ELISA法檢測(cè)不同條件下中華絨螯蟹中恩諾沙星的殘留量

徐逍　楊彩根　付監(jiān)貴等

摘要：水溫25 ℃時(shí)，在不同給藥次數(shù)、不同健康狀況條件下對(duì)中華絨螯蟹口灌恩諾沙星（10 mg/kg），應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法測(cè)定灌藥后5、10 min及0.5、1、2、4、8、12、24、48、96、168、240 h中華絨螯蟹血淋巴、肌肉、肝胰腺中恩諾沙星殘留量，用藥代動(dòng)力學(xué)軟件3P97計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)并擬合房室模型。結(jié)果表明：（1）單次和多次口灌（連續(xù)口灌3 d，1次/d）條件下，單次口灌分布和消除快于多次口灌，各組織中恩諾沙星峰值含量從高到低依次為：肝胰腺、血淋巴、肌肉；（2）單次口灌健康的和感染嗜水氣單胞菌的中華絨螯蟹后，與健康蟹相比，染菌蟹各組織中恩諾沙星含量較低、吸收較慢，但分布和消除快，恩諾沙星在染菌蟹各組織中的含量從高到低依次為：肝胰腺、肌肉、血淋巴；（3）3P97軟件分析結(jié)果表明，不同健康狀況及不同口灌次數(shù)下中華絨螯蟹血淋巴、肌肉、肝胰腺中恩諾沙星的代謝規(guī)律均符合一級(jí)吸收二室開(kāi)放模型。

關(guān)鍵詞：中華絨螯蟹；恩諾沙星；ELISA；藥代動(dòng)力學(xué)

中圖分類(lèi)號(hào)： TS207文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0399-05

收稿日期：2014-11-18

基金項(xiàng)目：江蘇省蘇州市應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目（編號(hào)：SYN201223）。

作者簡(jiǎn)介：徐逍（1989—），男，江蘇沭陽(yáng)人，碩士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品安全。E-mail： xuxiao_823@163.com。

通信作者：宋學(xué)宏，博士，副教授，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品安全。E-mail： songxh@suda.edu.cn。恩諾沙星（ENR）由德國(guó)拜爾公司創(chuàng)制，1987年上市，是動(dòng)物專(zhuān)用氟喹諾酮類(lèi)藥物[1]，它可以快速殺滅細(xì)菌或霉菌等具有DNA或RNA和蛋白質(zhì)合成能力的病原體，并具有毒性低、抗菌譜廣、細(xì)菌耐藥突變率低等特點(diǎn)[2]。但是ENR代謝緩慢，在動(dòng)物體的肌肉、肝臟和腎臟等組織中易殘留，長(zhǎng)期攝入可引起關(guān)節(jié)和軟骨損傷，造成泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)甚至神經(jīng)系統(tǒng)的損害[3]。

中華絨螯蟹（Eriocher sinensis）是我國(guó)發(fā)展迅速、經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的優(yōu)勢(shì)水產(chǎn)品，近年來(lái)其養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，其細(xì)菌性疾病也不斷暴發(fā)，ENR的頻繁使用不僅容易引起細(xì)菌的耐藥性，而且導(dǎo)致藥物殘留，影響水產(chǎn)品的質(zhì)量與安全。目前，實(shí)際生產(chǎn)中表明，不同的給藥方式對(duì)中華絨鰲蟹細(xì)菌性疾病的防治效果和藥物殘留有著重要影響[4]。此外，ENR在中華絨螯蟹上的給藥方案大多是根據(jù)健康機(jī)體的藥物代謝情況擬定的[5-8]，未考慮疾病因素對(duì)動(dòng)物代謝的影響。但在實(shí)際養(yǎng)殖過(guò)程中，多數(shù)抗菌藥物的使用對(duì)象是已患病的動(dòng)物，且有研究表明，疾病會(huì)造成動(dòng)物機(jī)體組織細(xì)胞的形態(tài)及生理代謝改變，從而影響機(jī)體對(duì)藥物的吸收、分布、轉(zhuǎn)化及排泄，影響藥物效應(yīng)[9-10]。因此，研究疾病條件下藥物在動(dòng)物體內(nèi)的代謝過(guò)程更具有臨床意義。然而，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)有關(guān)病理?xiàng)l件下中華絨螯蟹的藥代動(dòng)力學(xué)研究報(bào)道。為有效預(yù)防水產(chǎn)動(dòng)物的細(xì)菌性疾病、控制藥物殘留，本研究用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法進(jìn)行了不同健康狀況及不同口灌次數(shù)下ENR在中華絨螯蟹體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究，以期為水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治中合理使用ENR、有效控制中華絨鰲蟹養(yǎng)殖過(guò)程中常見(jiàn)的細(xì)菌性疾病、保障水產(chǎn)品安全提供更加科學(xué)的用藥依據(jù)。

