advanced NSCLC The mutation abundance of the pleural effusion is higher compared with that of the peripheral blood， which is worthy of clinical significance

【Key words】Nonsmall cell lung cancer； Nextgeneration sequencing； Circulating tumor DNA

非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占全部肺癌患者發(fā)病率的80%～85%，其中約50%的患者確診時(shí)已為晚期，5年生存率低于5%。隨著分子病理學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多肺癌驅(qū)動(dòng)基因被發(fā)現(xiàn)，給患者帶來(lái)了全新的治療策略。表皮生長(zhǎng)因子受體基因（EGFR）作為最受關(guān)注的肺癌靶標(biāo)基因，其突變狀態(tài)是決定EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFRTKI）療效的關(guān)鍵。然而目前臨床上大部分NSCLC患者在確診時(shí)已為ⅢB～Ⅳ期，無(wú)法手術(shù)，無(wú)法獲取腫瘤組織或組織不足造成難以進(jìn)行分子檢測(cè)。近年有研究表明，外周血循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）所檢測(cè)的EGFR突變與組織DNA檢測(cè)的特異度相似，靈敏度尚待提高[13]。而ctDNA中檢出EGFR突變陽(yáng)性者接受EGFRTKI治療生存期獲得延長(zhǎng)[12]?；诖?，通過(guò)外周血ctDNA檢測(cè)EGFR基因突變已獲得專(zhuān)家認(rèn)可，達(dá)成共識(shí)[4]。晚期NSCLC患者常伴有惡性胸腔積液（MRE），胸腔積液的采集較為簡(jiǎn)便、易行，對(duì)于無(wú)法獲取腫瘤組織的患者而言也是一個(gè)良好的基因檢測(cè)替代標(biāo)本。然而，胸腔積液ctDNA與外周血ctDNA用于EGFR基因檢測(cè)時(shí)何種更精確尚未知。為此，近期筆者通過(guò)高通量基因測(cè)序亦稱(chēng)下一代測(cè)序（NGS）技術(shù)檢測(cè)22例晚期NSCLC患者胸腔積液ctDNA中的EGFR基因突變情況，并以外周血ctDNA作對(duì)照，現(xiàn)報(bào)告如下。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

選取2014年11月至2015年12月我院收治的ⅢB～Ⅳ期NSCLC合并MRE（經(jīng)細(xì)胞病理學(xué)證實(shí)）患者22例，所有患者均抽取外周血及胸腔積液標(biāo)本。其中男13例、女9例，年齡35～70歲、中位年齡50歲，腺癌20例、鱗癌2例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均已經(jīng)簽署知情同意書(shū)。

二、方法

1采集血樣及抽取胸腔積液

清晨在患者空腹?fàn)顟B(tài)下抽取肘靜脈血5 ml，立即在室溫下以2 000轉(zhuǎn)/分離心10 min，分離血漿和血細(xì)胞，小心采集上層血漿，注意避免觸及血細(xì)胞。臨床抽取新鮮胸腔積液樣本約15 ml，同樣以2 000轉(zhuǎn)/分離心10 min，棄上清。如細(xì)胞量過(guò)少，可重復(fù)加入胸腔積液后再離心。

2血漿和胸腔積液樣本DNA提取

用Qiagen DNA提取試劑盒提取血漿和胸腔積液樣本中的DNA，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

3ctDNA分離

應(yīng)用薄膜柱吸附試劑盒分別從血漿和胸腔積液中分離ctDNA：將DNA定量后按試劑盒說(shuō)明書(shū)取20 ng以上進(jìn)行DNA文庫(kù)構(gòu)建，步驟包括：ctDNA大片段分離、小片段回收、DNA末端修復(fù)和A接頭連接、在DNA的兩端加上Illumina測(cè)序試劑盒的專(zhuān)用接頭、依據(jù)所需DNA片段大小進(jìn)行磁珠篩選、應(yīng)用PCR法擴(kuò)增文庫(kù)用于探針雜交捕獲及測(cè)序?qū)嶒?yàn)。

4生物素標(biāo)記探針捕獲基因

應(yīng)用雜交富集探針（Geneseeq）對(duì)已建好的DNA文庫(kù)進(jìn)行目標(biāo)基因靶標(biāo)富集及擴(kuò)增，包括：DNA捕獲探針與文庫(kù)雜交；清洗和回收捕獲的文庫(kù)產(chǎn)物；捕獲文庫(kù)與鏈霉親和素磁珠結(jié)合；磁珠捕獲文庫(kù)清洗，去除非特異性結(jié)合的文庫(kù)。

