丹參片治療口腔黏膜白斑及對局部組織金屬基質(zhì)蛋白酶—2、基質(zhì)金屬蛋白酶—9表達(dá)的影響

朱鵬君　鄒桂梅　汪銘

摘要 目的：探討丹參片治療口腔黏膜白斑（OLK）的臨床療效及對局部組織細(xì)胞金屬基質(zhì)蛋白酶-2、9（MMP-2、MMP-9）表達(dá)的影響。方法：選取2014年5月至2016年3月南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院OLK患者136例，隨機(jī)分為對照組與觀察組，每組68例，同期進(jìn)行口腔檢查的20例健康人群作為健康對照組。對照組患者給予維甲酸和西瓜霜噴霧劑治療，觀察組則在對照組的基礎(chǔ)上聯(lián)合丹參片治療。2個月為1個療程，2組均連續(xù)治療1個療程，治療后隨訪12個月。比較2組治療后臨床療效，采用免疫組化法檢測OLK患者及健康對照組局部黏膜組織中MMP-2、MMP-9表達(dá)情況。結(jié)果：治療2個月后觀察組總有效率為80.88%，顯著高于對照組的63.24%（P<0.05）；治療4個月后觀察組總有效率較治療2個月后明顯升高，且高于對照組（P<0.05）。與健康對照組比較，觀察組局部黏膜組織中MMP-2和MMP-9陽性表達(dá)率明顯升高（P<0.05）；與治療前比較，治療2個月及4個月后觀察組局部黏膜組織中MMP-2和MMP-9陽性表達(dá)率明顯降低（P<0.05），且治療4個月后觀察組局部黏膜組織中MMP-2陽性表達(dá)率低于對照組（P<0.05）；對照組僅治療4個月后局部黏膜組織中MMP-2陽性表達(dá)率較治療前降低（P<0.05）。2組隨訪期間觀察組復(fù)發(fā)率明顯低于對照組（P<0.05），2組癌變率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：丹參片聯(lián)合常規(guī)藥物治療OLK效果顯著，可顯著抑制局部組織MMP-2和MMP-9表達(dá)，并在短期內(nèi)對抑制組織癌變具有一定的積極作用。

關(guān)鍵詞 口腔黏膜白斑；丹參片；金屬基質(zhì)蛋白酶

Abstract Objective：To explore the clinical efficacy of Danshen Tablet on oral leukoplakia （OLK） and its effects on the expression of metal matrix protease-2，9 （MMP-2 and MMP-9） in local tissues.Methods：A total of 136 patients with OLK treated in Nanjing Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Hospital Affiliated to Nanjing University of Traditional Chinese Medicine from May 2014 to March 2016 were selected and randomly divided into control group and observation group，with 68 cases in each group，and 20 cases of healthy people were chosen in the same period as healthy control group.The patients in the control group were treated with retinoic acid and watermelon frost spray，and the observation group was treated with Danshen Tablet on the basis of the same treatment.Both groups were treated for 1 course （2 months as a course） and followed up for 12 months after treatment.The clinical effects of the 2 groups were compared and the expressions of MMP-2 and MMP-9 in local mucosa of OLK patients and healthy controls were detected by immunohistochemistry.Results：After 2 months treatment，the total effective rate of the observation group was 80.88%，which was significantly higher than 63.24% of the control group （P<0.05）.After 4 months′ treatment，compared with 2 months treatment，the total effective rate in the observation group was significantly increased which was higher than the control group （P<0.05）.Compared with the healthy control group，the positive expression rates of MMP-2 and MMP-9 in the local mucosa tissues of OLK patients were significantly increased （P<0.01），and the positive expression rates of MMP-2 and MMP-9 in the local mucosa tissues in the observation group decreased more significantly after 2 months and 4 months treatment than before treatment （P<0.05 or P<0.01）.The positive expression rate of MMP-2 in the local mucosa tissues of observation group was decreased more than control group （P<0.05），and the positive expression rate of MMP-2 in local mucosa tissues of the control group 4 months after treatment decreased more significantly than that before treatment （P<0.05）.The recurrence rate of the observation group decreased more significantly than that of the control group during the follow-up period （P<0.05），and there was no significant difference in cancer rate between the 2 groups （P>0.05）.Conclusion：The combination of Danshen Tablets and conventional drugs have significant effects on OLK.It can significantly inhibit the expression of MMP-2 and MMP-9 in local tissues，which has a positive effect on the inhibition of tissue cancer in the short term.

