龍須藤中兒茶素類化合物的含量測定研究

摘" " " 要：為建立一種同時(shí)測定龍須藤中表兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯含量的高效液相色譜法，采用的色譜柱為Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm， 5 m），流動(dòng)相為甲醇﹕水﹕甲酸 = 35﹕65﹕0.1，流速為0.7 mL·min-1，波長為280 nm。結(jié)果表明：表兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯分別在0.10～1.00 g和0.70～7.00 g內(nèi)線性關(guān)系良好，穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性數(shù)據(jù)RSD值均小于2%，平均加樣回收率分別為101.3%和101.0%。在6個(gè)批次龍須藤中，兩者含量分別為0.82～1.61 mg·g-1和3.32～9.97 mg·g-1。所建立的HPLC含量測定方法穩(wěn)定可靠，可以為龍須藤中表兒茶素沒食子酸酯等兒茶素類成分的分離純化提供指導(dǎo)。

關(guān)" 鍵" 詞：龍須藤；表兒茶素；表兒茶素沒食子酸酯；高效液相色譜

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A" " "文章編號(hào)： 1004-0935（2025）01-0186-03

以表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）和表兒茶素沒食子酸酯（ECG）等為代表的兒茶素類化合物，已被證明具有顯著的抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病等多種藥理活性。最新研究表明，EGCG已被列為治療宮頸肌瘤的候選藥物[1-3]。隨著越來越多的藥理活性被發(fā)現(xiàn)，該類成分在醫(yī)藥、保健食品、護(hù)膚品等領(lǐng)域的需求量也呈逐年上升之勢，引起了全球化學(xué)和藥學(xué)工作者的廣泛關(guān)注[4-5]。兒茶素類物質(zhì)均具有黃烷醇的結(jié)構(gòu)母核，其主要從茶葉、兒茶等天然植物中分離純化所得。由于茶葉中的兒茶素類成分較多，因此其純化過程較為繁瑣[6-7]，尋找新的兒茶素植物來源將有助于簡化其生產(chǎn)過程。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，龍須藤（Bauhinia championii Benth）的藤莖中具有含量較高的兒茶素類化合物，且成分種類較為集中，主要含表兒茶素（EC）和ECG，而EGCG等成分含量甚微。為了優(yōu)選龍須藤的藥材產(chǎn)地，也為了指導(dǎo)后續(xù)的兒茶素類成分的分離純化過程，本研究首次采用高效液相色譜技術(shù)，以期建立一種同時(shí)測定龍須藤中EC和ECG含量的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

EC和ECG標(biāo)準(zhǔn)品購自四川省維克奇生物科技有限公司（純度≥98%，批號(hào)130612、130624）。色譜甲醇和色譜甲酸購自阿拉丁有限公司。水為娃哈哈純凈水。6批龍須藤藥材信息見表1。

1.2 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司），DPS P-300H桌面型超聲波清洗機(jī)（蒂普思科技有限公司），AY220電子分析天平（島津儀器有限公司）。

1.3色譜條件

色譜柱采用Diamonsil C18反相柱（250 mm×4.6 mm，5 m，北京DIKMA公司）。流動(dòng)相采用甲醇﹕水﹕甲酸=35﹕65﹕0.1（V/V/V），柱溫35℃，流速為0.7 mL·min-1，測定波長為280 nm。

1.4對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制

分別精密稱定EC標(biāo)準(zhǔn)品7.0mg和ECG標(biāo)準(zhǔn)品14.0 mg，分別轉(zhuǎn)移至兩個(gè)不同的10 mL容量瓶，加80%甲醇溶液溶解并稀釋至容量瓶刻度線。得到EC和ECG的對(duì)照品儲(chǔ)存液（EC濃度為0.7 mg·mL-1，ECG濃度為1.4 mg·mL-1）。

1.5樣品溶液的配制

陰性溶液的配制：80%甲醇水溶液。

供試品溶液的配制：將龍須藤藥材粉碎后，過藥典3號(hào)篩，精密稱定0.5 g，轉(zhuǎn)移到錐形瓶中，加20 mL 80%甲醇水溶液浸泡1 h，并稱重記錄，超聲提取60 min（200W，30℃），冷卻后用80%甲醇補(bǔ)足重量，實(shí)驗(yàn)前用0.22 m微孔濾膜過濾。

1.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將對(duì)照品儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋，得到6組濃度梯度的混合對(duì)照品工作液，其中EC和ECG濃度分別為0.010～0.100 mg·mL-1和0.070～0.700 mg·mL-1。將上述混合對(duì)照品工作液依次進(jìn)樣10 L進(jìn)行色譜分析。以每針樣品中對(duì)照品的絕對(duì)量X（g）為橫軸，以峰面積Y為縱軸，繪制曲線并進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果表明兩成分在各自含量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，詳情見表2。

1.7檢出限和定量限的確定

將對(duì)照品儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋，以信噪比S/N=3和S/N=10分別計(jì)算EC和ECG的檢出限和定量限。結(jié)果顯示，兩成分的檢出限分別為0.11 ng和0.13 ng，定量限分別為0.35 ng和0.38 ng。

2 結(jié)果與討論

2.1專屬性

分別吸取陰性溶液、混合對(duì)照品溶液、龍須藤供試品溶液各10 L進(jìn)行HPLC分析。由圖1～圖3可知，陰性溶液對(duì)檢測無干擾，龍須藤樣品溶液中EC和ECG與其他色譜峰分離度均大于1.5，方法專屬性良好。

