內皮間質轉化參與阿霉素誘導的大鼠心肌纖維化

鄧飛艷，謝路遠，詹世斌，劉志燕，薛 蕾，高妮娜，盛小伍*

(1.湖南省腫瘤醫(yī)院/中南大學湘雅醫(yī)學院附屬腫瘤醫(yī)院 中心實驗室，湖南 長沙 410000； 2.南華大學， 湖南 衡陽 421001)

阿霉素(doxorubicin，Dox)是使用最廣泛的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，療效顯著，但因具有嚴重心臟毒性，臨床應用受限[1-2]。阿霉素與心肌組織親和力較高，引起心肌細胞內氧自由基產(chǎn)生增多、清除減少及腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF-α)等炎性因子的產(chǎn)生增多[1]，導致心肌細胞凋亡和壞死[2-4]，最終心肌細胞被纖維組織取代[5]，形成以肌成纖維細胞增多為特點的心肌纖維化[6]。最近研究表明內皮間質轉化(endothelial mesenchymal transition，EMT)是肌成纖維細胞的重要來源[7-8]。轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)是重要的促纖維化因子，在纖維化疾病中產(chǎn)生增加，可誘導EMT生成肌成纖維細胞[6-9]。目前阿霉素心肌纖維化機制仍未闡明。本實驗旨在研究EMT在阿霉素心肌纖維化形成中的作用，為阿霉素心臟病的防治提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級SD大鼠，雌雄各24只，質量(220±20)g(湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，質量合格證編號:43004700030496)。

1.1.2 主要試劑：注射用鹽酸多柔比星(深圳萬樂藥業(yè)有限公司)；Masson試劑盒(BASO公司)；HE染色試劑盒(北京索萊寶生物科技公司)；α-SMA抗體和vWF抗體(Abcam公司)；Trizol、反轉錄試劑盒和real-time PCR試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組及處理：將大鼠隨機分成對照組和阿霉素1、2、6周3組(DOX-1、2和6周)，每組12只，雌雄各半。實驗前適應飼養(yǎng)1周，觀察大鼠的活動、進食及大小便情況，確保大鼠健康狀態(tài)良好。對照組(每周腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1 mL/kg，每周1次，連續(xù)6周)。阿霉素組(每周腹腔注射阿霉素2 mg/kg[10]，每周1次，連續(xù)6周)。分別于1、2和6周處死大鼠，檢測心肌纖維化相關指標及心肌組織血管內皮間質轉化指標。

1.2.2 HE染色和Masson三色染色檢測心肌組織病理形態(tài)學改變：按說明書操作。

1.2.3 RT-qPCR檢測纖維化相關基因Col1α、Col3α、TGF-β1 mRNA表達：應用NCBI Primer-Blast設計引物。提取大鼠心肌組織RNA，并測定其含量。反轉錄試劑盒合成cDNA。以GAPDH作為內參，檢測纖維化相關基因Col1α、Col3α和TGF-β1 mRNA的表達水平。引物序列(表1)。

1.2.4 免疫組織化學法檢測心肌組織TGF-β1表達：采用EnVision兩步法對心肌組織進行免疫組織化學染色。以4%中性甲醛液固定心肌組織，石蠟包埋，4 μm厚度切片。以TGF-β1抗體作為一抗，滴加一抗后室溫孵育1 h，之后用EnVision兩步法試劑盒室溫孵育40 min，最后用DAB顯色劑顯色5 min，蘇木素復染細胞核，脫水、透明、封片。

1.2.5 免疫熒光染色檢測心肌組織EMT現(xiàn)象：所有心肌組織均以4%中性甲醛液固定，石蠟包埋，4 μm厚度切片。免疫熒光雙染，同時孵兩種一抗(兔抗vWF、鼠抗α-SMA)，4 ℃過夜后沖洗3遍。隨后37 ℃孵育兩種二抗(羊抗兔 Alexa、羊抗鼠Alexa)，DAPI復染細胞核，封片熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 大鼠一般情況

腹腔注射阿霉素后，約1/3的大鼠因急性心律失常死亡。所有大鼠出現(xiàn)毛發(fā)稀少，腹部膨隆，精神不好,活動差。1和2周組大鼠心包積液,6周組大鼠心包積液、腹腔積液明顯。

表1 實時定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences of real-time PCR

2.2 阿霉素對心肌形態(tài)學的影響

阿霉素6周組大鼠心腔明顯擴大、心室壁變薄(圖1A)。心肌纖維排列紊亂，心肌間隙明顯增寬，心肌纖維溶解和壞死(圖1B紅色箭頭所示)，心肌細胞間隙有中性粒細胞及單核、淋巴細胞浸潤(圖1B黃色箭頭所示)，血管周圍有大量纖維組織圍繞(圖1B藍色箭頭所示)。

A.HE staining for doxorubicin induced cardiac fibrosis under naked eyes; B.HE staining for doxorubicin induced cardiac fibrosis under microscope

