丹參總酚酸生物黏附漂浮微丸體外釋放和大鼠藥代動力學(xué)研究

楊丹丹　黎迎　朱春燕

摘要：目的 制備丹參總酚酸生物黏附漂浮微丸，延長其在體內(nèi)的滯留時間，提高其口服生物利用度。方法 采用擠出滾圓法，分別以殼聚糖、羥丙基甲基纖維素（HPMC）和卡波姆為黏附材料，十八醇為漂浮材料，微晶纖維素為成型劑，制備丹參總酚酸黏附漂浮微丸?？疾熘苽涞?種黏附漂浮微丸的體外釋放及其在大鼠體內(nèi)生物利用度。結(jié)果 體外釋放試驗結(jié)果表明，空白微丸中丹酚酸B在4 h即釋放完全，而制備的2種黏附漂浮微丸的體外釋放時間達(dá)12 h。大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)研究結(jié)果表明，大鼠分別灌胃丹參總酚酸原料藥、丹參總酚酸殼聚糖微丸、丹參總酚酸HPMC微丸后，丹酚酸B在大鼠體內(nèi)Tmax分別為（12.00±2.74）min、（17.00±7.58）min、（27.00±12.55）min，丹參總酚酸殼聚糖微丸、丹參總酚酸HPMC微丸相對生物利用度分別為177.08%、172.03%。結(jié)論 丹參總酚酸黏附漂浮微丸在體外釋放緩慢，黏附漂浮微丸可延長藥物在體內(nèi)的滯留時間，提高丹參總酚酸在大鼠體內(nèi)的口服生物利用度。

關(guān)鍵詞：丹參總酚酸；生物黏附漂??；微丸；體外釋放；藥代動力學(xué)

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.019

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）06-0077-05

Study on in Vitro Release of Salvianolic Acid Bioadhesive Floating Pellets

and Pharmacokinetics in Rats

YANG Dan-dan， LI Ying， ZHU Chun-yan

Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College， Beijing 100193， China

Abstract： Objective To prepare salvianolic acid bioadhesive floating pellets； To prolong its residence time in vivo； To improve the oral bioavailability. Methods Salviae miltiorrhizae total phenolic acid adhering floating pellets were prepared by extrusion-spheronization. Chitosan， HPMC and carbomer were used as adherent material， stearyl alcohol was used as floating material and MCC as forming agent. The in vitro release of two adherent floating pellets were prepared and their bioavailability in rats were investigated. Results The results of in vitro release test showed that the salvianolic acid B in the blank pellets was completely released at 4 h， and the two adherent floating pellets prepared in vitro were released for 12 h. The results of pharmacokinetic studies in rats showed that after intragastric administration of salvianolic acid， salvianolic acid chitosan pellets and salvianolic acid HPMC pellets， Tmax were （12.00±2.74）min， （17.00±7.58）min and （27.00±12.55）min， respectively. The relative bioavailability of salvianolic acid chitosan pellets and salvianolic acid HPMC pellets were 177.08% and 172.03%， respectively. Conclusion Salvia total phenolic acid adherent floating pellets release slowly in vitro， and floating pellets can prolong the retention time in vivo and increase the oral bioavailability of salvianolic acid in rats.

Keywords： salvianolic acid； bioadhesive floating； pellets； release in vitro； pharmacokinetics

丹參為唇形科鼠尾草屬丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖，又名大紅袍、紅根赤參、血丹參等，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其活性成分主要分為兩大類，即脂溶性成分和水溶性成分。丹參總酚酸是丹參的水溶性提取物[1]，其中以丹酚酸B含量最高。

本課題組在前期對丹參總酚酸理化性質(zhì)的考察中發(fā)現(xiàn)，丹參總酚酸主要成分丹酚酸B的油水分配系數(shù)與pH值呈負(fù)相關(guān)，在胃部pH值條件下的油水分配系數(shù)明顯高于在腸中。油水分配系數(shù)越高越有利于藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。并且丹參總酚酸為酸性物質(zhì)，其在酸性條件下最穩(wěn)定。本課題組前期篩選出菠蘿葉提取物和葛根總黃酮生物黏附漂浮微丸的最佳處方，體內(nèi)外研究表明，制備的菠蘿葉提取物和葛根總黃酮黏附漂浮微丸具有良好的胃滯留效果和緩釋特性，達(dá)到了提高藥物口服生物利用度的目的[2-4]。因此，本研究將菠蘿葉提取物和葛根總黃酮黏附漂浮微丸的最佳處方應(yīng)用于丹參總酚酸，制備2種丹參總酚酸黏附漂浮微丸，延長丹參總酚酸在胃腸道的滯留時間，改善藥物吸收，從而提高生物利用度。