5高通量基因測(cè)序

血漿樣本和胸腔積液提取ctDNA后送南京世和基因生物技術(shù)有限公司進(jìn)行全基因檢測(cè)。將捕獲后的文庫(kù)在Illumina HiSeq 4000高通量測(cè)序平臺(tái)上樣，DNA在Illumina試劑盒Flew cell上形成DNA簇，測(cè)序平臺(tái)相繼通過(guò)單堿基合成后暫停、熒光檢測(cè)、合成恢復(fù)的循環(huán)完成DNA高通量測(cè)序。

6數(shù)據(jù)分析

將高通量基因測(cè)序結(jié)果與中國(guó)人種hg19基因組數(shù)據(jù)對(duì)比，完成基因Mapping工作。同步分析各種基因突變類(lèi)型，分析生成腫瘤特有突變和種系突變。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 200分析數(shù)據(jù)。以外周血ctDNA結(jié)果為對(duì)照，分析各病例胸腔積液ctDNA對(duì)NSCLC基因突變的診斷效能，計(jì)算胸腔積液ctDNA診斷NSCLC基因突變的靈敏度、特異度及總體符合率。用符號(hào)秩和檢驗(yàn)對(duì)比胸腔積液和血漿EGFR基因突變檢測(cè)豐度。P<005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、胸腔積液的EGFR基因突變情況分析

22例合并MRE的NSCLC患者的胸腔積液標(biāo)本中，12例檢測(cè)到EGFR基因突變，突變率為55%（12/22）。12例EGFR基因突變標(biāo)本包括：5例（42%）19號(hào)外顯子缺失突變，該5例中有1例同時(shí)合并20號(hào)外顯子T790M原發(fā)耐藥突變；6例（50%）21號(hào)外顯子L858R點(diǎn)突變；1例不常見(jiàn)的A289F突變。19外顯子缺失突變和21外顯子L858R點(diǎn)突變共占總體突變類(lèi)型的92%（11/12）。

二、外周血的EGFR基因突變情況分析

22例合并MRE的NSCLC患者的外周血標(biāo)本中，11例檢測(cè)到EGFR基因突變，突變率為50%（11/22）。11例EGFR基因突變的標(biāo)本包括：5例（42%）19號(hào)外顯子缺失突變，該5例中有1例同時(shí)合并20號(hào)外顯子T790M原發(fā)耐藥突變；5例（42%）21號(hào)外顯子L858R點(diǎn)突變；1例不常見(jiàn)的A289F突變。19外顯子缺失突變和21外顯子L858R點(diǎn)突變共占總體突變類(lèi)型的91%（10/11）。

三、配對(duì)樣本中胸腔積液和外周血EGFR基因突變的一致性及檢測(cè)豐度的比較

以外周血ctDNA檢出的基因突變結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，胸腔積液ctDNA對(duì)NSCLC基因突變的靈敏度為86%～100%，特異度達(dá)94%～100%，與外周血ctDNA結(jié)果的總體符合率為95%～100%，見(jiàn)表1。其中，有1例患者外周血ctDNA中未檢出突變，但相應(yīng)胸腔積液ctDNA中則檢測(cè)出EGFR 21號(hào)外顯子L858R點(diǎn)突變。而在檢測(cè)豐度方面，胸腔積液ctDNA檢測(cè)出的突變豐度高于外周血ctDNA（Z=-3509，P=0002）。

討論

在目前NSCLC的診治中，基因分型指導(dǎo)下的個(gè)體化治療對(duì)于指導(dǎo)用藥至關(guān)重要。其中，針對(duì)EGFR基因突變的EGFRTKI的應(yīng)用給NSCLC患者帶來(lái)了巨大的生存獲益。但是，大部分NSCLC患者在診斷時(shí)均為晚期，難以獲取腫瘤組織。而且，由于腫瘤的異質(zhì)性，根據(jù)初診時(shí)的組織標(biāo)本指導(dǎo)后續(xù)的治療可能存在偏倚。鑒于此，液體活組織檢查（活檢）技術(shù)在腫瘤分子檢測(cè)中嶄露頭角，體液（主要為外周血，還有胸腹腔積液、尿液、唾液）中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）、ctDNA、外泌體等腫瘤來(lái)源的生物標(biāo)志物，為肺癌的精準(zhǔn)診斷和個(gè)體化治療提供了很大的助力[5]。

ctDNA指惡性腫瘤體細(xì)胞DNA經(jīng)脫落或者當(dāng)細(xì)胞凋亡后釋放進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的小片段DNA，可以出現(xiàn)與原發(fā)腫瘤DNA相同特征或基因改變：如點(diǎn)突變、超甲基化、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MI）、雜合性缺失（LOH）等多種類(lèi)型的基因修飾變異[6]。前瞻性研究表明，外周血ctDNA與腫瘤組織相比，其EGFR基因突變的檢測(cè)同樣具有較高特異度，靈敏度有待提高。外周血ctDNA檢測(cè)出EGFR突變陽(yáng)性的患者接受吉非替尼治療后，較標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)治療的患者客觀(guān)緩解率明顯提高，無(wú)進(jìn)展生存期明顯延長(zhǎng)[12]。因此，中國(guó)NSCLC患者EGFR基因突變檢測(cè)專(zhuān)家組認(rèn)為，當(dāng)腫瘤組織難以獲取時(shí)，外周血ctDNA可作為EGFR基因突變檢測(cè)的合理替代選擇，并寫(xiě)入了2016年專(zhuān)家共識(shí)[4]。

