小麥籽粒中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測(cè)及分布研究

劉堅(jiān) 毛紅霞

【摘要】本文將小麥籽粒制成的全麥粉、小麥粉和干面筋作為分析對(duì)象，建立免疫親和高效液相色譜分析全麥粉、小麥粉和干面筋中脫氧雪腐鐮刀茵烯醇（DON）的檢測(cè)方法，研究DON在分析對(duì)象中的分布變化規(guī)律。該方法采用免疫親和柱凈化，以甲醇：乙腈：水=10：10：80（V/V/V）為流動(dòng)相，進(jìn)樣量100μL，回收率為74.7%～104.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差6.4%～12.3%，線性關(guān)系r值0.9995，方法檢出限25μg/kg。檢測(cè)分析結(jié)果顯示，小麥制成小麥粉后相比較全麥粉，DON含量降低了88.4%～95.3%，制成千面筋后未檢出DON。

【關(guān)鍵詞】高效液相色譜；脫氧雪腐鐮刀茵烯醇；全麥粉；小麥粉；干面筋

當(dāng)今，食品安全是人類關(guān)注的焦點(diǎn)，而小麥作為國(guó)人的日?；A(chǔ)口糧和其他食品的原料，其質(zhì)量安全又尤為顯得重要。據(jù)有關(guān)調(diào)查研究顯示，小麥易被禾谷鐮刀菌、粉紅鐮刀菌、黃色鐮刀菌等多種鐮刀霉菌污染，產(chǎn)生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）。小麥中檢出DON的機(jī)率大多數(shù)超過(guò)了50%，部分國(guó)家和地區(qū)甚至已經(jīng)達(dá)到了100%，小麥的衍生副產(chǎn)品中也檢出了DON。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇是一類嘔吐毒素，常常被稱為“嘔吐毒素”。該毒素具有一定的毒性，影響動(dòng)物的生長(zhǎng)和食物的吸收。家禽類動(dòng)物或人類誤食后可能引起嘔吐、腹瀉、內(nèi)毒素血癥，嚴(yán)重的甚至造成血小板缺乏癥和神經(jīng)系統(tǒng)紊亂。因此，我國(guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》（GB 2761-2017）中規(guī)定了小麥、小麥粉中DON含量不得超過(guò)1000μg/kg。

目前DON的分析檢測(cè)方法有薄層色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法等。但是薄層色譜法和酶聯(lián)免疫吸附法均存在靈敏度差和重復(fù)性差的問(wèn)題。高效液相色譜法由于前處理?xiàng)l件和儀器分析條件的差異，檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度都有較大的差距，本文建立免疫親和柱凈化的前處理方法，建立用甲醇：乙腈：水=10：10：80（V/V/V）三元流動(dòng)相體系，100μL大體積進(jìn)樣分析DON的新方法，分析檢測(cè)全麥粉、小麥粉和干面筋中的DON含量，查找DON在小麥中的分布規(guī)律，優(yōu)化小麥的商業(yè)用途，對(duì)保護(hù)人類食品安全有重大意義。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

Agflent 1100液相色譜儀（配紫外檢測(cè)器）：安捷倫公司；粉碎機(jī)：成都施特威公司；小型實(shí)驗(yàn)?zāi)ィ旱聡?guó)布拉本德公司；面筋儀：瑞典波通公司；電加熱干燥器：瑞典波通公司；高速均質(zhì)器：飛利浦公司；玻璃纖維濾紙：英國(guó)Whatman公司；6位空氣泵操作架：北京中檢維康公司；電子天平：梅特勒公司；氮吹儀：無(wú)錫沃信公司；免疫親和柱：美國(guó)Vicam公司。

色譜純甲醇：中國(guó)國(guó)藥；色譜純乙腈：中國(guó)國(guó)藥；聚乙二醇PEG8000：美國(guó)Vicam公司；超純水：美國(guó)Millipore公司。

嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（純度大于99.5%）：200.3μg/mL。

嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：取適量體積嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，氮?dú)鈨x吹干后，用流動(dòng)相（甲醇+乙腈+水/10+10+80）分別配制濃度為100μg/mL、300μgL、500μg/L、1000μg/L、2000μg/L、4000μg/L、6 000μg/L的DON標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2試驗(yàn)樣品