1 儀器、試藥與動物

LC-10AT高效液相色譜儀（日本島津），包括SPD-10AVP紫外檢測器、SCL-10AVP控制器、CTO-10ASV柱溫箱、CLASS-VP工作站；MBS-120擠出滾圓機(jī)（英國Caleva公司）；盤式干燥烘箱（英國Caleva公司）；HH. SY11-Ni2B電熱恒溫水浴鍋（北京長風(fēng)儀器儀表公司）；RC806D溶出試驗儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；BSA 224S-CW型天平（德國Sartorius公司）；UGC-12MF氮吹儀（北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司）。

丹參總酚酸提取物（西安小草植物科技有限公司，批號XC20170112），丹酚酸B對照品（上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號160928，HPLC純度≥98%），對香豆酸對照品（美國Sigma公司，批號1001108036，HPLC純度≥98%），殼聚糖（CTS，美國Sigma公司，CAS9012-76-4），卡波姆934P（美國BF Goodrich公司），十八醇（北京化學(xué)試劑公司），微晶纖維素PH-101（MCC，上海源葉生物科技有限公司），羥丙基甲基纖維素（HPMC K4M，美國卡樂康公司），鹽酸、甲醇、乙腈（美國Fisher公司，色譜級），其余試劑均為分析純。

SPF級6周齡SD雄性大鼠15只，體質(zhì)量（220±20）g，北京市維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號SDXK（京）2015-0001，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所SPF級動物房。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹酚酸B體外測定方法

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流動相：甲醇∶乙腈∶水（含0.3%磷酸）=30∶10∶60；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：286 nm；進(jìn)樣量：20 ?L。

2.1.2 線性關(guān)系考察

取丹酚酸B對照品2.54 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mL置于5 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，用0.45 ?m微孔濾膜過濾，分別取對照品溶液20 ?L注入高效液相色譜儀，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得丹酚酸B回歸方程：Y=23 346X-11 043，r2=0.999 9，線性范圍為2.032～65.024 ?g/mL。

2.1.3 方法回收率考察

精密稱取丹酚酸B適量，配制成2.032、16.256、65.024 ?g/mL低、中、高3個濃度的溶液，每個樣品配制5份，按上述色譜條件進(jìn)樣檢測，計算測得量，以實測值與理論值相比，計算方法回收率。結(jié)果在考察濃度范圍內(nèi)樣品回收率在98%～102%之間，表明方法回收率良好。

2.1.4 方法精密度考察

配制2.032、16.256、65.024 ?g/mL低、中、高3個濃度的溶液，分別于日內(nèi)重復(fù)測定5次，并連續(xù)測定5 d，求得日內(nèi)、日間RSD。結(jié)果日內(nèi)和日間精密度RSD均小于2%，表明精密度良好，符合體外分析方法要求。

2.2 微丸的制備方法

分別稱取丹參總酚酸原料藥、MCC、CTS、十八醇、HPMC、卡波姆，按等量遞加法混勻，過80目篩，加潤濕黏合劑不斷捏合，制成軟材。經(jīng)擠出機(jī)篩板以35 r/min轉(zhuǎn)速擠成直徑相同、光滑致密的條狀物；將條狀物置于滾圓機(jī)內(nèi)，1300 r/min滾圓5 min，直至滾制成丸；取出微丸，干燥，過篩，分別制得空白組微丸（MCC和丹參總酚酸原料藥）、CTS組微丸和HPMC組微丸。

2.3 微丸產(chǎn)率的測定

采用篩分法，經(jīng)擠出滾圓法制備的微丸干燥后取18～24目篩得到目標(biāo)微丸，計算產(chǎn)率。產(chǎn)率（%）=目標(biāo)微丸質(zhì)量÷投料量×100%。殼聚糖組微丸產(chǎn)率為48.39%±1.02%，HPMC組微丸產(chǎn)率為50.98%±1.87%。