MRE是晚期NSCLC患者常見(jiàn)合并癥之一。在腫瘤組織難以獲取時(shí)，胸腔積液可以作為細(xì)胞學(xué)檢測(cè)的替代。但由于胸腔積液標(biāo)本易受采集分離等種種因素干擾，其在EGFR基因突變檢測(cè)效能報(bào)道不一。國(guó)內(nèi)禹樂(lè)等[7]應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，同一患者的胸腔積液細(xì)胞中提取的DNA質(zhì)量與組織標(biāo)本相近，濃度卻普遍略低，但檢測(cè)的總體EGFR突變率相近。趙士偉等[8]用ADxARMS方法檢測(cè)了胸腔積液和肺癌組織標(biāo)本的EGFR基因突變率，也發(fā)現(xiàn)兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

胸腔積液與外周血ctDNA在NSCLC患者EGFR基因突變檢測(cè)方面孰優(yōu)孰劣還沒(méi)有定論。由于循環(huán)中存在的ctDNA極其微量，對(duì)檢測(cè)技術(shù)提出了很高的要求。NGS一次可以針對(duì)幾十萬(wàn)至幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定，所需的DNA樣本量極少，適用于ctDNA這種微量DNA的檢測(cè)，在腫瘤診斷方面表現(xiàn)出較高的靈敏度和特異度。Couraud等[9]用NGS技術(shù)檢測(cè)了68例晚期NSCLC患者配對(duì)腫瘤組織的外周血ctDNA，結(jié)果顯示外周血ctDNA含量與分期和轉(zhuǎn)移灶數(shù)目相關(guān)，其相比組織檢測(cè)的靈敏度為58%，特異度為87%。Newman等[10]應(yīng)用NGS技術(shù)檢測(cè)NSCLC患者血漿ctDNA，發(fā)現(xiàn)在Ⅱ～Ⅳ期的患者中，檢測(cè)靈敏度達(dá)100%，Ⅰ期患者的靈敏度為50%，而各期肺癌患者的特異度均為96%。NGS技術(shù)從而也被公認(rèn)為是檢測(cè)ctDNA的“金標(biāo)準(zhǔn)”[11]。

本研究通過(guò)NGS技術(shù)檢測(cè)晚期NSCLC患者胸腔積液及配對(duì)外周血中的ctDNA，并進(jìn)行多基因聯(lián)合檢測(cè)以及對(duì)比分析，比較兩者間的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以外周血ctDNA檢出的基因突變結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，胸腔積液ctDNA對(duì)NSCLC基因突變的靈敏度為86%～100%，特異度達(dá)94%～100%，與外周血ctDNA結(jié)果的總體符合率為95%～100%。其中，有1例患者外周血ctDNA中未檢出突變，但相應(yīng)胸腔積液ctDNA中則檢測(cè)出EGFR exon 21號(hào)外顯子L858R點(diǎn)突變，為應(yīng)用EGFRTKI提供了良好的依據(jù)。在檢測(cè)耐藥突變基因T790M方面，兩者也達(dá)到了一致。而在檢測(cè)豐度方面，胸腔積液ctDNA檢測(cè)出的突變豐度高于其對(duì)應(yīng)的外周血ctDNA。究其原因，可能系胸腔積液中脫落出的腫瘤細(xì)胞片段DNA較釋放入血的更多，更易被檢測(cè)到。

外周血ctDNA作為液體活檢的重要組成，可以說(shuō)是一種新型的腫瘤標(biāo)記物，可實(shí)時(shí)反映出惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中基因異常的動(dòng)態(tài)變化，且與組織活檢標(biāo)本相比，具有操作簡(jiǎn)便、損傷小、患者易接受、可反復(fù)取材等優(yōu)勢(shì)。本研究顯示，用NGS技術(shù)亦能檢測(cè)出微量的胸腔積液ctDNA，與外周血相比，具有相同的檢測(cè)效能，甚至檢測(cè)豐度更高，從而為NSCLC患者的EGFR基因突變檢測(cè)開(kāi)辟了新途徑。胸腔積液和外周血ctDNA的檢測(cè)及其生物學(xué)指標(biāo)的研究，將有可能為晚期NSCLC患者的診斷、預(yù)后判定及跟蹤隨訪(fǎng)等提供一系列方便、快捷、特異、無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)的分子生物學(xué)檢測(cè)手段。

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（收稿日期：20170801）

（本文編輯：林燕薇）