氣相色譜法同時(shí)測定夜寒蘇藥材揮發(fā)油中α—蒎烯、β—蒎烯及芳樟醇的含量

張彪 黃芳 周漢華 張浪 董明洪 于澤玥 張蜜

中圖分類號(hào) R927.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）07-0933-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.07.17

摘 要 目的：建立同時(shí)測定夜寒蘇藥材揮發(fā)油中α-蒎烯、β-蒎烯及芳樟醇含量的方法。方法：按照2015年版《中國藥典》（四部）水蒸氣蒸餾法進(jìn)行夜寒蘇揮發(fā)油的提取。采用氣相色譜法測定含量，采用HP-5毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.032 mm×0.25 μm），氫火焰離子化檢測器（FID），載氣為氮?dú)猓M(jìn)樣口溫度為200 ℃，檢測器溫度為250 ℃，柱流量為0.8 mL/min，進(jìn)樣量為1 μL，分流比為40 ∶ 1，程序升溫。結(jié)果：α-蒎烯、β-蒎烯及芳樟醇的線性范圍分別為0.090 5～2.413 3 mg/mL（r=0.999 9）、0.098 3～2.620 0 mg/mL（r=0.999 9）、0.169 1～4.510 0 mg/mL（r=0.999 8），精密度、穩(wěn)定性（12 h）、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD≤2.0%（n=6），平均加樣回收率分別為99.84%（RSD=0.49%，n=6）、100.24%（RSD=1.38%，n=6）、99.41%（RSD=1.67%，n=6）。23批黔產(chǎn)夜寒蘇樣品揮發(fā)油中α-蒎烯、β-蒎烯及芳樟醇含量分別在0.214 4～1.325 0、0.766 2～3.172 1、0.357 4～1.518 7 mg/g范圍內(nèi)。結(jié)論：本試驗(yàn)建立的方法快速、簡便、準(zhǔn)確，可用于夜寒蘇藥材揮發(fā)油中α-蒎烯、β-蒎烯及芳樟醇含量的測定。

關(guān)鍵詞 夜寒蘇；揮發(fā)油；α-蒎烯；β-蒎烯；芳樟醇；氣相色譜法

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of α-pinene， β-pinene and linalool in volatile oil of Hedychium flavum. METHODS： The volatile oil was extracted from H. flavum according to steam distillation stated in Chinese Pharmacopoeia （2015 edition volume Ⅳ）. GC method was adopted to determine the content. The determination was performed on HP-5 capillary chromatographic column（30 m×0.032 mm×0.25 μm）with hydrogen flame ion detector （FID）， nitrogen gas as carrier gas， with injector temperature of 200 ℃， and detector temperature of 250 ℃， column flow rate of 0.8 mL/min， samples size of 1 μL and split ratio of 40 ∶ 1 by programmed temperature. RESULTS： The linear range of α-pinene， β-pinene and linalool were 0.090 5-2.413 3 mg/mL（r=0.999 9）， 0.098 3-2.620 0 mg/mL （r=0.999 9）， 0.169 1-4.510 0 mg/mL（r=0.999 8）， respectively. RSDs of precision， stability （12 h）， reproducibility tests were no more than 2.0% （n=6）. The average recoveries were 99.84%（RSD=0.49%， n=6）， 100.24%（RSD=1.38%， n=6）， 99.41% （RSD=1.67%， n=6）， respectively. The contents of α-pinene， β-pinene and linalool ranged 0.214 4-1.325 0， 0.766 2-3.172 1， 0.357 4-1.518 7 mg/g in volatile oil from 23 batches of H. flavum produced in Guizhou province. CONCLUSIONS： The method established in this experiment is rapid， simple and accurate. It can be used for the content determination of α-pinene， β-pinene and linalool in volatile oil from H. flavum.

