PI3K/Akt/mTOR信號通路在大鼠急性骨骼肌鈍挫傷修復中的作用

張安寧 羅雪林 黃思琴 唐成林 趙丹丹羅翱 譚程方 代妮 于芒

1重慶醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院（重慶400016）

2重慶市南岸區(qū)龍門浩街道社區(qū)衛(wèi)生服務中心（重慶 400064）

3斯坦福大學臨床科學研究中心（美國加州 94305）

骨骼肌損傷是運動醫(yī)學領域的常見損傷之一，其中急性骨骼肌鈍挫傷較為常見[1]，以股四頭肌和腓腸肌的發(fā)病率最高[2]，骨骼肌正常生理結構的破壞和運動功能障礙是其主要的預后及演變。骨骼肌損傷后，肌肉組織的修復和再生能力與諸多因素有關，如：生長發(fā)育的信號通路、調控基因、生長因子及細胞因子的活性改變等[3-4]，以往關于骨骼肌鈍挫傷模型的研究多集中在與骨骼肌損傷修復相關的生長因子及細胞因子等的時程變化趨勢上[5-8]，而關于磷酸肌醇三激酶（phos?phoinositide3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B （protein ki?nase B，Akt/PKB）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammali?an target of rapamycin，mTOR）生長發(fā)育信號通路在骨骼肌損傷修復中的作用及機制研究的相關報道較少。本研究觀察PI3K/Akt/mTOR蛋白合成途徑在大鼠急性骨骼肌鈍挫傷修復中的表達變化，及其對骨骼肌成肌分化抗原（myogenic differentiation antigen，MyoD）和肌細胞生成素（myogenin，MyoG）的調控作用，探索骨骼肌損傷的修復機制，以幫助臨床醫(yī)生及科研學者尋找最佳的治療靶點和時間點，縮短療程，從而減輕患者的痛苦及經濟負擔。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物和分組

SPF（specific pathogen free）級健康成年雄性 SD（Sprague Dawley）大鼠36只，8～9周齡，體質量220～250 g，購于重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK（渝）2012-0001，實驗過程中對動物的處置方法按照國家科學技術部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》中的倫理標準實施[9]。分籠飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學SPF級動物房，每籠5只，室溫22±2℃，相對濕度為55% ±5%，12 h晝夜交替，自由飲食。先將大鼠適應性喂養(yǎng)5 d，再按照方積乾《衛(wèi)生統(tǒng)計學》（2012年，人民衛(wèi)生出版社）[10]中隨機數(shù)字表法分為正常組對照組和損傷后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d組，每組6只。

1.1.2 主要試劑及儀器

PI3K（p85）一抗（北京博奧森生物技術有限公司），Akt一抗、P-AktSer473一抗、mTOR一抗、P-mTORS?er2448一抗（美國，Cell Signaling），免疫印跡相關試劑（上海碧云天生物技術有限公司），mmobilonTMWest?ern Chemiluminescent HRP Substrate發(fā)光液（美國，MILLIPORE公司），Trizol總RNA提取液、RR037A逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ、引物合成（日本，TAKARA公司）。電泳儀及電轉儀（美國，BIO RAD公司，041BR121545），凝膠圖像掃描及分析系統(tǒng)（北京賽智科技公司），AL204型電子天平（瑞士，METTLER TOLEDO公司），低溫高速離心機（日本，SIGMA 公司），ThermoND2000超微量核酸蛋白測定儀（上海，GENE公司），T100? PCR儀和CFX ConnectTM熒光定量PCR檢測系統(tǒng)（美國，BIO RAD 公司），拍攝裝置（日本，OLYMPUS公司，DP73），自制鈍挫傷模型重物打擊裝置。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模方法

參考Markert[11]的方法，自行設計鈍挫傷模型重物打擊裝置。打擊參數(shù)：重物220 g，自由下落高度為110 cm，重力為2.16 N，打擊頭面積約為1 cm2，打擊動能為2.37 J。先用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，備皮，俯臥位，將右后肢伸膝，踝背屈90°，稍外展位固定，將造模器打擊頭緊貼腓腸肌肌腹中央偏外側處，助手將實心鋼球自由下落擊中腓腸肌中段，紅色記號筆標記損傷中心部位（每天加強標記）。造模成功后無皮膚破損和脛腓骨骨折，損傷處先可見局部凹陷，隨后淤腫明顯，且均在腓腸肌的中段。