1材料與方法

1.1藥品與試劑

恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品（ENR，98.0%），購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；分析純氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸、一水葡萄糖、活性炭、無(wú)水甲醇，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Tween-20、鄰苯二胺（OPD），購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；辣根酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司。

恩諾沙星鼠多抗由筆者所在實(shí)驗(yàn)室制備，試驗(yàn)用水為筆者所在實(shí)驗(yàn)室制備的三重蒸餾水。

磷酸鹽緩沖液（PBS，pH值7.4）：17 g氯化鈉，5.801 8 g磷酸氫二鈉，0.592 8 g磷酸二氫鈉，加三重蒸餾水定容至 2 000 mL。ACD抗凝劑：分別將1.32 g檸檬酸三鈉、0.48 g檸檬酸、1.47 g一水葡萄糖溶于100 mL三重蒸餾水中，再加入0.10～0.20 g活性炭，攪拌后靜置10 min過(guò)濾。

1.2儀器

高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Heraeus公司；Synergy HT酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司；QL-901漩渦混合器，江蘇省海門(mén)市麒麟醫(yī)用儀器廠；RJ-TDL-40B-Ⅱ型低速臺(tái)式大容量離心機(jī)，無(wú)錫市瑞江分析儀器有限公司；FSH-2型可調(diào)高速勻漿機(jī)，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；FA2004A型電子天平（精確至0.000 1 g），上海精天電子儀器有限公司；振蕩搖床，江蘇省海門(mén)市麒麟醫(yī)用儀器廠。

1.3試驗(yàn)動(dòng)物

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis），購(gòu)自蘇州市吳中區(qū)臨湖現(xiàn)代漁業(yè)發(fā)展有限公司，體質(zhì)量（22.6±1.9） g，購(gòu)回當(dāng)天用3 %氯化鈉水溶液浸泡3～5 min消毒殺菌，然后置于白色聚乙烯水箱（60 cm×40 cm× 35 cm）中，水溫（18±2） ℃，以自來(lái)水作為試驗(yàn)水源，充氣泵持續(xù)充氧。每天定時(shí)吸污、換水和投喂飼料，暫養(yǎng)1周后挑選健康個(gè)體作為試驗(yàn)動(dòng)物。

1.4菌株

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila），由江蘇省水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供（編號(hào)SC097）。

1.5方法

1.5.1人工感染嗜水氣單胞菌的中華絨螯蟹感染模型的制備將嗜水氣單胞菌接種于LB培養(yǎng)基上，經(jīng)28 ℃培養(yǎng)24 h后，分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%的無(wú)菌生理鹽水稀釋成含量為1×105、1×106、1×107、1×108、1×109 CFU/mL的菌懸液，在中華絨螯蟹第3步足與體壁關(guān)節(jié)膜肌肉處注射0.1 mL。將中華絨螯蟹在28 ℃水溫下養(yǎng)殖14 d，觀察并記錄中華絨螯蟹發(fā)病與死亡情況。試驗(yàn)期間每天按體質(zhì)量投喂1%的中華絨螯蟹商品飼料，間歇式充氧，每天換水1次，每次更換約1/3體積，保持水體溶氧量在5 mg/L左右。

1.5.2給藥及取樣25 ℃水溫下，將恩諾沙星按10 mg/kg劑量口灌給藥。試驗(yàn)前1 d在中華絨螯蟹第3步足與體壁關(guān)節(jié)膜肌肉處注射0.1 mL嗜水氣單胞菌（用“1.5.1”節(jié)試驗(yàn)得出的適宜菌量），設(shè)單次口灌健康蟹為組A、多次口灌健康蟹為組B、單次口灌人工感染嗜水氣單胞菌的中華絨螯蟹組為組C。其中多次口灌是連續(xù)口灌3 d，每天1次，于第3天口灌后計(jì)時(shí)采樣。

各試驗(yàn)組給藥后5、10 min及0.5、1、2、4、8、12、24、48、96、168、240 h時(shí)取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣6只中華絨螯蟹。先抽取血淋巴，每只蟹0.6 mL，移入裝有0.6 mL ACD抗凝劑的Eppendorf管中。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)在取完血淋巴后，立即解剖該組蟹并剝離心臟，隨即取肝胰腺、肌肉。各樣品編號(hào)后于-20 ℃冰箱保存。