Key Words Oral leukoplakia； Danshen Tablets； Metal matrix protease

中圖分類號：R289.5；R751文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.09.020

口腔黏膜白斑病（OLK）發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與內(nèi)分泌功能紊亂、維生素缺乏、霉菌感染及局部持續(xù)性機(jī)械刺激等導(dǎo)致口腔黏膜上皮過度角化等有關(guān)，患者可于頰、舌、唇等部位黏膜上出現(xiàn)灰白色或乳白色斑狀病變，隨著疾病進(jìn)展病變部位可逐漸增大、變厚及變粗糙。口服維生素、冷凍及手術(shù)治療可改善OLK患者臨床癥狀。但有研究顯示，OLK癌變率為3%～5%，單純對癥治療無法有效控制其癌前病變[1]。研究顯示，丹參主要有效成分丹參酮可抑制肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞及結(jié)直腸癌細(xì)胞等的體外增殖，具有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[2-4]。細(xì)胞金屬基質(zhì)蛋白酶（MMP）是由腫瘤細(xì)胞分泌的一類具有降解細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜的蛋白水解酶，在腫瘤侵襲及遷移過程中具有非常重要的生物學(xué)作用[5]。本研究重點(diǎn)探討丹參片對OLK的治療效果及對局部組織MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年5月至2016年3月本院收治的OLK患者136例，隨機(jī)分為對照組和觀察組，每組68例。對照組中男47例，女21例；平均年齡（45.5±8.6）歲；平均病程（5.7±3.1）個月；其中均質(zhì)型42例，顆粒型14例，其他類型12例。觀察組中男43例，女25例；平均年齡（47.7±9.1）歲；平均病程（5.5±3.9）個月；其中均質(zhì)型44例，顆粒型12例，其他類型12例。同時(shí)選取20名同期進(jìn)行口腔檢查的健康人作為健康對照組，男13名，女7名；平均年齡（47.5±8.4）歲。3組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究通過我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 所有患者均經(jīng)臨床體征檢查及病理組織學(xué)檢查確診，符合WHO口腔黏膜癌前病變協(xié)作中心對白斑的診斷。中醫(yī)診斷參照國家中醫(yī)藥管理局頒布的《中醫(yī)臨床診療規(guī)范》和《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) 符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)者；治療依從性良好者；所有入組患者及其家屬對研究內(nèi)容及意義均知情同意者。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 白斑區(qū)出現(xiàn)基底變硬、表面增厚及潰瘍等疑似癌變者；伴有其他嚴(yán)重心內(nèi)科疾病者；伴有惡性腫瘤者；伴有明顯精神異常者；對本研究所用藥物存在過敏現(xiàn)象者；妊娠或哺乳期婦女等。

1.5 脫落與剔除標(biāo)準(zhǔn) 治療期間因發(fā)生嚴(yán)重不良事件需終止治療者；治療期間擅自增減治療藥物者；未能按照治療方案完成治療周期者；主動提出退出本研究者等。

1.6 治療方法 2組患者入院后常規(guī)去除口腔內(nèi)不良修復(fù)體，清潔口腔，并囑其生活中注意戒煙戒酒，飲食清淡等，對照組患者口服維甲酸，10 mg/次，1次/d；西瓜霜噴霧劑，1～2 g/次，8～10次/d；觀察組則在對照組的基礎(chǔ)上聯(lián)合丹參片治療，3片/次，3次/d。2個月為1個療程，2組均連續(xù)治療1個療程。