2.2精密度

取同一份混合對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)針6次，分別記錄每針EC和ECG的峰面積，由表3可知，兩種成分峰面積RSD均小于2%，儀器精密度較高。

2.3重復(fù)性

按照2.3龍須藤供試品溶液的配制方法，取同一批龍須藤藥材平行配制6份供試品溶液，進(jìn)樣10 L，測定其含量。由表4可知，EC和ECG的含量RSD均小于1.5%，說明方法重復(fù)性較好。

2.4穩(wěn)定性

取同一份龍須藤供試品溶液，陰涼處保存，于樣品制備后的第0、2、4、6、8、10、24時(shí)進(jìn)樣10 L，并記錄EC和ECG峰面積。由表5可知，EC和ECG峰面積RSD均小于2%，說明24 h內(nèi)樣品溶液能保持穩(wěn)定。

2.5加樣回收率

龍須藤藥材粉碎過3號(hào)篩，精密稱取6份過篩后的粉末0.5 g（EC和ECG含量分別為1.04 mg·g-1和4.74 mg·g-1），轉(zhuǎn)移到錐形瓶中，再加入同樣含量的EC和ECG對(duì)照品溶液，再按照2.3中配制成6份加標(biāo)溶液，分別進(jìn)樣10 L進(jìn)行含量檢測。由表6可知，兩種成分的回收率分別為101.3%和101.0%，說明方法準(zhǔn)確度較好。

2.7樣品含量測定

將收集到的6批龍須藤藥材，按照2.3中龍須藤供試品溶液的配制方法，配制成供試品溶液，分別進(jìn)樣10 L測定含量，結(jié)果見表7。

3 結(jié)論

含量測定結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的龍須藤中，兒茶素類物質(zhì)的含量差異較大，因?yàn)檫@是植物中的次生代謝產(chǎn)物的含量，受種質(zhì)、產(chǎn)地、氣候、土壤等多重因素的影響。就本研究所收集的樣品而言，貴州產(chǎn)地的龍須藤中ECG的含量最高，可達(dá)到總重量的1%左右，且其中所含的結(jié)構(gòu)相似的其他兒茶素類化合物種類較少，因此從貴州產(chǎn)龍須藤中分離純化ECG有望比從茶葉中分離更為簡便高效。下一步計(jì)劃開展貴州龍須藤中兒茶素的分離純化研究。

本研究建立了一種基于高效液相色譜技術(shù)的龍須藤中EC和ECG含量測定方法。方法學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，所建立的檢測方法具有較高的專屬性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度，可為后續(xù)龍須藤中ECG等兒茶素的純化分離提供指導(dǎo)。

參考文獻(xiàn)：

[1]沈海英，謝露，陳蒙華.兒茶素抑制腦缺血再灌注誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)，2024，36（2）：258-265.

[2]SORIFUL M I， PARISH M， BRENNAN J T， et al. Targeting fibrotic signaling pathways by EGCG as a therapeutic strategy for uterine fibroids[J]. Scientific Reports， 2023， 13（1）： 8492-8492.

[3]JING T， CAROLINE G， KIM Z， et al.Green tea catechins EGCG and ECG enhance the fitness and lifespan of Caenorhabditis elegans by complex I inhibition[J]. Aging， 2021， 13（19）：22629-22648.

[4]張文娟，劉雪娜，李麗維，等.茶多酚生理機(jī)制及其保健食品研發(fā)進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā)，2023，44（5）：217-224.

[5]MOHD F.Green tea catechins： nature’s way of preventing and treating cancer[J]. International Journal of Molecular Sciences，2022，23（18）：10713-10713.

[6]王兆豐.茶多酚純化及酯型兒茶素單體分離研究[D].蘭州：西北師范大學(xué)，2013.

[7]曹敏.大孔樹脂分離純化茶多酚中表沒食子兒茶素沒食子酸酯工藝優(yōu)化[J].中成藥，2023，45（11）：3736-3740.

Determination of Catechins in Bauhinia championii

Yang Hao， XIA Linbo， CHEN Xiaoxia， Deng Shiren

（College of Pharmacy， Liaoning University of Traditional Medicine， Dalian 116600， China）

Abstract： A method for simultaneous determination of epicatechin and epicatechin gallate in Bauhinia championii using HPLC. The chromatographic column was Diamonsil C18 column （250 mm × 5 mm， 5 m）， the mobile phase was methanol：water：formic acid = 35：65：0.1， the flow rate was 0.7 mL·min-1， the detection wavelength was 280 nm. Results： The linear ranges of epicatechin and epicatechin gallate were 0.10–1.00 and 0.70–7.00 g， The RSDs of precision， stability and repeatability test results were all lower than 2%， the average recoveries of epicatechin and epicatechin gallate were 101.3% and 101.0%， the contents of epicatechin and epicatechin gallate in the six batches of Bauhinia championii were 0.82–1.61 mg·g-1and 3.32–9.97 mg·g-1， respectively. The established HPLC method has high specificity， stability and precision， which can provide basis for the isolation of Bauhinia championii.

Keyword： Bauhinia championii; Epicatechin;Epicatechin gallate; HPLC