1.5.3樣品前處理血淋巴樣品：樣品解凍后，充分混勻，吸取1 mL（0.5 mL血淋巴+0.5 mL ACD抗凝劑均勻混合物）樣品于10 mL離心管中，加入5 mL甲醇-PBS（體積比80 ∶20）混合提取液，高速均質(zhì)2 min后于冷凍離心機(jī)上4 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集上清液；沉淀重復(fù)上述均質(zhì)和離心操作，合并2次上清，再次于10 000 r/min、4 ℃高速離心10 min，收集上清液，稀釋后待測(cè)。

肌肉和肝胰腺樣品：樣品解凍后，稱(chēng)取1 g中華絨螯蟹肝胰腺或肌肉樣品，加5 mL甲醇-PBS（體積比80 ∶20）混合提取液，室溫下勻漿5 min后再渦旋2 min，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，收集上清液；沉淀重復(fù)上述提取和離心操作，合并2次上清液，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液稀釋后待測(cè)。

1.5.4樣品分析按照筆者所在實(shí)驗(yàn)室選定的包被抗原cOVA-ENR（256 ng/mL）及對(duì)照抗原cOVA（256 ng/mL）包被ELISA板[11]。洗滌、封閉等操作同文獻(xiàn)[11]，再將 1 ∶80 000 的抗血清分別與待測(cè)樣品及1 250、250、50、10、2、0.4 ng/mL ENR標(biāo)樣等體積混勻，同時(shí)設(shè)PBS對(duì)照，室溫振蕩孵育1 h后加入相應(yīng)的孔中，每個(gè)樣品設(shè)6個(gè)平行。根據(jù)ENR標(biāo)準(zhǔn)品的樣品孔和對(duì)照孔的D490 nm計(jì)算抑制率，并以抑制率和ENR標(biāo)樣濃度的半對(duì)數(shù)作圖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，計(jì)算樣品中的ENR含量。

1.5.5數(shù)據(jù)處理采用3P97藥物代謝動(dòng)力學(xué)全自動(dòng)分析軟件，將試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)計(jì)算機(jī)處理和統(tǒng)計(jì)分析后，得出藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)并自動(dòng)擬合及選擇最佳房室模型。藥-時(shí)曲線圖采用Excel 2013軟件繪制。

2結(jié)果與分析

2.1中華絨螯蟹嗜水氣單胞菌的感染模型

嗜水氣單胞菌感染中華絨螯蟹后，病蟹腹部向上時(shí)不能自行翻身，病蟹反應(yīng)遲鈍，行動(dòng)緩慢；腹腔內(nèi)出現(xiàn)腹水，心臟腫大，腸中食物少，部分病蟹步足出現(xiàn)抖動(dòng)現(xiàn)象；中華絨螯蟹出現(xiàn)的癥狀呈現(xiàn)明顯的濃度依賴(lài)性，其濃度越高，病蟹發(fā)病癥狀越嚴(yán)重。病蟹死亡情況統(tǒng)計(jì)表明，細(xì)菌含量為1×109 CFU/mL，中華絨螯蟹的成活率為26%；細(xì)菌含量為1×108 CFU/mL，中華絨螯蟹的成活率約為50%；細(xì)菌含量為1×107 CFU/mL，中華絨螯蟹的成活率為100%。因此選擇細(xì)菌含量為1×107 CFU/mL 作為中華絨螯蟹嗜水氣單胞菌感染模型的工作濃度。

2.2多次口灌健康中華絨螯蟹后主要組織中恩諾沙星的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)

單次及多次口灌給藥后，ENR在中華絨螯蟹血淋巴、肌肉、肝胰腺中的吸收、分布與代謝的過(guò)程如圖1所示，應(yīng)用3P97軟件對(duì)所測(cè)得的藥物水平-時(shí)間關(guān)系進(jìn)行一室、二室、三室模型的數(shù)據(jù)擬合。結(jié)果表明：不同給藥次數(shù)下，ENR在中華絨螯蟹各組織中的藥物濃度時(shí)間數(shù)據(jù)均可用一級(jí)吸收二室模型來(lái)描述。多次口灌給藥在總的劑量上是單次口灌給藥的3倍，即為30 mg/kg，多次口灌下血淋巴和肌肉的代謝規(guī)律基本同單次口灌，都是呈現(xiàn)先上升，到1 h時(shí)達(dá)峰隨后下降的規(guī)律，只是各個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)濃度值略高于單次口灌給藥。肝胰腺中，第3次給藥24 h內(nèi)藥物含量一直處于較高值，都超過(guò)6 μg/g，其中12 h時(shí)藥物濃度最高，為14.42 μg/g。藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1，可見(jiàn)單次口灌中華絨螯蟹血淋巴、肌肉、肝胰腺的吸收半衰期（T1/2Ka）分別為0.27、0.27、2.18 h，分布半衰期（T1/2α）分別為3.65、7.39、19.86 h，消除半衰期（T1/2β）分別為15.26、29.94、42.92 h；而多次口灌下3種組織中的T1/2Ka分別為0.26、0.24、0.07 h，T1/2α分別為3.81、9.04、23.05 h，T1/2β分別為18.50、33.21、48.41 h，可見(jiàn)單次口灌比多次口灌分布和消除都快。