1.7 觀察指標(biāo) 1）統(tǒng)計(jì)2組患者臨床療效；2）分別于治療前及治療2個月、4個月后采集2組患者口腔黏膜白斑組織，同時(shí)采集健康對照組正常左側(cè)口腔黏膜，口腔黏膜白斑組織石蠟包埋后制成切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶后，采用免疫組化法檢測口腔黏膜白斑組織中MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)情況：石蠟切片復(fù)溫，分別滴加一抗：兔抗人多克隆抗體MMP-2、MMP-9（北京中杉金橋公司，工作濃度1∶100），37 ℃下孵育30 min，經(jīng)磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌，3 min/次，洗3次；滴加二抗：廣譜通用型非生物素化IgG，37 ℃下孵育20 min，經(jīng)PBS洗滌，3 min/次，洗3次；滴加DAB染色液，顯微鏡下控制顯色；經(jīng)蘇木精復(fù)染2 min，梯度乙醇脫水，自然晾干后，以中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下判定染色結(jié)果，陽性著色為細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)棕黃及棕褐色；隨機(jī)選取5個視野，統(tǒng)計(jì)各個視野中陽性細(xì)胞百分比，然后對各個視野中的陽性細(xì)胞數(shù)評分，0分：陽性細(xì)胞百分比約為5%，陰性；1分：陽性細(xì)胞百分比為5%～25%，散發(fā)；2分：陽性細(xì)胞百分比為26%～50%，局部；3分：陽性細(xì)胞百分比為51%～75%，彌漫；4分：陽性細(xì)胞百分比>75%。陽性染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)為：0分：不著色；1分：淡黃色；2分：棕黃色；3分：棕褐色。染色總評分=陽性細(xì)胞數(shù)評分×陽性染色強(qiáng)度評分。若染色總評分<3分，則為表達(dá)陰性；若染色總評分≥3分，則為表達(dá)陽性。3）治療結(jié)束后所有患者均進(jìn)行連續(xù)12個月的隨訪，統(tǒng)計(jì)并比較患者復(fù)發(fā)情況及癌變情況。

1.8 療效判定標(biāo)準(zhǔn) 痊愈：臨床癥狀消失，口腔黏膜白斑完全消退；顯效：臨床癥狀顯著改善，口腔黏膜白斑面積減少超過2/3；有效：臨床癥狀部分改善，口腔黏膜白斑面積減少在1/3～2/3；無效：臨床癥狀未見改善，口腔黏膜白斑面積減少未超過1/3或無明顯變化?？傆行?治愈率+顯效率+有效率。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組臨床療效比較 治療2個月后觀察組總有效率為80.88%，顯著高于對照組的63.24%（P<0.05）；治療4個月后觀察組總有效率較治療2個月后明顯升高，且高于對照組（P<0.05）。見表1。

2.2 2組MMP-2和MMP-9表達(dá)比較 與健康對照組比較，觀察組局部黏膜組織中MMP-2和MMP-9陽性表達(dá)率明顯升高（P<0.05）；與治療前比較，治療2、4個月后觀察組局部黏膜組織中MMP-2和MMP-9陽性表達(dá)率明顯降低（P<0.05），且治療4個月后觀察組局部黏膜組織中MMP-2陽性表達(dá)率低于對照組；對照組僅治療4個月后局部黏膜組織中MMP-2陽性表達(dá)率較治療前降低（P<0.05）。見表2。

免疫組化染色結(jié)果顯示，MMP-2、MMP-9陽性著色主要為棕黃色染色，染色部位主要位于細(xì)胞質(zhì)。如圖1。

2.3 2組治療12個月后復(fù)發(fā)及癌變情況比較

136例OLK患者中共有124例參與隨訪（觀察組60例，對照組64例），隨訪期間失聯(lián)8例（觀察組3例，對照組5例），因其他非腫瘤疾病死亡4例（觀察組和對照組各2例）；剩余112例患者中，觀察組復(fù)發(fā)1例（1.82%），癌變?yōu)榭谇活a癌1例（1.82%），對照組復(fù)發(fā)7例（12.28%），癌變?yōu)榭谇活a癌3例（5.26%），觀察組復(fù)發(fā)率明顯低于對照組（P<0.05），2組癌變率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

口腔黏膜白斑病（OLK）為口腔黏膜的角化性疾病，患者口腔黏膜局部可出現(xiàn)反復(fù)潰瘍及疼痛，病程長，該病的發(fā)生及進(jìn)展與患者長期多種刺激性因素綜合作用有關(guān)，因此降低外界因素的刺激及注重內(nèi)環(huán)境的調(diào)節(jié)對疾病治療尤為重要。研究表明，OLK是口腔癌前病變的一種，部分中老年患者因機(jī)體新陳代謝及免疫功能的降低，可增加OLK癌變率[6-7]。臨床數(shù)據(jù)顯示，34%的OLK與白色念珠菌有關(guān)，OLK易使細(xì)胞產(chǎn)生惡性增殖及癌變[8]。