全麥粉：將小麥顆粒除雜后粉碎至80%以上過(guò)20目篩，篩上物和篩下物混勻制成全麥粉。小麥粉：將小麥顆粒除雜后用小型實(shí)驗(yàn)?zāi)ブ瞥尚←湻邸８擅娼睿喊凑誈B/T 5506.2-2008和GB/T 5506.4-2008，將小麥粉洗成淡黃色的濕面筋，將濕面筋用電加熱干燥器烘干后，即制成了干面筋，樣品前處理時(shí)磨成粉末。

1.3樣品處理

1.3.1樣品制備

按照1.2制備試驗(yàn)樣品。

1.3.2樣品提取

稱取25g試驗(yàn)樣品和5g聚乙二醇PEG8000，用100mL乙腈水（80/20）溶于均質(zhì)器中，以10000r/min的速度均質(zhì)2min，靜置2min，用玻璃纖維濾紙過(guò)濾提取溶液，收集澄清濾液于50mL比色管中。

1.3.3樣品凈化

連接免疫親和柱于玻璃注射器下，準(zhǔn)確移取2mL混勻的濾液于玻璃注射器中，連接空氣泵和玻璃注射器，調(diào)節(jié)空氣壓力，使溶液以約1滴/s～2滴，s的速度通過(guò)免疫親和柱，直至空氣完全進(jìn)入到免疫親和柱中。用5mL高純水淋洗免疫親和柱，流速保持在1滴/s～2滴/s的速度，直至空氣完全通過(guò)免疫親和柱。準(zhǔn)確加入1.0mL色譜純甲醇到玻璃注射器中，淋洗免疫親和柱并收集1.0mL全部樣品洗脫液于玻璃測(cè)試管中。

1.3.4提取液定容

將1.0mL洗脫液用氮?dú)鈨x吹干后，用300μL流動(dòng)相（甲醇+乙腈+水/10+10+80）定容洗脫液，進(jìn)高效液相色譜儀分析測(cè)定。

1.4儀器條件

色譜柱：AgilentC18 5μm4.6mmx250mm；流動(dòng)相：甲醇：乙腈：水（V/V，10：10：80）；流速：0.8mL/min；進(jìn)樣量：100μL；柱溫：30℃；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：218nm。

2結(jié)果與討論

2.1試驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1免疫親和柱吸附能力的優(yōu)化

DON免疫親和柱對(duì)DON具有特異吸附性，當(dāng)樣品提取液通過(guò)親和柱，樣品中的DON會(huì)和親和柱中的特異性抗體結(jié)合，而提取液中的其它組分或雜質(zhì)不會(huì)與親和柱結(jié)合，將隨洗脫液流出，實(shí)現(xiàn)對(duì)提取液中DON的凈化提取。免疫親和柱凈化技術(shù)雖然具有強(qiáng)特異性、高靈敏度、高回收率等特性，但是免疫親和柱中的抗體是一定量的，一旦通過(guò)免疫親和柱的樣品量過(guò)大，無(wú)法保證樣品提取液中DON完全被吸附，從而造成回收率較低。對(duì)免疫親和柱進(jìn)行不同含量嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸附回收率試驗(yàn)，具體見(jiàn)圖1。從圖1中可知，免疫親和柱的最高吸附DON的容量是1200ng左右，當(dāng)樣品中DON含量超過(guò)免疫親和柱的最大吸附容量時(shí)，超過(guò)最大吸附容量的部分會(huì)流出親和柱，導(dǎo)致回收率降低。