2.3恩諾沙星在感染嗜水氣單胞菌的中華絨螯蟹體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)

由于在28 ℃條件下注射0.1 mL含量為1×107 CFU/mL的嗜水氣單胞菌時(shí)，中華絨螯蟹出現(xiàn)病癥但沒(méi)有發(fā)生死亡。因此選用這一劑量進(jìn)行中華絨螯蟹的ENR代謝動(dòng)力學(xué)研究。25 ℃下口灌給藥后，健康蟹、染菌蟹3種組織中ENR的平均藥-時(shí)曲線見(jiàn)圖1-a、圖2，主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。

3討論

3.1ELISA檢測(cè)方法研究恩諾沙星在中華絨螯蟹體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)的可行性

ELISA檢測(cè)方法既可用于定性篩選，又可用于定量分析，但是由于ELISA檢測(cè)方法使用抗體和酶等生物試劑、樣品基質(zhì)成分復(fù)雜及免疫反應(yīng)顯色系統(tǒng)精確機(jī)制尚不明確等原因，使得ELISA檢測(cè)方法可能出現(xiàn)一定程度的假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果[12]，所以ELISA檢測(cè)方法需要用靈敏度高、檢測(cè)限低、精確度較高的HPLC法確證評(píng)價(jià)。Yuan等比較了ELISA、高效液相色譜（HPLC）法在檢測(cè)豬肉中環(huán)丙沙星殘留時(shí)的靈敏度、精確性、準(zhǔn)確度，結(jié)果表明，ELISA法具有高檢測(cè)產(chǎn)出性，靈敏度、特異性均良好；而HPLC法具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，是一種較好的確證方法[13]。本研究所建立的ELISA檢測(cè)

方法在靈敏度、檢測(cè)限、準(zhǔn)確度等方面已滿足檢測(cè)中華絨螯蟹體內(nèi)ENR的要求[11]；此外，本研究在口灌條件下用ELISA法檢測(cè)中華絨螯蟹體內(nèi)各采樣點(diǎn)ENR含量與余開(kāi)等用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）研究的口灌10 mg/kg ENR在三疣梭子蟹體內(nèi)的含量[14]較為接近，代謝和消除規(guī)律也相似；另外，本試驗(yàn)用酶聯(lián)免疫分析法測(cè)定的結(jié)果表明，ENR在中華絨螯蟹肝胰腺的消除時(shí)間最長(zhǎng)，依據(jù)無(wú)公害食品水產(chǎn)品最高殘留限量（MRL）為50 μg/kg，計(jì)算可得ENR在感染蟹肝胰腺中殘留含量降至50 μg/kg水平的休藥期為375 ℃·d，這與王翔凌等關(guān)于HPLC法研究鹽酸沙拉沙星在鯽魚(yú)體內(nèi)的休藥期390 ℃·d的結(jié)果[15]較接近，表明ELISA檢測(cè)結(jié)果能夠與HPLC結(jié)果吻合，可以作為快速篩選檢測(cè)方法用于ENR檢測(cè)。

3.2給藥方式對(duì)藥物代謝的影響

水產(chǎn)動(dòng)物常用的給藥方式主要有肌肉注射、靜脈注射、口灌、混飼和藥浴等，同一藥物隨劑型、給藥方式的不同，生物利用度及生物效應(yīng)也會(huì)不同[16]。靜脈注射藥效最快，其次是肌肉注射、口灌、混飼和藥浴。在規(guī)模化集約化的池塘飼養(yǎng)中華絨螯蟹過(guò)程中，如果采用肌肉注射給藥，在臨床上不但工作量巨大，而且在給藥時(shí)對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物的應(yīng)激也很大，不利于中華絨螯蟹的生長(zhǎng)，因此肌肉注射給藥的方式可行性極小。藥浴和混飼給藥操作方便，但藥浴方法無(wú)法計(jì)算每只蟹的藥物劑量，藥代動(dòng)力學(xué)研究較少采用?；祜暦椒ù嬖谥捎谛窋z食的個(gè)體差異，導(dǎo)致個(gè)體之間攝取藥餌量不均勻等缺陷。本研究選擇口灌（口灌是口服的一種方式）方式研究ENR在中華絨螯蟹體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)規(guī)律更符合生產(chǎn)實(shí)際。