中醫(yī)認(rèn)為OLK是一種全身性疾病的局部表現(xiàn)，五臟六腑為其發(fā)病根源，尤與心脾密切相關(guān)，兩頰屬脾，舌為心之苗，其病因多由心火脾熱、瘀血阻絡(luò)、濕從熱化薰蒸于口、舌而成，心移熱于小腸則口、舌生瘡，脾經(jīng)濕熱壅滯，濁氣不降反升，浸潤唇、舌、腭部、頰部黏膜則潰爛，與正氣虧虛，熱、毒、濕邪入侵有關(guān)[9-10]。胡蓮[11]運(yùn)用加味連術(shù)湯聯(lián)合西藥治療OLK臨床療效達(dá)87.87%，明顯高于單純西藥治療。董文杰等[12]在局部或全身藥物治療外，應(yīng)用清熱健脾、理氣排毒中藥湯劑治療也取得了較為滿意的療效，且復(fù)發(fā)率低。近年來研究證實(shí)，丹參主要有效成分丹參酮ⅡA除具有抗氧化、抗菌消炎及抗心腦血管疾病等作用外，還對腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的殺傷作用，并可促進(jìn)其凋亡、抑制其惡性增殖[13-14]；同時(shí)，丹參可清除氧自由基、降低血液黏稠度、擴(kuò)張血管、減少血小板聚集、改善血液流變學(xué)，抑制成纖維細(xì)胞增殖，并促其凋亡，局部用藥可誘導(dǎo)新生毛細(xì)血管形成、維持血管內(nèi)皮細(xì)胞膜完整性等作用。趙雁煥等[15]對口腔黏膜下纖維變性患者于口腔黏膜病變區(qū)域注射曲安奈德及丹參注射液，療效顯著，并明顯減輕了疼痛程度。本研究結(jié)果顯示，治療2個月后觀察組總有效率為80.88%，顯著高于對照組的63.24%；治療4個月后觀察組總有效率較治療2個月后明顯升高，且高于對照組，治療后隨訪期間，觀察組復(fù)發(fā)1例，對照組復(fù)發(fā)7例，2組復(fù)發(fā)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明丹參片聯(lián)合常規(guī)西藥治療OLK效果優(yōu)于單純西藥治療，且療效維持時(shí)間久，治療后復(fù)發(fā)率低。

OLK的癌變過程是一個多因素的連續(xù)的病理過程，期間由正常口腔黏膜至黏膜異常增生、原位癌變至疾病進(jìn)展至浸潤癌。有研究顯示，OLK的上皮異常增生的程度越重，癌變的風(fēng)險(xiǎn)就越大[16]。MMP-2及MMP-9是MMP家族中唯一可以降解Ⅳ型膠原的明膠酶類，MMP-2是由結(jié)締組織細(xì)胞分泌的，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，與MMPs結(jié)構(gòu)上具有較大同源性，在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮一定的作用[17]。已有研究顯示，MMP-2的過度表達(dá)在多種腫瘤組織中均可檢測出來，并發(fā)現(xiàn)與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，對預(yù)測腫瘤轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)有一定的價(jià)值[18-19]。MMP-9通過破壞基質(zhì)降解平衡，促使癌細(xì)胞穿越組織學(xué)屏障，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲其鄰近周圍組織及向遠(yuǎn)處正常組織轉(zhuǎn)移[20]。本研究免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，MMP-2、MMP-9陽性著色主要為棕黃色染色，染色部位主要位于細(xì)胞質(zhì)；與健康對照組比較，OLK患者局部黏膜組織中MMP-2和MMP-9陽性表達(dá)率明顯升高，表明患者口腔黏膜組織基底膜及其組織屏障已經(jīng)受到破壞，癌變率大大增高；與治療前比較，治療2個月及4個月后觀察組局部黏膜組織中MMP-2和MMP-9陽性表達(dá)率明顯降低，且治療4個月后觀察組局部黏膜組織中MMP-2陽性表達(dá)率低于對照組；對照組僅治療4個月后局部黏膜組織中MMP-2陽性表達(dá)率較治療前降低。表明丹參片聯(lián)合常規(guī)西藥治療OLK可能是由降低黏膜局部組織中MMP-2和MMP-9的表達(dá)起到改善臨床癥狀和修復(fù)組織細(xì)胞的作用，同時(shí)對抑制其癌變的進(jìn)展起到積極的作用。

綜上所述，丹參片聯(lián)合常規(guī)藥物治療OLK效果顯著，可降低局部黏膜組織中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平，對短期內(nèi)抑制組織癌變具有一定的積極作用。

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（2018-06-25收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）