腺病毒介導的hNT-3基因轉染對兔前交叉韌帶重建術后本體感覺恢復的影響

蔡東高 傅永慧 呂游 曾輝 孫旭

中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院第四骨科（沈陽 110000）

近些年來，前交叉韌帶（anterior cruciate liga?ment,ACL）損傷重建術后本體感覺的恢復被廣泛重視。前交叉韌帶損傷導致的膝關節(jié)不穩(wěn)定，會引起繼發(fā)性關節(jié)炎和半月板損傷，嚴重影響患者的日常生活和運動功能[1-3]。膝關節(jié)穩(wěn)定性的重建，不僅需要前交叉韌帶生物力學的重建，更依賴于術后本體感覺的恢復[4,5]。神經(jīng)營養(yǎng)素3對傳導本體感覺的神經(jīng)的生長發(fā)育和生理功能的發(fā)揮起著重要作用[6]，且前交叉韌帶重建術后的肌腱移植物內(nèi)能夠檢測到神經(jīng)營養(yǎng)素-3的表達[7,8]，但神經(jīng)營養(yǎng)素-3與前交叉韌帶損傷后本體感覺恢復的關系尚不清楚。因此，本實驗通過構建帶有人神經(jīng)營養(yǎng)素-3（human neurotrophin3,NT3）基因的重組腺病毒載體，體內(nèi)轉染給自體半腱肌肌腱移植物，使得hNT-3在肌腱移植物內(nèi)過表達，而后測量體感誘發(fā)電位（somatosensory evoked potential,SEP）、腘繩肌肌電圖（electromyography,EMG）的改變和本體感受器數(shù)目的變化，旨在探討神經(jīng)營養(yǎng)素-3對前交叉韌帶損傷重建術后本體感覺的恢復是否有促進作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康的日本大耳白兔42只，雌雄不限，體重2～3.1 kg,平均2.62 kg，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供。

1.2 主要材料與儀器

重組腺病毒載體（adenovirus-mediated human neurotrophin3,Ad hNT-3）與腺病毒空載體（adenovirusmediated green fluorescent protein,Ad GFP）的構建，腺病毒的包裝、濃縮以及滴度的測定均由上海漢恒生物科技有限公司完成，滴度1.26×1011PFU/mL。鼠抗兔S-100單克隆抗體（北京博士德生物技術有限公司），免疫組化試劑盒（福建邁新生物技術開發(fā)有限公司），OCT包埋劑（北京中杉金橋生物技術有限公司），石蠟切片機（Thermo，HM340E），冰凍切片機（Thermo，HM525），誘發(fā)電位儀（日本光電，MEB2200）,熒光顯微鏡（Nikon,E800），圖像采集軟件（NIS-Elements F3.0）。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組

42只實驗動物隨機分成A、B、C三組，每組14只。A組：單側后肢膝關節(jié)前交叉韌帶損傷重建術后，自體半腱肌肌腱移植物內(nèi)用微量注射器多點注射20 μl滴度1.26×1011PFU/mL的Ad hNT-3。B組：單側膝關節(jié)前交叉韌帶損傷重建術后，自體半腱肌肌腱移植物內(nèi)用微量注射器多點注射20 μl Ad GFP。C組：單側膝關節(jié)前交叉韌帶損傷重建術后，自體半腱肌肌腱移植物內(nèi)用微量注射器多點注射20 μl的生理鹽水。