有研究表明，中華絨螯蟹口灌給藥方式下藥物的吸收和分布慢于肌肉注射和藥浴給藥[4]，可能是口灌給藥時(shí)，藥物從口灌至胃，首次循環(huán)要經(jīng)過(guò)肝胰腺，其次進(jìn)入體循環(huán)，而肌肉注射給藥時(shí)藥物直接通過(guò)開(kāi)放式循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入體內(nèi)各組織的分布，所以肌肉注射比口灌給藥吸收分布快。藥浴給藥時(shí)藥物進(jìn)入蟹體內(nèi)是一個(gè)滲透的過(guò)程，在體內(nèi)比口灌更易吸收和分布。本研究對(duì)單次口灌和多次口灌ENR在中華絨螯蟹體內(nèi)的比較研究發(fā)現(xiàn)，2種給藥方式下中華絨螯蟹血淋巴的分布半衰期分別為3.65、3.81 h，消除半衰期分別為15.26、18.50 h；肌肉中分布半衰期分別為7.39、9.04 h，消除半衰期分別為29.94、33.21 h，表明單次口灌比多次口灌分布和消除都快。由此說(shuō)明，用ENR預(yù)防細(xì)菌性疾病時(shí)，采用3～5 d的多次給藥方法，使ENR的有效濃度在中華絨螯蟹體內(nèi)保持較長(zhǎng)時(shí)間，預(yù)防效果會(huì)明顯好于單次給藥。

3.3感染嗜水氣單胞菌對(duì)恩諾沙星在中華絨螯蟹各組織中代謝速率的影響

本研究結(jié)果表明，ENR在人工感染嗜水氣單胞菌的中華絨螯蟹血淋巴、肌肉和肝胰腺中的代謝過(guò)程均可用一級(jí)吸收二室模型來(lái)描述，這與ENR在人工感染溶藻弧菌的三疣梭子蟹體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的研究結(jié)果[2]一致，也與恩諾沙星在健康的中華絨螯蟹體內(nèi)的代謝過(guò)程[5-7]較為一致。感染嗜水氣單胞菌的中華絨螯蟹各組織中ENR含量從高到低依次為肝胰腺、肌肉、血淋巴，與健康蟹各組織中ENR含量從高到低依次為肝胰腺、血淋巴、肌肉略有不同，可能與中華絨螯蟹感染嗜水氣單胞菌造成其肌肉組織松散、細(xì)胞膜損傷、通透性增加、藥物在肌肉組織中的滲透和積聚能力增強(qiáng)有關(guān)[17]。

3.4恩諾沙星對(duì)中華絨螯蟹細(xì)菌病的治療作用及其休藥期的制定

本研究應(yīng)用3P97軟件得到的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)表明，ENR在感染嗜水氣單胞菌的中華絨螯蟹體內(nèi)較健康組分布廣泛、消除迅速，但吸收緩慢，且染菌組各組織中ENR含量均低于健康組，這可能與嗜水氣單胞菌損傷各組織細(xì)胞有關(guān)，從而影響各組織對(duì)藥物的吸收。單次口灌ENR 10 mg/kg后，感染嗜水氣單胞菌的中華絨螯蟹血淋巴、肌肉、肝胰腺中的ENR含量分別在1.0、0.5、0.5 h 高于Roque等研究的ENR對(duì)141株弧菌的平均最低抑菌含量（0.45 μg/mL）[18]，且各組織中峰值含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于平均最低抑菌含量，說(shuō)明ENR對(duì)中華絨螯蟹嗜水氣單胞菌導(dǎo)致的細(xì)菌性疾病有較好的防治效果。中華絨螯蟹的肝胰腺和肌肉都是人們特別喜愛(ài)的可食組織，本試驗(yàn)用酶聯(lián)免疫分析法測(cè)定的結(jié)果表明，ENR在中華絨螯蟹肝胰腺中的消除時(shí)間最長(zhǎng)，依據(jù)無(wú)公害食品水產(chǎn)品最高殘留限量（MRL）為50 μg/kg，計(jì)算得ENR在感染蟹肝胰腺中殘留含量降至50 μg/kg水平的休藥期為375 ℃·d。

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