同型半胱氨酸硫內(nèi)酯-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑促進(jìn)HUVECs黏附

黃寧江，黃 海，姜 卓，黃仕芳，胡昊良

(1.永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)系， 湖南 永州 425000； 2.永州市第一人民醫(yī)院， 湖南 永州 425000；3.湖南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 湖南 長沙 410081)

同型半胱氨酸硫內(nèi)酯(homocysteine thiolactone,HTL)是致心、腦血管病危險(xiǎn)因素之一的高同型半胱氨酸血癥的主要病理學(xué)基礎(chǔ)[1-4]，其與冠狀動脈病變程度呈正相關(guān)[5]。本研究組曾報(bào)道[6-7]外源性HTL可致離體和在體大鼠血管內(nèi)皮舒張功能的損傷。

HTL可顯著增加人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)內(nèi)活性氧的含量，后者則影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊蛋白的能力，隨之引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[4]。ERS在內(nèi)皮細(xì)胞紊亂中起主導(dǎo)作用[8]，由此推測HTL可能引起內(nèi)皮細(xì)胞的ERS，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞紊亂。

人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)的預(yù)處理后，其黏附因子表達(dá)隨Hcy的濃度增加而上調(diào)[9]。HTL是Hcy的主要衍生物，可能是促內(nèi)皮細(xì)胞黏附的主要因素。內(nèi)皮細(xì)胞黏附是致內(nèi)皮細(xì)胞紊亂及損傷的關(guān)鍵因素，由此推測HTL可能通過ERS致內(nèi)皮細(xì)胞黏附。

1 材料與方法

1.1 材料

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫)；普通級SD雄性大鼠體質(zhì)量(180±20)g (湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動物房); NF-κB激活-核轉(zhuǎn)運(yùn)檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)；同型半胱氨酸硫內(nèi)酯、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抑制劑(salubrinal)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激動劑(tunicamycin) (Sigma-Aldrich公司); Chop和Bip(Cell Signaling Technology公司);VCAM-1、ICAM-1和GAPDH抗體(Santa-Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):用加入終濃度為1%的青霉素-鏈霉素、含10% 胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVECs，1～2 d換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞增殖到80%～90%匯合時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)處理。

1.2.2 Western blot檢測蛋白:提取各組蛋白，將每組等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，分別用Chop、Bip、VCAM-1、ICAM-1和β-actin抗體孵育，4 ℃過夜。TBST洗膜，之后二抗孵育1 h，TBST洗膜，顯影和定影。

1.2.3 在體實(shí)驗(yàn):將大鼠隨機(jī)分為對照組和HTL損傷組，每組6只，將HTL溶解于0.9%氯化鈉溶液中，每天灌胃1次(50 mg/kg)。持續(xù)8周后，放血處死動物，取大鼠胸主動脈檢測NF-κB p65的表達(dá)。

1.2.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn):取5組長勢較好的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，分別用不同濃度的HTL(0、0.001、0.01、0.1和1 μmol/L)處理細(xì)胞24 h。待24 h后提取蛋白，通過Western blot技術(shù)觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記蛋白Bip、Chop及黏附因子標(biāo)記蛋白VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)。

取5組長勢均勻的HUVECs，用HTL(0.1 μmol/L)分別處理不同時(shí)間(0、3、6、12和24 h)。提取蛋白， Western blot技術(shù)檢測HTL不同時(shí)間處理對HUVECs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白Bip、Chop及黏附因子標(biāo)記蛋白VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)影響。

取6組長勢均勻的HUVECs分成對照組、HTL(0.1 μmol/L)組、HTL(0.1μmol/L)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑salubrinal(0.1 μmol/L)組、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑salubrinal組(0.1 μmol/L)、HTL與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激動劑tunicamycin組(0.1 μmol/L)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激動劑tunicamycin(0.1 μmol/L)組，同時(shí)處理24 h。提取蛋白，通過Western blot技術(shù)，分別檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激動劑與抑制劑對HTL誘導(dǎo)的黏附因子表達(dá)的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HTL對血管內(nèi)皮細(xì)胞NF-κв P65表達(dá)的影響

與正常組相比，HTL組大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞紅色熒光顯著增強(qiáng)，表明HTL可以增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB p65的表達(dá)(圖1)。