KEYWORDS Hedychium flavum； Volatile oil； α-pinene； β-pinene； Linalool； GC

夜寒蘇為姜科植物黃姜花（Hedychium flavum Roxb.）的干燥塊根，性溫，味微甜，無毒，具有溫中散寒、解表發(fā)汗、祛風(fēng)除濕、補(bǔ)虛等功效[1-4]。夜寒蘇是貴州省苗族、布依族、侗族等同胞習(xí)用的藥物。在20世紀(jì)70年代，《貴州草藥》記載了夜寒蘇在貴州民間常將該藥用于治療寒濕白帶、體虛自汗、風(fēng)濕筋骨疼痛、消化不良、感冒、胃氣虛弱、頭痛身痛、跌打損傷等病癥[5]。楊秀澤、周漢華等[6-7]雖然已對(duì)夜寒蘇進(jìn)行了性狀及化學(xué)成分鑒別，但夜寒蘇化學(xué)成分的研究報(bào)道目前相對(duì)仍然不足，其主要成分是揮發(fā)油。目前夜寒蘇尚未被《中國藥典》《地方標(biāo)準(zhǔn)》收載，沒有明確的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。鑒于此，筆者依據(jù)《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2013年版）中規(guī)范和要求，采用氣相色譜法同時(shí)測定夜寒蘇藥材揮發(fā)油中α-蒎烯、β-蒎烯及芳樟醇含量的方法。

1 材料

1.1 儀器

7890B氣相色譜儀，包括氫火焰離子化檢測器（FID）、HP-5毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.032 mm×0.25 μm）、HP-5毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、WMPEG-20M毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.032 μm）（美國Agilent公司）；98-1-B電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；XS205電子天平、AB204-S分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；1 000 mL揮發(fā)油提取器（天長市科儀實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；FW500A/1000A高速多功能粉碎機(jī)（上海冰都電器有限公司）。

1.2 對(duì)照品與試劑

芳樟醇對(duì)照品（批號(hào)：111503-201603，純度：97.8%）、α-蒎烯對(duì)照品（批號(hào)：C16211000，純度：98.5%）、β-蒎烯對(duì)照品（批號(hào)：C16211020，純度：99.5%）均購自中國食品藥品檢定研究院；正己烷為色譜純。

1.3 藥材

本試驗(yàn)所用23批夜寒蘇藥材均采集于貴州各地，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥鑒定教研室周漢華教授鑒定均為姜科姜花屬植物黃姜花Hedychium flavum Roxb.的根莖，具體信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用HP-5毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.032 mm×0.25 μm），F(xiàn)ID，載氣為氮?dú)猓兌龋?9.999%），進(jìn)樣口溫度為200 ℃，檢測器溫度為250 ℃，柱流量為0.8 mL/min，分流比為40 ∶ 1，進(jìn)樣量為1 μL，程序升溫（起始溫度60 ℃，保持2 min；以7 ℃/min升溫至85 ℃，保持2 min；以1

℃/min升溫至105 ℃，保持1 min；再以10 ℃/min升溫至150 ℃，保持2 min）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 取夜寒蘇藥材各100 g，粉碎過5號(hào)篩，精密稱定，加入15倍量（1 500 mL）水浸泡0.5 h，然后按照2015年版《中國藥典》（四部）“通則2204”揮發(fā)油測定甲法[8]提取夜寒蘇中揮發(fā)油，得油狀物，冷卻后收集密封，置于冰箱中冷藏保存，備用。精密稱取揮發(fā)油樣品適量，置于10 mL量瓶中，加正己烷定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液 分別稱取α-蒎烯、β-蒎烯及芳樟醇對(duì)照品0.072 40、0.078 60、0.135 30 g，精密稱定加入正己烷，配制成每1 mL含α-蒎烯7.240 0 mg、β-蒎烯7.860 0 mg、芳樟醇13.530 0 mg的混合溶液，即得。

