跑臺運動對肥胖小鼠骨骼肌CHI3L1表達的影響及其機制

李靈杰 張靚 陳雪飛

北京師范大學體育與運動學院（北京 100875）

幾丁質(zhì)酶-3 樣蛋白-1（chitinase 3-like-1，CHI3L1），因其蛋白N末端三個氨基酸分別為酪氨酸（Y）、賴氨酸（K）和亮氨酸（L），分子量為40Kd，因而又稱為YLK-40，是1992年在人成骨肉瘤細胞株MG63培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的一種糖蛋白[1]。體內(nèi)多種細胞均可合成和分泌CHI3L1，巨噬細胞、中性粒細胞等免疫細胞[2]，成纖維細胞、血管平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞、呼吸道上皮細胞等非免疫細胞[3]及多種腫瘤細胞[4]均有CHI3L1表達。早先研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤患者血清CHI3L1水平顯著升高，其與腫瘤的惡性度、腫瘤患者的死亡率顯著正相關，是腫瘤發(fā)生的標記物[5]。近來研究提示，在多種慢性炎癥相關的疾病中，血清CHI3L1水平也顯著升高，CHI3L1會誘導大量的前炎癥因子產(chǎn)生，進而擴大炎癥反應，參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展[6]。多種促炎因子，如白介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tu?mor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1β（interleu?kin-1β，IL-1β）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）均會誘導CHI3L1的表達。

有研究證實，骨骼肌細胞可以表達、合成和分泌CHI3L1，認為CHI3L1是肌肉因子[7]。運動可以調(diào)節(jié)CHI3L1的表達，在運動后即刻，人血漿CHI3L1水平及骨骼肌中CHI3L1的表達均顯著升高[8]；離體電刺激人原代骨骼肌細胞誘導細胞收縮24小時，骨骼肌細胞中CHI3L1的mRNA表達和蛋白表達均顯著升高，培養(yǎng)液中CHI3L1的水平也顯著上升，提示運動能夠促進CHI3L1的表達、合成和分泌[8]。肥胖時，骨骼肌CHI3L1的表達如何變化，運動對肥胖小鼠骨骼肌CHI3L1的表達影響如何目前還不清楚。本研究以高脂喂養(yǎng)的C57小鼠為肥胖模型，觀察8周的跑臺訓練對比目魚肌和腓腸肌中CHI3L1表達的影響，并探討運動調(diào)節(jié)CHI3L1表達的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料

實驗動物選用清潔級雄性斷乳C57BL/6小鼠，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2014-0001。動物分籠飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度為22±5oC，濕度為50% ±10%，明暗交替周期為12 h，自由進食和飲水。所有飼料均由沈陽健民動物實驗飼料廠提供，按重量計算，普通飼料含有6%的菜籽油和30.5%的小麥淀粉，高脂飼料含有21%的無水黃油和15.5%的小麥淀粉，其他營養(yǎng)成分一致，普通飼料和高脂飼料的可吸收能量分別為16.1和19.4 MJ/kg。CHI3L1抗體購自Abcam公司（Cambridge，UK），實驗中所用其他試劑均為市售分析純試劑。

1.2 動物分組與運動模型建立

5周齡健康雄性C57BL/6小鼠32只，體重20.32±0.65 g，隨機分成對照組（Con，n=8）和高脂喂養(yǎng)組（n=24），分別進行普通飼料和高脂飼料喂養(yǎng)。8周后，以體重≥對照組平均體重的20%為標準篩選肥胖小鼠16只。高脂喂養(yǎng)肥胖小鼠隨機分為高脂安靜組（HFD，n=8）和高脂運動組（HE，n=8）。高脂運動組采用跑臺運動，前兩周進行適應性訓練，從10 m/min、20 min/d、5天/周逐漸遞增至第2周末的23～25 m/min（相當于85%VO2max）、60 min/d、5天/周，以后的負荷同第2周末負荷，正式訓練干預6周[9]。每次訓練在下午3點至6點間進行，不使用聲、光、電等刺激手段。