1.3.2 動物模型的建立

術前實驗動物禁食水12 h，稱量體重（kg），以3%戊巴比妥鈉溶液（1 ml/kg）耳緣靜脈注射進行麻醉，根據(jù)觀察角膜反射是否消失，適當增減麻醉劑量。用電動剃毛刀剃凈術肢膝關節(jié)手術區(qū)域毛發(fā)，以手術切口為中心由內(nèi)向外用碘伏進行消毒，反復3次，鋪無菌洞巾。切開皮膚，采用髕旁內(nèi)側入路，切開髕韌帶，將髕骨外推暴露出關節(jié)腔及前交叉韌帶（圖1b），用手術刀將前交叉韌帶在脛骨和股骨止點處完全切斷（圖1c）。用鉆頭直徑2 mm的手工鉆取脛骨近端內(nèi)側和股骨遠端外側髁的骨隧道（圖1d、e）。在脛骨結節(jié)內(nèi)上方3～4 cm處切開肌肉表面筋膜，用止血鉗分離肌肉組織，暴露分離出半腱肌肌腱。取3 cm長度的半腱肌肌腱（圖1a），兩端用2-0外科縫合線縫合后牽引通過骨髓道，兩端固定于周圍骨膜和軟組織，使肌腱移植物保持適當?shù)膹埩Γ▓D1f）。前交叉韌帶重建后，根據(jù)以上分組情況對自體半腱肌肌腱移植物進行微量注射器多點注射（圖1g）。用生理鹽水配置的青霉素溶液清洗關節(jié)腔后，逐層關閉切口。術后不限制實驗動物活動，每天給予20萬單位的青霉素，持續(xù)1周。

1.4 觀測指標

1.4.1 一般情況

觀察術后實驗動物存活狀況、飲食狀況、關節(jié)活動情況以及傷口愈合情況；觀察各時間點取材時肌腱移植物兩端固定有無松解脫落。

1.4.2 綠色熒光蛋白檢測

術后48 h，分別從A、B、C三組中取2只兔，過量麻醉法處死后，取出肌腱移植物，放入4%的多聚甲醛中固定24 h，接著30%的蔗糖溶液沉底，最后放入液氮中保存?zhèn)溆?，整個過程要避光。將肌腱從液氮中取出來后，用OCT包埋劑包埋后進行冰凍切片，厚度為7 μm。暗室內(nèi)，在熒光顯微鏡藍光激發(fā)下觀察綠色熒光蛋白（GFP）。

圖1 前交叉韌帶重建術

1.4.3 電生理學指標檢測

術后8、16、24周，分別從A、B、C 三組中各取4只兔子進行麻醉，角膜反射消失后固定頭部和四肢，沿原來的手術切口進入，打開關節(jié)腔并暴露半腱肌肌腱移植物。先確定兩眶后緣連線與前正中線的交點，由交點向后0.5 cm并旁開0.2 cm作為記錄電極點，并于鼻根部皮下放置皮層參考電極，后肢近端用皮下電極接地測定體感誘發(fā)電位（SEPs）。然后將記錄電極放置于腘繩肌肌腹，參考電極放置于內(nèi)踝部做肌電圖（EMG）檢查。雙極表面電極刺激肌腱移植物兩端脛骨和股骨附著點處，刺激強度 18～20 V。記錄并分析SEPs和 EMG潛伏期和波幅。

1.4.4 免疫組織化學染色和HE染色

上述電生理學指標檢測后，以過量麻醉法處死動物。取出半腱肌肌腱移植物，放入4%的多聚甲醛中固定24 h。經(jīng)不同濃度梯度的乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后切片，切片厚度4 μm。每一個標本進行連續(xù)切片，切片后再分別進行HE染色和S-100抗體的免疫組化染色，來觀察組織切片的大體形態(tài)以及本體感受器的形態(tài)和數(shù)量。免疫組化大體步驟：石蠟切片脫蠟和水化后，PBS沖洗；檸檬酸鈉緩沖液組織抗原修復；阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性；PBS沖洗，滴加血清，室溫孵育；滴加鼠抗兔S-100單克隆抗體，4℃過夜；PBS沖洗，滴加生物素標記的二抗，室溫孵育10分鐘；PBS沖洗，滴加鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫孵育10分鐘；PBS沖洗，DAB顯色；蘇木素復染，流水反藍；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片觀察。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用 SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù) ±標準差表示，各組間比較采用單因素方差分析，使用 K-S檢驗進行正態(tài)性檢驗，使用 Bartlett檢驗進行方差齊性檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 一般情況