2.4 微丸體外釋放度測定

參照2015年版《中華人民共和國藥典》（四部）附錄釋放度測定方法轉(zhuǎn)籃法：以脫氣處理的0.1 mol/L鹽酸900 mL為釋放介質(zhì)，轉(zhuǎn)速50 r/min，溫度（37±0.5）℃；精密稱取微丸約0.9 g，分別于1、2、4、6、8、10、12 h取釋放液2.0 mL，同時補(bǔ)加相應(yīng)釋放介質(zhì)2.0 mL，過0.45 ?m濾膜，棄去初濾液，取續(xù)濾液，HPLC測定藥物濃度，計算藥物累積釋放度。

2.4.1 微丸體外釋放曲線

與空白組微丸比較，CTS組微丸和HPMC組微丸中丹酚酸B的體外釋放無突釋現(xiàn)象，釋放速度明顯減緩，在體外可持續(xù)釋放12 h。見圖1、圖2。

2.4.2 藥物釋放模型的擬合

采用Excel2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。分別采用零級、一級、Higuchi和Ritger-Peppas方程對丹參總酚酸黏附漂浮微丸中丹酚酸B的體外釋放曲線進(jìn)行擬合，結(jié)果見表1、表2?？梢姡⒖偡铀狃じ狡∥⑼柚械し铀酈的釋放曲線經(jīng)一級釋放方程擬合相關(guān)性最好。

2.5 血漿樣品中丹酚酸B含量測定

2.5.1 色譜條件

同“2.1.1”項下色譜條件。

2.5.2 血漿處理方法

精密吸取200 ?L血漿，放入離心管中，加入內(nèi)標(biāo)對香豆酸20 ?L、2 mol/L鹽酸30 ?L，渦旋振蕩60 s，加入乙酸乙酯2 mL，渦旋振蕩90 s，12 000 r/min離心5 min，吸取上清液，精密吸取上層有機(jī)溶劑，常溫條件下氮?dú)獯蹈桑眉状?00 ?L復(fù)溶，渦旋20 s，12 000 r/min離心5 min，取20 ?L上清液進(jìn)樣測定。

2.5.3 方法學(xué)考察

2.5.3.1 專屬性考察

在上述色譜條件下，對空白血漿、空白血漿+丹酚酸B對照品及空白血漿+丹酚酸B對照品+內(nèi)標(biāo)對香豆酸分別進(jìn)樣檢測，色譜圖見圖3。對香豆酸、丹酚酸B的出峰時間分別為9.5、12.9 min。內(nèi)標(biāo)與丹酚酸B色譜峰互不干擾，峰形良好，無雜峰干擾，基線平穩(wěn)。

2.5.3.2 線性關(guān)系考察

取空白血漿200 ?L，加內(nèi)標(biāo)20 ?L，分別加不同濃度的丹酚酸B對照品標(biāo)準(zhǔn)液，按血漿處理方法，配成血漿中含0.25、0.5、1、2、4、8 ?g/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以丹酚酸B和對香豆酸峰面積比值為縱坐標(biāo)，丹酚酸B血藥濃度為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=0.244 3X-0.007 2，r2=0.999 3，線性范圍為0.25～8.0 ?g/mL。

2.5.3.3 精密度考察

取高、中、低濃度樣品，連續(xù)測定5次以計算日內(nèi)差異，連續(xù)測定5 d以計算日間差異。結(jié)果表明，樣品低、中、高3個濃度的日間、日內(nèi)精密度RSD均小于15%，符合生物樣品分析方法的精密度要求。

2.5.3.4 回收率考察

取大鼠空白血漿，制備丹酚酸B低、中、高3個濃度樣品，每個濃度配制5份，作為質(zhì)控樣品，進(jìn)行HPLC分析。以提取后的色譜圖峰面積與未經(jīng)提取直接進(jìn)樣獲得的色譜圖峰面積之比考察樣品提取回收率。結(jié)果表明，相對回收率在85%～115%之間，符合樣品回收率要求。