1.3 取材

小鼠末次運動結束24 h后，禁食過夜，自由飲水。動物稱重后麻醉處死，分離比目魚肌和腓腸肌的白肌部分進行下述實驗。

1.4 免疫組化染色

比目魚肌與腓腸肌均置于10%的多聚甲醛溶液中浸泡過夜，轉(zhuǎn)至20%蔗糖溶液中浸泡過夜，進行石蠟包埋，用于石蠟切片，切片厚度為5 μm。石蠟切片脫蠟后用于CHI3L1染色。染色流程如下：磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次后，過氧化氫孵育5～10分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗后，PBS浸泡5分鐘。經(jīng)10%山羊血清封閉后沖洗，分別滴加1∶50 CHI3L1一抗、1∶200生物素標記二抗、適量辣根酶或堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素工作液37oC孵育10～30分鐘后，PBS沖洗，顯色劑顯色。CHI3L1特異性染色呈褐色。自來水沖洗，復染，脫水，透明，封片，觀察結果。隨機抽取各組動物比目魚肌和腓腸肌切片（n=3），在400倍視野下隨機觀察5個視野，確定CHI3L1的表達變化。

1.5 Real-time PCR測定比目魚肌、腓腸肌中CHI3L1、TNF-α及IL -6的mRNA水平

采用天根動物組織總RNA提取試劑盒（TianGen Biotech，Beijing）提取骨骼肌總RNA，天根逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)（TianGen Biotech，Beijing）進行逆轉(zhuǎn)錄。Real-time PCR 反應體積共 20 μl：Super Real Pre Mix Plus（SYBR Green）體系（TransGene Biotech，Beijing）15 ml，10 mmol/L的上下游引物各0.5 ml，cDNA模板5 ml。

GAPDH的上游引物：5’-ACAGCAACAGGGTGGT?GGAC-3’；下游引物：5’-TTTGAGGGTGCAGC?GAACTT-3’；

CHI3L1的上游引物：5’-GTACAAGCTGGTCTGC?TACT-3；下游引物：5’-GTTGGAGGCAATCTCG?GAAA-3’；

TNF-α的上游引物：5’-CAGGCGGTGCCTAT?GTCTC-3’；下游引物：5’-CGATCACCCC?GAAGTTCAGTAG-3’；

IL-6的上游引物：5’-GAGGATACCACTCCCAA?CAGACC-3’;下游引物：5’-AAGTGCATCATCGTT?GTTCATACA-3’。

所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司（Shanghai，China）合成。進行94oC 30 s，94oC 5 s，60oC 15 s，72oC 10 s，熱循環(huán)40次。Real-time PCR于ABI 7500實時熒光定量PCR儀（Applied Biosys?tems，USA）上進行，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.6 統(tǒng)計方法

實驗結果以均數(shù)±標準差（±s）表示。數(shù)據(jù)采用Prism 5.0軟件進行單因素方差分析處理，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結果

2.1 跑臺運動對高脂喂養(yǎng)的肥胖小鼠體重的影響

高脂喂養(yǎng)16周后，HFD小鼠體重顯著高于Con組（P＜0.01，圖1），8周的跑臺運動顯著降低了高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠體重（P＜0.01，圖1），提示高脂飲食誘導肥胖的發(fā)生，運動有效地減輕了小鼠肥胖。

圖1 各組小鼠體重比較

2.2 跑臺運動對高脂喂養(yǎng)小鼠比目魚肌、腓腸肌CHI3L1 mRNA表達的影響

與對照組相比，高脂安靜組小鼠比目魚肌和腓腸肌中CHI3L1的mRNA表達均顯著上調(diào)（P＜0.01，P＜0.001，圖2），尤其是腓腸肌CHI3L1表達上升達5倍，提示肥胖時CHI3L1表達改變在快肌更為明顯。與高脂安靜組相比，高脂運動組小鼠比目魚肌和腓腸肌中CHI3L1的mRNA表達均顯著下調(diào)（P＜0.001，圖2），比目魚肌中CHI3L1的表達甚至顯著低于對照組（P＜0.01，圖2），表明運動明顯抑制了CHI3L1的表達。