術后A組中1只兔不明原因死亡，給予相應補充。取材時C組中1只兔肌腱移植物股骨端脫落，造模失敗，給予相應補充。其他實驗動物術后傷口愈合良好，肢體活動正常，取材時肌腱移植物張力良好。

2.2 熒光顯微鏡觀察

轉染48 h后，A、B兩組中可見大量綠色熒光蛋白表達（圖2），C組中未見熒光。

圖2 熒光顯微鏡觀察（×20）

2.3 電生理指標檢測

A、B、C三組中體感誘發(fā)電位和肌電圖的潛伏期隨著術后恢復時間的延長而縮短，波幅隨著術后恢復時間的延長而延長；術后8、16、24周的各個時間點，A組體感誘發(fā)電位和肌電圖的潛伏期短于B、C兩組，波幅高于B、C兩組（表1），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而B、C兩組比較無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

表1 3組 SEPs及 EMG 潛伏期和波幅變化比較（n=4，±s）

表1 3組 SEPs及 EMG 潛伏期和波幅變化比較（n=4，±s）

注：＊P＜0.05，B、C兩組在不同的時間段與A組比較；＃P＜0.05，表示3組內(nèi)第16 w、24 w與第8 w比較。

組別A組8 w 16 w 24 w B組8 w 16 w 24 w C組8 w 16 w 24 w SEPs EMG潛伏期（ms） 波幅（μV） 潛伏期（ms） 波幅（μV）30.89±1.22 24.93±0.49＃20.69±1.01＃6.48±0.75 8.41±0.49＃12.97±1.16＃19.71±1.25 16.63±0.99＃12.86±1.28＃0.22±0.04 0.25±0.02＃0.34±0.02＃35.37±1.21＊29.09±0.59＊＃25.22±0.97＊＃3.79±0.96＊5.63±0.90＊＃8.31±1.47＊＃25.07±1.28＊21.03±1.42＊＃17.65±1.96＊＃0.12±0.02＊0.17±0.02＊＃0.23±0.02＊＃0.12±0.02＊0.18±0.02＊＃0.24±0.01＊＃34.61±1.39＊29.06±1.76＊＃25.88±0.93＊＃3.94±0.23＊5.76±0.93＊＃8.60±1.37＊＃24.80±1.61＊21.30±0.50＊＃17.47±0.46＊＃

2.4 本體感受器的數(shù)目和形態(tài)

通過對組織石蠟切片的S-100抗體免疫組織化學染色和HE染色，可見4種形態(tài)結構的本體感受器：環(huán)層小體、魯菲尼小體、高爾基樣腱器官、游離神經(jīng)末梢（由于游離神經(jīng)末梢結構不典型，故在國內(nèi)外研究中不用于計數(shù)，故僅在圖中用星形標記了一部分）（圖3、圖4、圖5）。A、B、C三組中本體感受器的數(shù)目隨著術后恢復時間的延長而增加；且相同的時間點，A組本體感受器的數(shù)目多于B、C兩組（表2），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而B、C兩組本體感受器數(shù)目相比較無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

圖3 A組免疫組織化學染色（×40）

圖4 B組免疫組織化學染色（×40）

表2 3組本體感受器的數(shù)目比較（n=4，±s）（不包括游離神經(jīng)末梢）

表2 3組本體感受器的數(shù)目比較（n=4，±s）（不包括游離神經(jīng)末梢）

＊P＜0.05，B、C兩組在不同的時間段與A組比較；＃P＜0.05，表示3組內(nèi)第16 w、24 w與第8 w比較。

A組B組C組8 w9.25±1.165.25±0.74＊5.75±0.74＊16 w13.25±0.97＃9.5±1.00＊＃9.75±0.97＊＃24 w 18±1.10＃12.25±0.97＊＃12.5±1.34＊＃