1.2.2 取材方法

各組在相應時間點分別隨機抓取6只大鼠，先用10%水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠，右腿保持造模時的姿勢，在損傷處的上方做新標記（以便準確取到損傷組織），沿著新標記下方，用鋒利的一次性刀片迅速取出損傷處腓腸肌組織，0.9%氯化鈉溶液沖洗。各組的3只大鼠損傷處腓腸肌組織迅速置于液氮罐中1 h后移入-80℃冰箱儲存，進行免疫印跡（Western blot，WB）及逆轉錄實時定量聚合酶鏈反應（ reverse transcription real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測；余下的3只大鼠損傷處腓腸肌組織放入4%多聚甲醛中固定48～72 h，石蠟包埋切片，行HE染色。

1.2.3 HE染色方法

腓腸肌組織經4%多聚甲醛固定后，常規(guī)乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，橫切4 μm；二甲苯脫蠟后水化，蘇木精染色，鹽酸酒精分化，伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以上過程均由重慶醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院組織切片室完成。在400倍光學顯微鏡下觀察組織形態(tài)結構變化并采集圖片。

1.2.4 免疫印跡法

分別取各個標本約30～50 mg，剪碎，加入適量蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑后勻漿，配平、4 ℃、12000 r/min、離心15 min，取上清液，得到總蛋白；蛋白定量，取上清液配平后95℃煮沸10 min，使蛋白變性；用BIO RAD標準電泳裝置SDS-PAGE電泳，轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜后分別放入PI3K（p85）（1︰500）、Akt（1︰1000）、P-AktSer473（1︰1000）、mTOR（1︰1000）、P-mTORSer244（1︰1000）和GAPDH（1︰5000）一抗稀釋液中孵育，4℃搖床，過夜；TBST洗膜，加入5%脫脂奶粉稀釋的二抗中，搖床，室溫反應1 h；TBST洗膜，加入發(fā)光液顯色，凝膠成像系統(tǒng)成像。Image J對圖像進行定量分析，以GAPDH作為內參。用目的條帶光密度值與內參條帶光密度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.2.5 逆轉錄實時定量聚合酶鏈反應

分別取各個標本約50 mg，剪碎，加Trizol 1 ml充分勻漿后提取總RNA；檢測總RNA濃度及純度后按逆轉錄試劑盒操作步驟配制10 μl反應體系，置于T100?PCR儀中進行逆轉錄反應；按照SYBR Green法配制Mix及反應體系后上機進行RT-PCR反應；通過CFX manager 3.1軟件讀取Ct值。以 Folds=2-ΔΔCt表示其余5組與正常對照組中目的基因表達的倍比關系，公式：ΔΔCt=［C（ttarget gene）-Ct（GAPDH）］損傷后1d/3d/5d/7d/14d組-［Ct（target gene）-Ct（GAPDH）］正常對照組，計算平均值。上下游引物序列見表1。

表1 待測基因引物序列

1.2.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0軟件對各組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，各組數(shù)據(jù)結果用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD檢驗進行顯著性分析，P＜0.05表明差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HE染色

由圖1可見：正常對照組腓腸肌肌纖維橫切面呈多邊形，大小一致，排列整齊，分布均勻，胞漿嗜酸性（紅色），細胞核嗜堿性（藍色），分布于肌細胞邊緣（圖1A）；損傷后1 d可見肌細胞變性壞死及明顯的炎性細胞浸潤（圖1B）；損傷后3 d可見新生的成肌細胞和肌管（圖1C）；損傷后5 d可見單核和多核肌管以及大量纖維結締組織的形成（圖1D）；損傷后7 d和14 d可見新生肌細胞，間質中大量膠原纖維形成（圖1E，F(xiàn)）。