2.2.3 空白對(duì)照溶液 取上述作稀釋劑的正己烷適量作為空白對(duì)照溶液。

2.3 專屬性考察

取空白對(duì)照溶液、混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各1 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜。結(jié)果，在該色譜條件下，其他成分對(duì)待測成分未見干擾，方法的專屬性良好，色譜圖詳見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液配制成α-蒎烯含量為2.413 3、1.448 0、0.724 0、0.362 0、0.181 0、0.090 5 mg/mL，β-蒎烯含量為2.620 0、1.572 0、0.786 0、0.393 0、0.196 5、0.098 3 mg/mL，芳樟醇含量為4.510 0、2.706 0、1.353 0、0.676 5、0.338 3、0.169 1 mg/mL的系列混合對(duì)照品溶液。精密吸取上述溶液1 μL，分別注入氣相色譜儀中，記錄色譜。以峰面積為縱坐標(biāo)（y）、測定對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得α-蒎烯、β-蒎烯、芳樟醇回歸方程分別為y=341.55x+1.239 9（r=0.999 9）、y=481.04x-1.992 3（r=0.999 9）、y=469.99x+10.173（r=0.999 8）。結(jié)果表明，α-蒎烯、β-蒎烯、芳樟醇檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.090 5～2.413 3、0.098 3～2.620 0、0.169 1～4.510 0 mg/mL。

2.5 精密度試驗(yàn)

分別精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液1 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，α-蒎烯、β-蒎烯、芳樟醇峰面積的RSD分別為0.98%、2.02%、0.92%（n=6），表明該儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取同一批夜寒蘇藥材（編號(hào)：S1）粉末1份，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在室溫下放置0、1、2、4、8、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積。結(jié)果，α-蒎烯、β-蒎烯、芳樟醇峰面積的RSD分別為1.89%、1.80%、1.94%（n=6），表明藥材中的α-蒎烯、β-蒎烯、芳樟醇在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一批夜寒蘇藥材（編號(hào)：S1）粉末6份，平行稱定，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積。結(jié)果，α-蒎烯、β-蒎烯、芳樟醇峰面積的RSD分別為1.98%、1.60%、1.52%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

稱取已知含量的夜寒蘇藥材（編號(hào)：S1）粉末適量，共6份，每份約1 g，平行稱定，分別精密加入α-蒎烯（1.448 0 mg）、β-蒎烯（1.572 0 mg）、芳樟醇（2.706 0 mg）的混合對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算其各自的平均加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2結(jié)果顯示，α-蒎烯、β-蒎烯、芳樟醇的平均加樣回收率分別為99.84%、100.24%、99.41%，其結(jié)果在95%～105%之間，表明加樣回收率良好。

2.9 樣品含量測定

分別取23批夜寒蘇藥材粉末各100 g，精密稱定，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄色譜圖，結(jié)果見表3。

由表3可見，23批夜寒蘇藥材中揮發(fā)油含量為0.8～1.6 mL/100 g，α-蒎烯、β-蒎烯、芳樟醇含量分別在0.214 4～ 1.325 0、0.766 2～3.172 1、0.357 4～1.518 7 mg/g范圍內(nèi)。其中，夜寒蘇揮發(fā)油含量較高的產(chǎn)地為遵義市、開陽縣及興義市等，普安縣的夜寒蘇藥材中揮發(fā)油含量較低。α-蒎烯含量較高地區(qū)為遵義市、開陽縣、余慶縣、烏當(dāng)區(qū)，含量較低地區(qū)為高坡鄉(xiāng)、惠水縣、龍里縣及普安縣。β-蒎烯含量較高為遵義市、興義市，含量較低地區(qū)為普安縣和孟關(guān)鄉(xiāng)。芳樟醇含量較高地區(qū)為遵義市、二戈寨、烏當(dāng)區(qū)、余慶縣，含量較低有普安縣和織金縣。綜上可知，23批夜寒蘇藥材不論是揮發(fā)油含量，還是3種成分含量，均存在差異。遵義市樣品不論是揮發(fā)油含量，還是3種成分含量均較高，表明遵義市夜寒蘇藥材質(zhì)量較好，提示產(chǎn)地是影響夜寒蘇藥材質(zhì)量的因素之一。

3 討論

3.1 相同產(chǎn)地不同批次含量差異

本研究所采集的23批次藥材中有5個(gè)產(chǎn)地分別采集兩次樣品，而實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明相同產(chǎn)地所采集的藥材樣品揮發(fā)油及所測的3種成分含量都存在差異。導(dǎo)致這種結(jié)果的原因可能有以下幾點(diǎn)：（1）采集地土地肥沃不一致以及生態(tài)環(huán)境不一樣。（2）這幾個(gè)地方兩次采樣時(shí)間不同，第一次采樣在2016年，第二次采樣在2017年，可能與藥材的儲(chǔ)存時(shí)間和生長年限有關(guān)。