圖5 C組免疫組織化學染色（×40）

3 討論

前交叉韌帶是維持膝關節(jié)穩(wěn)定的重要結構，除了其生物力學功能外，還有本體感覺功能。當關節(jié)受到牽拉刺激，前交叉韌帶中的機械感受器會將刺激信號通過相關神經(jīng)傳導通路，經(jīng)脊髓傳導至大腦皮質(zhì)，大腦分析處理后發(fā)出指令調(diào)節(jié)關節(jié)活動[9,10]。Freeman[11]結合之前許多學者對機械感受器的研究，用改良氯化金染色法對ACL中的機械感受器進行了形態(tài)學分類：Ⅰ類為 Ruffini小體，呈樹狀或卵圓形，被膜較??；Ⅱ類為 Pacinian小體，呈圓形或橢圓形，被膜較厚；Ⅲ類為Golgi樣腱器官，呈梭形，被膜較薄；Ⅳ類為游離神經(jīng)末梢，無髓鞘神經(jīng)末梢，這種分類方法也是目前公認的分類標準。近年來，有研究者用S-100抗體進行ACL本體感受器的免疫組織化學染色，也能夠清晰地觀察到本體感受器[12,13]，此方法跟傳統(tǒng)的氯化金染色法相比，特異性和敏感性更高。本實驗就是采用鼠抗兔S-100單克隆抗體進行免疫組織化學染色，觀察到了自體肌腱移植物內(nèi)4種不同類型的機械感受器：環(huán)層小體、魯菲尼小體、高爾基樣腱器官、游離神經(jīng)末梢，且主要分布在肌腱移植物兩端的股骨和脛骨附著點處，這與Zimny[14]等發(fā)現(xiàn)的人ACL的感受器主要分布 于ACL的股骨和脛骨附著點處的觀點相一致。

由于膝關節(jié)運動形式復雜多變 ，本體感覺測量的內(nèi)容也多種多樣，主要有主動或被動角度重現(xiàn)法、閾值測量法、視覺模型法、體感誘發(fā)電位和肌電圖測量法[15-17]。每種測量方法都有一定的局限性，而SEPs和EMG的測量在動物實驗中被廣泛應用。本研究中，hNT-3過表達的組別中，SEPs和EMG的潛伏期縮短，波幅升高，提示hNT-3能夠促進ACL重建術后本體感覺的恢復。在A、B、C各組中，術后16周的SEPs和EMG的潛伏期短于術后8周但長于術后24周，術后16周的SEPs和EMG的波幅高于術后8周但低于術后24周；術后16周的本體感受器數(shù)量多于術后8周但少于術后24周，這表明前交叉韌帶重建術后本體感覺的恢復有著很強的時間依賴性，隨著術后時間的延長，本體感覺逐漸恢復。

神經(jīng)營養(yǎng)素是一類參與神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育和損傷修復的蛋白質(zhì)家族，其功能包括促進神經(jīng)元軸突生長、突觸以及髓鞘的形成[18]。Narazaki[19]等的研究表明，神經(jīng)營養(yǎng)素-3能夠促進脊髓損傷修復，改善實驗動物的肢體活動；Sterne等[20]發(fā)現(xiàn)在大鼠坐骨神經(jīng)局部應用NT-3可促進坐骨神經(jīng)損傷的修復再生，說明NT-3對中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)都發(fā)揮著重要作用。相關研究表明存在肌梭源性NT-3[21]，故外源性NT-3可能有利于建立局部微環(huán)境，促進神經(jīng)纖維的長入和本體感受器的再生過程。腺病毒結構簡單，感染率高，易于培養(yǎng)和純化，且不整合宿主基因組，具有較高的安全性，這些優(yōu)點使以腺病毒作為載體的基因治療迅速發(fā)展。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，腺病毒介導的hNT-3轉染能夠促進ACL損傷重建術后移植物內(nèi)本體感受器的再生和本體感覺的恢復，為臨床上前交叉韌帶損傷的治療提供新的思路。

本實驗存在的不足：實驗動物樣本量較少，缺乏足夠的說服力；術后觀察的時間較短，遠期效果有待進一步驗證；外源性NT-3促進前交叉韌帶重建術后本體感受器再生的機制有待進一步探究；本實驗中，腺病毒體內(nèi)最佳轉染滴度有待進一步探究；腺病毒體內(nèi)轉染后的具體表達時間及表達量尚不清楚。