圖1 各組大鼠腓腸肌HE染色結果（×400，標尺=50μm）

2.2 蛋白印跡檢測結果

由圖2、圖3、表2、表3可見：損傷后各時間點中，PI3K、Akt、P-AktSer473、mTOR、P-mTORSer2448的表達量呈現(xiàn)逐漸升高后降低的趨勢，在損傷后5 d達到峰值。與正常對照組比較，損傷后1 d、3 d、14 d組各蛋白表達量升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；損傷后5 d組PI3K、Akt、P-AktSer473表達量顯著升高（P＜0.01），mTOR、P-mTORSer2448表達量顯著升高（P＜0.05）；損傷后 7 d組 PI3K、P-AktSer473、mTOR、P-mTORSer2448表達量顯著升高（P＜0.05），Akt表達量顯著升高（P＜0.01）。

圖2 各組大鼠腓腸肌PI3K、Akt和mTOR的免疫印跡圖

表2 各組大鼠腓腸肌PI3K、Akt和mTOR表達水平比較（n=3）

圖3 各組大鼠腓腸肌p-Akt和p-mTOR的免疫印跡圖

表3 各組大鼠腓腸肌p-AktSer473和p-mTORSer2448表達水平比較（n=3）

2.3 RT-qPCR結果

表4可見：損傷后各時間點中，MyoD1和MyoG的mRNA表達水平呈現(xiàn)逐漸升高后降低的趨勢，損傷后3 d達到峰值。與正常對照組比較，損傷后1 d組MyoD1和MyoG的mRNA表達量顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；損傷后3 d、5 d、7 d組MyoD1和MyoG的mRNA表達量顯著升高（P＜0.01）；損傷后14 d組myoG的mRNA表達量顯著升高（P＜0.05），myoD1 的mRNA表達量升高，但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠腓腸肌MyoD1和MyoG的mRNA表達水平比較（n=3）

3 討論

急性骨骼肌鈍挫傷是體育運動中十分常見的接觸性、非侵入性的損傷[12]，本實驗模擬此類骨骼肌損傷，以2.37 J的動能打擊大鼠腓腸肌中段后使局部立刻凹陷，而后淤腫明顯，皮溫升高，患肢跛行。HE染色結果顯示：骨骼肌損傷后1 d，肌細胞變性壞死，炎性細胞潤；損傷后3、5 d可見成肌細胞和新生肌管；損傷后7、14 d可見新生的肌細胞和纖維結締組織。該結果與相關文獻報道具有一致性[5，6]，充分表現(xiàn)了骨骼肌損傷的3個病理進程，即急性損傷炎癥期、修復期和組織塑形期[13-14]，表明模型的建立是成功的。骨骼肌損傷修復的病理進程離不開相應的基因、蛋白、生長因子及細胞因子等的調控[15]，同時它們的啟動和傳導又需要信號通路的激活，其中PI3K/Akt/mTOR信號通路作為受體信號向細胞內傳導的重要途徑之一，具有調節(jié)細胞增殖、分化及蛋白合成等的功能。