3.2 化學(xué)成分鑒定與分析

近年來，多項(xiàng)研究對(duì)夜寒蘇揮發(fā)油進(jìn)行了成分鑒定及分析[9-15]。從報(bào)道中可以看出存在兩種不同結(jié)果：一種是李翔等[13]將β-石竹烯定為黃姜花根莖的指標(biāo)成分；另一種是本課題組及其他學(xué)者認(rèn)為夜寒蘇揮發(fā)油主要成分為芳樟醇、α-蒎烯、1，8-桉油精、4-松油酸、β-蒎烯、α-松油醇等。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因有以下幾種：（1）實(shí)驗(yàn)室所采集的樣品是否是同一種植物及同名異物藥材。（2）該藥材目前尚無不同季節(jié)采收時(shí)化學(xué)成分存在差異的相關(guān)報(bào)道。（3）是否在試驗(yàn)中有別的成分引入導(dǎo)致這因素。目前尚無法得出確定的結(jié)論。

綜上，本研究建立了同時(shí)測定夜寒蘇藥材揮發(fā)油中α-蒎烯、β-蒎烯及芳樟醇3種成分含量的氣相色譜法。該方法簡單、重復(fù)性良好，可用于夜寒蘇藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 中國科學(xué)院昆明植物研究所.云南植物志[M].北京：教育科學(xué)出版社，1997：11.

[ 2 ] 胡秀，劉念.中國姜花屬Hedychium野生花卉資源特點(diǎn)[J].廣東園林，2009，31（4）：7-11.

[ 3 ] 張彪，周漢華.黔產(chǎn)姜花屬植物的研究進(jìn)展[J].貴州科學(xué)，2017，35（4）：21-26.

[ 4 ] 貴州植物志編委會(huì).貴州植物志：第四卷[M].成都：四川民族出版社，1989：686-687.

[ 5 ] 貴州省中醫(yī)研究所.貴州草藥：第二集[M].貴陽：貴州人民出版社，1970：671.

[ 6 ] 楊秀澤，周漢華，童紅.夜寒蘇（圓瓣姜花）的鑒定及揮發(fā)油成分GC-MS分析[J].中國藥房，2011，22（7）：642-643.

[ 7 ] 周漢華，趙曦，梁曉樂.夜寒蘇的鑒定及揮發(fā)油成分GC-MS分析[J].中藥材，2008，31（7）：977-979.

[ 8 ] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：四部[S]. 2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：203.

[ 9 ] 高杰杰，郝小江，何紅平，等.圓瓣姜花的化學(xué)成分研究[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，36（3）：28-30.

[10] 趙超，龔小見，陳華國，等.黔產(chǎn)夜寒蘇揮發(fā)性化學(xué)成分固相微萃取/氣相色譜/質(zhì)譜分析[J].中華中醫(yī)藥雜志，2010，25（7）：1090-1092.

[11] 蘆燕玲，高則睿，徐世濤，等. GC-MS法分析姜花屬四種植物的揮發(fā)性成分[J].化學(xué)研究與應(yīng)用，2013，25（2）：210-215.

[12] 周露，練強(qiáng)，謝文申.黃姜花根莖的揮發(fā)性成分研究[J].香料香精化妝品，2017，46（4）：11-13.

[13] 李翔，鐘方友，孟凡冰，等.響應(yīng)面法超聲輔助提取黃姜花揮發(fā)油及其化學(xué)成分分析[J].成都大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2017，36（4）：346-350.

[14] 張彪，周漢華，殷少文，等.氣相色譜法測定黔產(chǎn)夜寒蘇揮發(fā)油及其桉油精含量[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2017，13（9）：28-31.

[15] 周曦曦，王進(jìn)喜，楊坤，等.苗藥夜寒蘇根莖化學(xué)成分定性研究[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2017，23（6）：35-36.

（收稿日期：2018-01-03 修回日期：2018-02-25）

（編輯：余慶華）