2.1.2流動(dòng)相、流速和進(jìn)樣體積的優(yōu)化

分別以三種不同的流動(dòng)相甲醇水（V/V，40：60）、甲醇乙腈水（VN/V，10：10：800、乙腈水（v/v，dO：60）進(jìn)行液相分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以甲醇/乙腈/水（V/V/V，10：10：80）為流動(dòng)相時(shí)，很好地將雪腐鐮刀菌烯醇和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇進(jìn)行了分離，有效避免了雜質(zhì)的干擾，其色譜峰的峰形優(yōu)于其它流動(dòng)相的峰形，無(wú)拖尾現(xiàn)象。同時(shí)隨著流動(dòng)相的流速增大，保留時(shí)間相應(yīng)縮短，但峰形集中，柱前壓較大，影響分離柱的使用壽命，0.8mL/min的流速完全能保證DON的分離。另外，大多數(shù)情況下使用20～50μL作為樣品上機(jī)分析的體積，本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)樣體積提高至100μL，既可以保證樣品的峰形對(duì)稱，又可以提高樣品的檢出限，因此將100μL定位樣品的上機(jī)體積。在該條件下，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的色譜圖見(jiàn)圖2和圖3。

2.1.3樣品洗脫液的優(yōu)化

洗脫液直接以甲醇洗脫后的溶液進(jìn)樣分析，發(fā)現(xiàn)DON沒(méi)有達(dá)到完全分離，出峰受到了干擾，甲醇洗脫定容后用氮?dú)獯蹈?，再?00μL流動(dòng)相進(jìn)行定容，樣品中嘔吐毒素的峰可與其他組分實(shí)現(xiàn)完全分離，不受其他組分峰型的干擾，且提高了方法的靈敏度。

2.2方法的線性范圍與方法的檢出限

在規(guī)定的色譜條件下，測(cè)定系列DON標(biāo)準(zhǔn)溶液，用峰面積對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中的質(zhì)量濃度（100μg/L、300μg/L.500μg/L、1000pμg/L.2000pμg/L、4000μg/L、6000pμg/L）進(jìn)行定量作圖。DON標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度從100μg/L遞增到6000μg/L時(shí)，DON濃度和峰面積之間存在良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)0.999 5。線性方程Y=71.023X+9.483 9（Y表示峰高；x表示DON含量，μg/L）。免疫親和大體積進(jìn)樣的高效液相色譜法大大提高了檢測(cè)靈敏度，采用逐級(jí)稀釋法分析方法的檢出限，根據(jù)信噪比為3的峰響應(yīng)值，檢出限為25μg/kg，信噪比為10的峰響應(yīng)值為定量限，即60μg/kg。該方法完全可以滿足檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)小麥及其制品中DON的最大限量要求。

2.3方法的回收率實(shí)驗(yàn)

取全麥粉、小麥粉和干面筋樣品各1份空白樣品，分別做200μg/kg、600μg/kg、1500μg/kg3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度水平做8平行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1，回收率在74.7%～104.9%，RSD在6.4%～12.3%。

2.4樣品的檢測(cè)

隨機(jī)扦取14份小麥樣品，按照1.2操作制備相對(duì)應(yīng)的全麥粉、小麥粉和干面筋各14份，按照前處理1.3和儀器條件1.4檢測(cè)樣品，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2和圖4。

3結(jié)論

（1）采用大體積進(jìn)樣、免疫親和柱凈化的高效液相色譜法檢測(cè)小麥籽粒（全麥粉、小麥粉和干面筋）樣品中，嘔吐毒素方法的檢出限25μg/kg，定量限60μg/kg，回收率在74.7%～104.9%，RSD在64%～12.3%。該方法簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確可靠、靈敏度高、重現(xiàn)性好，是檢測(cè)小麥籽粒樣品中嘔吐毒素可靠有效的方法。

（2）試驗(yàn)結(jié)果顯示，受?chē)I吐毒素污染的小麥籽粒，不同部位污染程度有較大差異。嘔吐毒素在小麥中含量分布很不均勻。麩皮中最高，小麥粉其次，干面筋中未檢出嘔吐毒素。全麥粉中嘔吐毒素檢出含量在608.1μg/kg～3356.5μg/kg；小麥粉中嘔吐毒素檢出的含量普遍較低，在62.7μg/kg～346.4μg/kg，嘔吐毒素含量降低了88.4%～95.3%，且均未超過(guò)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)允許量（≤1000μg/kg）；小麥粉洗成干面筋后，未在干面筋中檢出嘔吐毒素。可見(jiàn)，全麥粉中嘔吐毒素的含量是小麥粉中嘔吐毒素的10倍，嘔吐毒素污染主要集中在小麥的麩皮層中。