PI3K屬于磷脂酰肌醇激酶[16]，同時具有磷脂酰肌醇激酶及絲/蘇氨酸激酶的活性，是細胞內重要的信號傳導物質。生理條件下，PI3K在細胞內表達較少，當細胞受到損傷時，生長因子、細胞因子、激素等細胞外信號分子激活[17-18]，使PI3K表達迅速升高，在細胞膜上促進3，4-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）轉變?yōu)樾攀沟鞍祝?，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），從而調控下游信號分子。蛋白激酶 B（Akt/PKB）是 PI3K的主要下游信號分子，屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶，處于PI3K/Akt/mTOR信號通道的核心地位。PI3K激活后在細胞膜上產生了作為第二信使的PIP3，招募含有PH結構域的Akt信號蛋白和磷酸肌醇依耐性蛋白激酶1（PDK1），由PDK1磷酸化Akt的Thr308位點，再通過PDK2二次磷酸化Akt的Ser473位點，從而完全活化Akt[19-20]，激活后的Akt再次轉移至細胞質或細胞核內，繼續(xù)調控其下游的靶分子。mTOR是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白，屬于磷脂酰肌醇激酶相關激酶（PIKK）家族，是多條信號通路的匯聚點，激活后的Akt可磷酸化mTOR的 Ser2448位點，直接活化mTOR，或通過抑制結節(jié)性硬化復合物1/2（TSC1/TSC2）而間接激活mTOR，再調控下游的靶蛋白[21]，從而發(fā)揮廣泛的生物學效應。目前，大部分關于骨骼肌與PI3K/Akt/mTOR信號通路的研究多集中在參與骨骼肌萎縮的代償過程，在骨骼肌損傷修復中的作用及具體效應時間方面鮮有報道[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt/mTOR信號通路活性變化與骨骼肌鈍挫傷的自我修復之間存在時間相關性，各目的蛋白表達量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在損傷后5 d達到峰值（P＜0.01，P＜0.05）。從損傷后1 d開始該通路被激活，表達高于正常對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示骨骼肌細胞接受損傷刺激信號后，在相關的生長因子、細胞因子以及炎癥刺激的作用下，PI3K/Akt/mTOR信號通路已開始被激活；損傷后的第5 d和7 d，此時模型組PI3K蛋白表達顯著高于正常對照組（P＜0.05），并且模型組Akt和mTOR的總蛋白含量均顯著高于正常對照組（P＜0.05），尤其是能代表該通路激活狀態(tài)的模型組P-AktSer473和P-mTORSer2448也均顯著增加（P＜0.05），雖然本實驗未對P-AktThr308進行檢測，但是只有完全活化的Akt才可激活mTOR的活性，提示PI3K/Akt/mTOR信號通路在骨骼肌損傷修復的關鍵時期處于完全激活狀態(tài)，并且HE染色可見大量新生肌管和肌細胞的出現(xiàn)，因此該信號通路參與骨骼肌損傷后相關蛋白的合成及自我修復過程；損傷后14 d，該通路活性表達降低，接近正常生理狀態(tài)，組織形態(tài)可見再生的骨骼肌細胞逐漸成熟，瘢痕組織形成，提示骨骼肌損傷修復進入組織塑形期，該信號通路的作用效應降低。

肌衛(wèi)星細胞是一群具有自我更新能力的肌肉前體細胞，在骨骼肌損傷后肌肉組織的修復中發(fā)揮了重要作用[24-25]。在這一過程中，生肌調節(jié)因子（MRFs）扮演了重要的角色，MRFs家族包括了4種肌肉特異性轉錄因子：Myf5、MyoD、MyoG、和MRF4，其共同調控肌細胞的增殖和分化。作為初級分化因子的MyoD（基因名稱為MyoD1）主要調控成肌細胞的增殖及分化[26]；作為次級分化因子的MyoG調控新生肌管的終末分化[27]，使新生肌細胞最終轉化為表達MyHC的成熟肌管，發(fā)揮骨骼肌纖維的生物學功能，因此MyoD和MyoG在骨骼肌組織成肌分化中發(fā)揮了重要作用。本研究結果顯示MyoD1和MyoG的mRNA表達也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，均在損傷后3 d達到峰值，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），這一過程表明PI3K/Akt/mTOR信號通路的表達變化與MyoD1和MyoG的mRNA的趨勢大體一致，提示該通路的激活還可調節(jié)肌衛(wèi)星細胞的增殖與分化，這一點對我們研究骨骼肌損傷修復進程具有重要意義。有學者發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素（rapamycin）抑制 mTORC1信號通路，最終可以抑制成肌細胞的分化[28]；在骨骼肌衛(wèi)星細胞中特異性敲除mTOR會抑制Pax7和成肌因子的轉錄和翻譯，從而抑制肌衛(wèi)星細胞的增殖及分化[29]；并且阻斷PI3K/Akt通路后，成肌分化標志基因 MyoD1、MyoG 和 MyHC的表達可降低，抑制骨骼肌細胞的分化[30]。 本研究的結果與他人研究基本相符，該信號通路可正向調控骨骼肌損傷后的成肌分化。

4 結論

PI3K/Akt/mTOR信號通路在各種細胞中廣泛存在，對細胞的生長、增殖、分化等過程的調節(jié)具有十分重要的價值。本研究中該通路在骨骼肌損傷后的激活及時程變化趨勢為科學研究提供了一個新思路，即通過干預PI3K/Akt/mTOR信號通路的時程變化趨勢，調控成肌分化標志因子的表達，從而研究加快骨骼肌損傷后修復的可能生物學機制。