圖2 各組小鼠比目魚肌、腓腸肌CHI3L1 mRNA相對表達比較

2.3 跑臺運動對高脂喂養(yǎng)小鼠比目魚肌、腓腸肌CHI3L1蛋白水平的影響

在比目魚肌，HFD小鼠CHI3L1的蛋白表達與Con組相比沒有顯著改變，HE組小鼠CHI3L1的蛋白表達顯著低于HFD 組（圖3A）。在腓腸肌，HFD小鼠CHI3L1的蛋白表達顯著高于Con組，HE組小鼠CHI3L1的蛋白表達與HFD組相比顯著降低（圖3B）。免疫組化染色結果提示，除去HFD組大鼠比目魚肌CHI3L1的蛋白表達沒有顯著升高，其余CHI3L1的蛋白表達改變與mRNA表達改變一致，在高脂安靜組合成增加，而運動能顯著抑制其合成。

圖3 比目魚肌和腓腸肌CHI3L1免疫組化的結果

2.4 跑臺運動對高脂喂養(yǎng)小鼠比目魚肌、腓腸肌TNF-α和IL-6表達的影響

炎癥因子是誘導CHI3L1表達的主要物質(zhì)，因此我們測定了骨骼肌局部炎癥因子TNF-α和IL-6的表達。高脂安靜組小鼠腓腸肌TNF-α和IL-6的mRNA表達均顯著上調(diào)（P＜0.001，P＜0.01，圖4），運動顯著降低了炎癥因子的表達水平（P＜0.001，P＜0.01，圖4）。在比目魚肌，TNF-α和IL-6的表達雖有變化趨勢，但無顯著意義（P＞0.05，圖4）。

3 討論

3.1 肥胖時CHI3L1的變化及其病理生理意義

CHI3L1是糖基水解酶18家族（glycosyl hydrolase family 18，GH18）成員之一，CHI3L1的結構在種屬間高度保守，提示其有著重要的生物學作用。研究發(fā)現(xiàn)CHI3L1具有促進細胞增殖、抑制凋亡、誘導細胞外基質(zhì)重塑、誘導血管再生及刺激炎癥等功能，在卵巢癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌等多種惡性腫瘤[10-11]，在動脈粥樣硬化、冠心病、高血壓等多種心血管疾病[12]，在哮喘、類風濕關節(jié)炎、腸道炎癥[13]、腦炎等炎癥疾病時都發(fā)揮其重要的病理生理作用。

近來有大量臨床研究報道，在肥胖、糖尿病及其并發(fā)癥患者血漿中CHI3L1的水平也顯著升高。Kyrgios等發(fā)現(xiàn)在青春期前的兒童肥胖人群，血清中CHI3L1的水平即顯著上調(diào)[14]。EI-Mesallamy等報道人血清中CHI3L1的水平與肥胖程度呈正相關，并與血清瘦素水平呈顯著正相關[15]。Catalan 等[16]和 Hempen 等[17]分別報道，肥胖人群血液中CHI3L1的水平顯著升高，在進行低碳水化合物飲食或胃旁路術后，體重降低的同時血液中CHI3L1的水平也相應降低，提示CHI3L1與肥胖有著密切的聯(lián)系。

圖4 各組小鼠比目魚肌、腓腸肌TNF-α和IL-6 mRNA相對表達比較

那么，肥胖時升高的CHI3L1的病理生理作用如何呢？Ahangari等[18]用高脂飲食喂養(yǎng)CHI3L1-/-小鼠，發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，CHI3L1缺失小鼠內(nèi)臟脂肪顯著減少，同時脂肪組織TNF-α、IL-10和IL-6的表達顯著減少，提示CHI3L1促進了肥胖時脂質(zhì)的積聚及脂肪組織炎癥因子的合成，進而促進了肥胖的發(fā)展。

