橄欖苦苷對體外卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的影響

謝樹紅，黃惠娟，許玉黎，鄭小花，楊 帆

0 引 言

卵巢癌是女性癌癥死亡的第四大原因，其中卵巢上皮性癌占卵巢惡性腫瘤的90%以上，5年生存率受分期影響波動于27%～46%[1-3]。卵巢癌的基本治療原則為廣泛腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)輔以順鉑聯(lián)合紫杉醇的化療方案，但易發(fā)生化療耐藥及癌灶復(fù)發(fā)，據(jù)統(tǒng)計(jì)90%的晚期卵巢癌患者死亡原因與多藥耐藥的發(fā)展有關(guān)[4]。因此，目前對于卵巢癌的治療迫切需要尋找一種既有效且不良反應(yīng)小的新型藥，對提升卵巢癌患者的生活質(zhì)量、生存率等具有重要意義。多方研究表明，富含于天然橄欖油或橄欖葉中的橄欖苦苷在對抗子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等腫瘤中已顯示出積極的抑癌作用。本研究欲通過體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究橄欖苦苷對卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖是否同樣有影響以及不同濃度的橄欖苦苷在不同作用時間下細(xì)胞改變情況。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株、藥物及試劑實(shí)驗(yàn)用卵巢癌SKOV3細(xì)胞由福州總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)科提供。橄欖苦苷(Funakoshi，Tokyo Japan )，McCoys 5A培養(yǎng)基(美國sigma公司)、胎牛血清(美國gibco公司)、青霉素鏈霉素雙抗溶液(美國gibco公司)、0.25%胰蛋白酶(美國gibco公司)、PBS緩沖液(美國Hyclone公司)、cck-8試劑盒(美國genview公司)，DMSO溶液(二甲基亞砜，南京凱基生物公司)，25 cm2培養(yǎng)瓶、15 mL離心管、50 mL離心管(美國corning公司)

1.2方法①細(xì)胞培養(yǎng)：用含10%胎牛血清、1%雙抗溶液配制的McCoys 5A完全培養(yǎng)基將SKOV3卵巢癌細(xì)胞接種到25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱中。待電子顯微鏡下觀察細(xì)胞生長至80%～90%匯合度時，用0.25%胰酶消化傳代，平均3 d傳代1次。②細(xì)胞接種：SKOV3細(xì)胞生長至80%～90%匯合度后，用0.25%胰酶消化成單個細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)后重新調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104個/mL，以細(xì)胞數(shù)5000個/孔接種至96孔板，即每孔100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液，每組6個平行樣本，設(shè)置5個細(xì)胞組，包括4個不同濃度藥物組(藥物+培養(yǎng)液+細(xì)胞)和1個對照組(培養(yǎng)液+細(xì)胞)。設(shè)1個空白組[僅含培養(yǎng)液，用于校正培養(yǎng)液對吸光度(A)的影響]，周邊空白格以PBS緩沖液等體積填充。③CCK-8法檢測細(xì)胞增殖變化：接種在96孔板的細(xì)胞貼壁后,每孔加入10 μL不同濃度的橄欖苦苷(800、400、200、100、0 μg/mL)，其中橄欖苦苷粉末用DMSO有機(jī)溶劑溶解，用McCoy’s 5A培養(yǎng)基稀釋到需要濃度，并確保DMSO終濃度<0.1%以避免對細(xì)胞的損害作用。分別培養(yǎng)細(xì)胞至24、48、72 h(觀察時間的選擇基于SKOV3細(xì)胞傳代時間在48～72 h)。在相應(yīng)時間后以換液形式加入含10%CCK-8的培養(yǎng)基，置于37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)60 min后用酶標(biāo)儀在450 nm測定細(xì)胞A值。④根據(jù)細(xì)胞不同生長時間A值繪制細(xì)胞生長曲線圖，并以柱狀圖比較不同濃度下藥物抑制率隨時間的變化。其中細(xì)胞抑制率的計(jì)算公式如下：