2.6 微丸在大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)考察

取健康大鼠15只，分為丹參總酚酸原料藥組、CTS組、HPMC組，每組5只，實驗前禁食，頸靜脈插管備用，次日按400 mg/kg丹參總酚酸原料藥分別灌胃給予丹參總酚酸原料藥、CTS微丸、HPMC微丸（采用自制大鼠微丸灌胃裝置，保證微丸以完整劑型到達(dá)大鼠胃部）。分別于給藥后5、10、15、30、45、60、90、120、180、240、360、480 min及12、24 h于頸靜脈取血0.5 mL，肝素鈉抗凝，立即以13 000 r/min離心5 min，分離出血漿，冷藏，備用。

采用WinNolin6.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件分別計算參比制劑和試驗制劑中丹酚酸B的Tmax、Cmax、AUC0→t等藥代動力學(xué)參數(shù)。大鼠口服丹參總酚酸原料藥及2組黏附漂浮微丸的藥代動力學(xué)參數(shù)見表3。結(jié)果表明，制備的黏附漂浮微丸與原料藥相比，生物利用度CTS組為177.08%，HPMC組為172.03%；達(dá)峰時間得到延長，制備的黏附漂浮微丸表現(xiàn)出一定的緩釋和促吸收作用。各組濃度-時間曲線見圖4。

3 討論

微丸為多單元給藥系統(tǒng)，與片劑、膠囊劑等單元劑型相比，可以避免單元系統(tǒng)控制不好時引起藥物的突釋。胃滯留劑型通過駐留制劑在胃中長時間釋放藥物，藥物一部分被胃吸收或在胃內(nèi)發(fā)揮作用，另一部分通過幽門噴入小腸再吸收。將藥物滯留在胃中可以延長其在整個胃腸道的轉(zhuǎn)運(yùn)時間，因而可改善藥物的生物利用度[5]。

本研究在制備微丸中選擇以CTS、HPMC、卡波姆為主要黏附性材料。CTS具有獨(dú)特的生理和化學(xué)特性，具有良好的生物黏附性、黏膜吸收促進(jìn)性、生物相容性及生物可降解性，且在酸性條件下易溶解，是一種優(yōu)良的生物黏附材料；HPMC除發(fā)揮生物黏附作用外，還是親水凝膠材料，在遇到胃液后形成一層膠體屏障，一方面可以維持制劑密度低于胃液，保持漂浮性，另一方面使藥物緩慢擴(kuò)散至表面而溶于介質(zhì)，使釋藥時間延長，從而使制劑具備良好的骨架緩釋作用；卡波姆934P作為高分子材料，分子中含有羧基或羥基，遇水后與黏膜糖蛋白分子相互纏結(jié)而維持長時間的生物黏附作用，起到定位給藥的作用[6-7]。

普通的胃漂浮制劑經(jīng)口給藥后必須一直保持胃內(nèi)容物的含量，患者應(yīng)盡可能多飲水使制劑漂浮在胃內(nèi)，否則將會被胃排空[8]。普通生物黏附經(jīng)口給藥制劑當(dāng)胃內(nèi)充滿液體及其他內(nèi)容物時，因不能與黏膜接觸而無法起到黏附作用；若黏附在胃黏膜后，胃內(nèi)充滿食物并蠕動時或胃黏膜不斷更新脫落及胃內(nèi)pH值變化時，制劑也會脫離胃黏膜而被胃排空[9-11]。本課題組設(shè)計的生物黏附漂浮微丸，微丸的黏附、漂浮協(xié)調(diào)作用，可以克服經(jīng)口給藥后胃漂浮制劑或生物黏附制劑分別單獨(dú)存在時的缺點(diǎn)，制劑既能在胃液充盈時漂浮，又可在胃液稀少時黏附于胃黏膜上，從而真正延長藥物在胃部的滯留時間。

與HPMC組微丸相比，CTS組微丸生物利用度較高，推測可能與CTS促進(jìn)藥物吸收有關(guān)，而HPMC組Tmax值較高，藥物的緩釋效果較好，推測與HPMC作為親水凝膠骨架材料起緩釋作用的機(jī)制有關(guān)。

本試驗的2種處方為本課題組研究的其他酚酸類物質(zhì)的最優(yōu)處方，在一定程度上使藥物實現(xiàn)了緩慢釋放，提高了口服生物利用度，但用于制備丹參總酚酸黏附漂浮微丸還有待改進(jìn)，下一步可以采用包衣技術(shù)使緩釋效果進(jìn)一步改善。

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（收稿日期：2017-12-07）

（修回日期：2017-12-22；編輯：陳靜）