2.2 HTL呈劑量依賴性促HUVECs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

HTL呈劑量依賴性促內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記蛋白Bip和Chop蛋白的表達(dá)(P<0.05)(圖2)。

2.3 HTL呈時(shí)間依賴性促HUVECs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白表達(dá)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記蛋白Bip和Chop的表達(dá)隨HTL處理時(shí)間的增加而增加(P<0.05)(圖3)。

2.4 HTL呈劑量依賴性促HUVECs黏附因子的表達(dá)

HTL呈劑量依賴性促HUVECs黏附因子VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)(P<0.05)(圖4)。

2.5 HTL呈時(shí)間依賴性增加HUVECs中黏附因子的表達(dá)

黏附因子標(biāo)記蛋白VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)隨HTL處理時(shí)間的增加而增加(P<0.05)(圖5)。

2.6 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激動劑與抑制劑對HTL誘導(dǎo)的HUVECs中黏附因子表達(dá)的影響

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激動劑與抑制劑分別促進(jìn)與抑制HTL誘導(dǎo)的黏附因子的表達(dá)(P<0.05)(圖6A)。 “STRING”預(yù)測出Bip(HSPA5)和Chop(DDIT3)與黏附因子VCAM-1和ICAM-1的相互作用(圖6B)。

圖1 免疫熒光檢測HTL對大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group圖2 不同濃度的HTL對Bip和Chop蛋白表達(dá)的影響Fig 2 Effect on Bip and Chop proteins expression by different concentrations of n=3)

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group圖3 HTL呈時(shí)間依賴性促HUVECs中Bip和Chop蛋白的表達(dá)Fig 3 HTL promoted the expression of Bip and Chop proteins in a time dependent manner n=3)

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group圖4 不同濃度的HTL對VCAM-1和ICAM-1蛋白表達(dá)的影響Fig 4 Effect on VCAM-1 and ICAM-1 proteins expression by different concentrations of HTL n=3)

3 討論

本課題組前期研究證實(shí)同型半胱氨酸硫內(nèi)酯(HTL)可損傷血管內(nèi)皮功能，導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂[10]。非正常的未折疊蛋白反應(yīng)被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，通常在氧化應(yīng)激及內(nèi)皮功能紊亂時(shí)發(fā)生[11-12]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HTL可促進(jìn)HUVECs中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記蛋白Bip和Chop的表達(dá)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可誘導(dǎo)血管細(xì)胞黏附因子1(VCAM-1)及細(xì)胞間黏附因子1(ICAM-1)的mRNA表達(dá)，最終導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂[13]。本結(jié)果顯示，HTL可呈時(shí)間及劑量依賴性促HUVECs黏附因子VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)。同時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激動劑可上調(diào)HTL對黏附因子的表達(dá)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑可抑制HTL對黏附因子的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)利用蛋白相互作用預(yù)測工具“STRING”，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn) Bip(HSPA5)、Chop(DDIT3)與黏附因子VCAM-1、ICAM-1具有相互作用，表明HTL可能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑促HUVECs黏附。

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group圖5 HTL呈時(shí)間依賴性促VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)Fig 5 HTL promoted VCAM-1 and ICAM-1 proteins expression in a time dependent manner n=3)

A.effects of endoplasmic reticulum stress agonists and inhibitors on the expression of HTL induced adhesion; B.interactions between endoplasmic reticulum stress proteins (Bip, Chop) and abhesion molecules (VCAM-1, ICAM-1) predicted by “STRING”;*P<0.05,**P<0.01 compared with control group;#P<0.05 compared with HTL

圖6HTL可能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑促HUVECs中的黏附因子表達(dá)

內(nèi)皮黏附是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的關(guān)鍵因素[14-15]，HTL致內(nèi)皮損傷從而促動脈粥樣硬化的關(guān)鍵因素可能與其促內(nèi)皮黏附因子的表達(dá)有關(guān)。其次，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是HTL促HUVECs中黏附因子表達(dá)增加的關(guān)鍵因素，因此，HTL可能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑促HUVECs黏附，從而致內(nèi)皮功能紊亂引起動脈粥樣硬化。