圖1阿霉素誘導心肌纖維化形態(tài)
Fig1Morphologyofdoxorubicin-inducedmyocardialfibrosis

2.3 阿霉素對心肌間質及血管周圍膠原面積的影響

阿霉素1、2、6周組血管周圍和心肌間質中膠原纖維組織增多，血管內皮排列不規(guī)則，血管內紅細胞減少(圖2A)。阿霉素1周組大鼠心肌間質及血管周圍膠原面積高于對照組(P<0.05)，阿霉素2和6周組大鼠心肌間質及血管周圍膠原面積顯著高于對照組(P<0.01)(圖2B)。

2.4 阿霉素對心肌Col1α、Col3α和TGF-β1 mRNA表達的影響

細胞外基質的過量產(chǎn)生和沉積是心肌纖維化的主要特點。纖維化組織中膠原纖維的主要成分為I型膠原和III型膠原。阿霉素2和6周組大鼠心肌組織Col1αmRNA的表達高于對照組(P<0.05)(圖3A)。阿霉素2和6周組大鼠心肌組織Col3αmRNA的表達高于對照組(P<0.05)(圖3B)。阿霉素6周組大鼠心肌組織TGF-β1 mRNA的表達高于對照組(P<0.05)(圖4A)。

2.5 阿霉素對心肌TGF-β1蛋白表達的影響

TGF-β1陽性表達呈棕黃色顆粒狀，位于細胞質中。對照組大鼠心肌組織TGF-β1表達很少(圖4B，阿霉素1周組表達較少(圖4C)，阿霉素2周組表達較多(圖4D)，阿霉素6周組表達明顯增多(圖4E)。

2.6 阿霉素對心肌EMT的影響

對照組心肌組織中未見vWF和α-SMA共染的現(xiàn)象，阿霉素1、2和6周組心肌組織中可見明顯vWF和α-SMA共染的現(xiàn)象(圖5)。

3 討論

阿霉素心臟毒性以不可逆轉的心肌病和充血性心力衰竭為主， 其心肌病理改變復雜。既往研究表明阿霉素介導的心臟病患者以擴張型心肌病為主，而青少年阿霉素毒性患者常伴有限制型心肌病[11]。本研究發(fā)現(xiàn)成年SD大鼠腹腔注射阿霉素后心臟出現(xiàn)心室腔明顯擴大、心室壁變薄等擴張型心肌病的表現(xiàn)。隨著阿霉素劑量的累積，心肌纖維化面積增加，而心肌纖維化可以導致心臟變硬，心力衰竭患者常伴有心肌纖維化，提示改善心肌纖維化有益于阿霉素心臟病的治療。在阿霉素心肌纖維化模型中發(fā)現(xiàn)，心肌血管周圍圍繞大量纖維組織，并且血管內皮細胞損傷，血管通透性增加。血管內皮轉化可能參與阿霉素心肌纖維化形成的機制。在纖維化疾病中，靜息狀態(tài)的成纖維細胞激活和增殖被認為是成肌纖維細胞的主要來源。EMT自從被提出也是成肌纖維細胞的來源之后，一系列的動物模型和人體纖維化疾病研究表明EMT參與心臟、肺、腎臟和放射性纖維化疾病的形成[6,12-13]。

A.Masson trichrome staining for fibrosis collagen in cardiac cross sectional parts; B.the ratio of fibrotic area to cardiac gross area of each Masson trichrome staing image in each group;*P<0.05,**P<0.01 compared with control group

A.Col1α mRNA expression level; B.Col3α mRNA expression level; *P<0.05 compared with control group圖3 阿霉素誘導心肌纖維化相關基因的表達Fig 3 Doxorubicin-induced cardiac fibrosis-related gene

A.TGF-β1 mRNA expression level；B.TGF-β1 protein expression level in control group；C.TGF-β1 protein expression level in Dox-1 week group；D.TGF-β1 protein expression level in Dox-2 weeks group；E.TGF-β1 protein expression level in Dox-6 weeks group;*P<0.05 compared with control group

Immunostaining of cardiac tissue in control and doxorubicin 1,2 and 6 weeks groups, red part indicated vWF staining positive, green part indicated α-SMA staining positive; the green arrow showed yellow part which means vWF and α-SMA coexpression and positive

圖5阿霉素誘導了心肌纖維化中EMT的形成
Fig5DoxorubicininducedtheformationofEMTinmyocardialfibrosis(×100,×400)

本研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射阿霉素后，許多血管內皮細胞表達內皮細胞標志vWF的同時也表達間質標志α-SMA，而對照組大鼠心肌血管內皮細胞未出現(xiàn)此現(xiàn)象。血管內皮細胞同時表達vWF和α-SMA說明血管內皮細胞正在向間質細胞轉化。本研究證實血管內皮通過EMT參與阿霉素心肌纖維化的形成，抑制內皮間質轉化可能成為阿霉素心臟病的治療靶點。

綜上所述，阿霉素可誘導大鼠不可逆的心肌纖維化，內皮間質轉化可能參與阿霉素所致的心肌纖維化的形成。