抑制率(%)=[1-(藥物組-空白組)/(對照組-空白組)] ×100%

2 結(jié) 果

2.1不同濃度橄欖苦苷與作用時間下SKOV3細(xì)胞生長A值比較相同作用時間下，各藥物濃度組與對照組相比，細(xì)胞生長受到抑制，A值隨著藥物濃度增大而變小，與對照組A值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；相同作用濃度下，100、200、400 μg/mL的細(xì)胞可隨著作用時間延長A值增大，3個時間A值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在藥物濃度800 μg/mL時，細(xì)胞生長明顯受到抑制，在24 h和48 h內(nèi)A值未發(fā)生明顯變化(P>0.05)，當(dāng)作用時間達(dá)72 h時，A值與24、48 h比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞生長曲線逐漸降低趨向水平。見表1、圖1。

組別A值24h48h72h空白組0.61±0.010.58±0.020.57±0.02對照組0.89±0.021.47±0.062.02±0.03藥物組 100μg/mL藥物組0.87±0.01*1.40±0.04*#1.94±0.02*#△ 200μg/mL藥物組0.83±0.02*1.27±0.06*#1.77±0.10*#△ 400μg/mL藥物組0.78±0.02*1.03±0.07*#1.39±0.05*#△ 800μg/mL藥物組0.64±0.02*0.64±0.02*0.70±0.03*#△與對照組相比,*P<0.05;同一濃度下,與24h比較,#P<0.05;與48h比較,△P<0.05

圖1 不同濃度橄欖苦苷與作用時間下的SKOV3細(xì)胞生長曲線

2.2不同濃度橄欖苦苷與作用時間下SKOV3細(xì)胞抑制率比較在相同作用時間下，細(xì)胞生長抑制率隨著藥物濃度增大而增大，組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在相同濃度下，藥物的抑制率并未隨著作用時間的延長發(fā)生顯著差異，不同時間抑制率兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在100、200、400、800 μg/mL的濃度梯度下，細(xì)胞抑制率逐漸增大，但抑制率未隨作用延長發(fā)生顯著改變。見表2。

組別細(xì)胞抑制率24h48h72h100μg/mL藥物組6.46±10.517.62±7.645.39±3.11200μg/mL藥物組21.34±8.97*22.02±9.01*17.24±7.48*400μg/mL藥物組41.05±5.32*#49.10±9.82*#43.20±4.71*#800μg/mL藥物組88.44±6.64*#△92.80±3.60*#△90.72±2.83*#△與100μg/mL藥物組比較,*P<0.05;與200μg/mL藥物組比較,#P<0.05;與400μg/mL藥物組比較,△P<0.05

3 討 論

橄欖苦苷是富含于天然橄欖油或橄欖葉中的一種重要的苯酚類咧環(huán)烯醚萜苷，更是廣泛存在于木犀科的木樨欖屬、丁香屬、女貞屬、木犀屬和茉莉?qū)僦参镏衃5]。目前已證明橄欖苦苷對心、腦、肝、腎、皮膚、骨骼等均具有保護(hù)作用，既不對正常組織細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用又可用于降血壓、降血糖、抗腫瘤、治療阿爾茨海默癥及預(yù)防骨質(zhì)疏松癥等[5-8]。本次體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)橄欖苦苷可抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的的增殖，0～800 μg/mL時隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞生長曲線逐漸降低趨向水平，在100、200、400、800 μg/mL的濃度梯度下，細(xì)胞抑制率逐漸增大，但抑制率未隨作用延長發(fā)生顯著改變。當(dāng)藥物濃度達(dá)800 μg/mL時，48 h內(nèi)細(xì)胞幾乎停止增殖狀態(tài)不佳。SKOV3細(xì)胞的正常傳代周期為48～72 h，當(dāng)培養(yǎng)條件極佳時，甚至可24 h增殖至生長高峰傳代。我們推測當(dāng)濃度達(dá)800 μg/mL時細(xì)胞生長環(huán)境可能出現(xiàn)完全不適合SKOV3細(xì)胞的生長。由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們推測，橄欖苦苷對SKOV3細(xì)胞的增殖有抑制作用，抑制強(qiáng)度在0～800 μg/mL條件下呈現(xiàn)出濃度依賴性，而抑制強(qiáng)度可能無時間依賴性。對橄欖苦苷作用時間的分析有2點(diǎn)：一是該藥物可能確實(shí)不具備時間依賴性；二是藥物反應(yīng)迅速，可能在測的第一個時間點(diǎn)24 h前就已逐步達(dá)到最大作用效應(yīng)。這一結(jié)果的出現(xiàn)給未來橄欖苦苷運(yùn)用臨床治療卵巢癌患者時，可能不需要考慮藥物反應(yīng)時間即可維持穩(wěn)定的作用強(qiáng)度。