目前有研究發(fā)現(xiàn)，肥胖時，血液中升高的CHI3L1可能來源于外周血單核細胞（Peripheral blood mononu?clear cell，PBMC），Catalan等[19]在肥胖人群PBMC發(fā)現(xiàn)CHI3L1的mRNA表達升高4倍，PBMC可能是肥胖時血液中CHI3L1的來源之一；此外，脂肪組織，尤其是內(nèi)臟脂肪可能是肥胖時CHI3L1的另一來源[16]。本研究首次報道了肥胖時骨骼肌中CHI3L1的表達情況，發(fā)現(xiàn)高脂飲食誘導快肌纖維為主的腓腸肌中CHI3L1 mRNA表達和蛋白水平顯著增加，相較于慢肌纖維為主的比目魚肌更為明顯，提示肥胖時快肌CHI3L1的表達和合成顯著增加，考慮到骨骼肌占人體體重的40%，我們推測骨骼肌也可能是肥胖時血液中CHI3L1的來源之一。

3.2 運動對CHI3L1表達的調(diào)節(jié)

在健康人群，單次25分鐘的自行車運動后即刻、1小時和3小時，均不改變血清中CHI3L1的水平[20]。Gorgens等設計了三種運動方式來觀察健康人群運動后CHI3L1的變化，分別是70%的最大攝氧量運動60分鐘、急性下肢力量練習及12周的有氧和抗阻運動。研究發(fā)現(xiàn)急性運動后即刻，血中CHI3L1的水平均顯著升高，骨骼肌CHI3L1的mRNA表達在運動后即刻顯著上調(diào)，運動后2小時回落。12周的運動訓練對血中CHI3L1的水平和骨骼肌中CHI3L1的mRNA表達均無影響[8]。Huang等觀察肥胖人群進行單次30分鐘75%最大攝氧量運動后即刻和運動后1小時，未發(fā)現(xiàn)血中CHI3L1水平的改變[21]。綜上提示，CHI3L1可能是運動的快反應蛋白，在運動后即刻被顯著上調(diào)，隨后即迅速回落，此外還與運動強度和運動時間密切相關。

本研究首次報道經(jīng)過8周的跑臺訓練，肥胖小鼠骨骼肌中CHI3L1的mRNA表達和蛋白水平均顯著降低，在比目魚肌CHI3L1的表達甚至顯著低于對照組，提示運動對肥胖時升高的CHI3L1的表達有顯著的下調(diào)作用，進而減輕了肥胖時CHI3L1的病理生理作用。

3.3 骨骼肌CHI3L1的表達調(diào)節(jié)

多種促炎因子，如IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-γ均會誘導CHI3L1的表達。Nielsen等[22]給健康人外源性注射重組IL-6，使血中IL-6水平達到150 ng/ml，24小時后測定發(fā)現(xiàn)血中CHI3L1的水平從30 ng/ml升高到57 ng/ml，在注射后48小時回落到正常水平；在人原代培養(yǎng)的軟骨細胞，100ng/ml的IL-6孵育24小時，CHI3L1的合成增加40%[23]。在培養(yǎng)的人原代骨骼肌細胞，50 pg/ml的TNF-α處理24小時后，CHI3L1的表達和分泌分別上調(diào)6倍和3倍[7]?？梢姡傺滓蜃覫L-6和TNF-α是CHI3L1表達、合成和分泌的重要誘導因子。

本研究發(fā)現(xiàn)肥胖時骨骼肌，尤其是在快肌構成為主的腓腸肌，IL-6和TNF-α的表達顯著上調(diào)，運動顯著抑制了骨骼肌兩種促炎因子的表達。推測運動對炎癥的抑制作用可能是肥胖時骨骼肌CHI3L1表達降低的主要原因，運動通過抑制炎癥間接調(diào)節(jié)骨骼肌CHI3L1的表達。

4 總結

8周的高脂飲食喂養(yǎng)顯著上調(diào)了腓腸肌中促炎因子IL-6、TNF-α和CHI3L1的表達，8周的跑臺運動顯著抑制了促炎因子和CHI3L1的表達，提示運動間接地通過抑制炎癥調(diào)節(jié)骨骼肌CHI3L1的表達，發(fā)揮其在改善肥胖及其并發(fā)的多種代謝性疾病中的作用。