對該實(shí)驗(yàn)的具體作用機(jī)制提出以下2種設(shè)想：橄欖苦苷與雌二醇(E2)具有相同的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，這種相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致橄欖苦苷可有微弱的植物雌激素作用或可競爭性結(jié)合雌激素受體起拮抗作用。有研究稱植物雌激素可以改變基因的表達(dá)，使抑癌基因和促癌基因的表達(dá)發(fā)生改變，從而表現(xiàn)出預(yù)防腫瘤和抑制腫瘤生長的作用[9]，如橄欖苦苷可同時通過延緩乳腺癌細(xì)胞周期S期(在細(xì)胞生長分裂時延緩細(xì)胞DNA的合成)、上調(diào)細(xì)胞周期蛋依賴白性抑制劑p21、抑制抗凋亡和促增殖的NF-KB蛋白及抑制主要致癌的靶細(xì)胞周期蛋白D1共同對細(xì)胞增殖起到強(qiáng)烈的抑制作用[10]。其次研究證明橄欖苦苷通過抑制與乳腺癌腫瘤細(xì)胞失控相關(guān)的雌激素依賴的ERK1/2 快速信號的激活[11]，從而在乳腺癌細(xì)胞增殖中起到化學(xué)預(yù)防抑制作用。通過對本實(shí)驗(yàn)SKOV3細(xì)胞生長曲線觀察，我們推測卵巢癌與乳腺癌同為激素依賴性腫瘤，橄欖苦苷可能通過延緩SKOV3細(xì)胞DNA的合成等以上作用途徑使細(xì)胞的生長周期延長從而表現(xiàn)出增殖抑制效果。

橄欖苦苷水解后生成游離的羥基酪醇(hydroxytyrosol，HT)[12]，實(shí)驗(yàn)表明HT可通過調(diào)節(jié)親癌和抑癌信號通路阻滯腫瘤細(xì)胞的循環(huán)及誘發(fā)其凋亡[13-15]，包括乳腺癌MCF-7細(xì)胞[16]、HL60白血病細(xì)胞[17]、黑色素瘤細(xì)胞[18]、結(jié)腸癌細(xì)胞[17，19-20]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌細(xì)胞中HT通過縮短表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的半衰期來加速EGFR的降解，而EGFR在細(xì)胞中表達(dá)下降可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[21]。卵巢癌細(xì)胞中存在多種原癌基因和抑癌基因，并且有60%以上的卵巢上皮性癌存在EGFR的過度表達(dá)[22]。因此我們推測，橄欖苦苷對卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用也可能是通過水解后生成HT，通過HT對細(xì)胞中原癌基因或抑癌基因的調(diào)節(jié)如下調(diào)EGFR從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。以上兩種機(jī)制推斷均有待于下一步實(shí)驗(yàn)研究證明。

綜上，橄欖苦苷作為抗腫瘤藥物具有廣闊的前景，特別是針對婦科惡性腫瘤術(shù)后的患者，橄欖苦苷在未來臨床的運(yùn)用不僅能抗腫瘤，還可預(yù)防因手術(shù)造成的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松[23]，在婦科方向具有絕對的優(yōu)勢。