無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)技術(shù)在產(chǎn)前篩查中的臨床應(yīng)用

馮菊梅

摘 要：目的 探討無(wú)創(chuàng)DNA基因檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于產(chǎn)前篩查中的臨床價(jià)值及意義。方法 回顧性分析在我院2015年1月～2017年1月針對(duì)553例孕婦包括預(yù)產(chǎn)期年齡≥35歲的高齡產(chǎn)婦、唐篩結(jié)果為高風(fēng)險(xiǎn)、臨界風(fēng)險(xiǎn)或單項(xiàng)指標(biāo)異常、超聲軟指標(biāo)等孕婦。在充分知情同意，進(jìn)行遺傳咨詢后選擇胎兒無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果為高風(fēng)險(xiǎn)孕婦進(jìn)一步進(jìn)行染色體核型分析，對(duì)低風(fēng)險(xiǎn)孕婦進(jìn)行電話追蹤隨訪。結(jié)果 553例孕婦外周血中，541例低風(fēng)險(xiǎn)，12例高風(fēng)險(xiǎn)，在高風(fēng)險(xiǎn)病例中7例提示21三體異常；2例提示18號(hào)染色體異常；1例提示13三體異常；2例提示胎兒性染色體異常；無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)結(jié)果為高風(fēng)險(xiǎn)的12例孕婦，均進(jìn)行了羊水或臍血穿刺，7例21三體高風(fēng)險(xiǎn)中7例為47，XN，+21；2例18三體高風(fēng)險(xiǎn)者中1例為47，XN，+18，1例為46，XN；1例13三體高風(fēng)險(xiǎn)者中1例為47，XN，+13；2例性染色體異常中，1例為XXY，1例為45X。并對(duì)無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)陰性的出生新生兒進(jìn)行隨訪，未訴明顯異常。應(yīng)用無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)技術(shù)診斷胎兒染色體疾病的敏感度為100.00%，特異度為99.91%，假陰性率為0，假陰性率為0.09%，無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)對(duì)21三體，13三體和性染色體的符合率為100.00%，對(duì)18三體的符合率為50.00%。結(jié)論 無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)技術(shù)在產(chǎn)前篩查中準(zhǔn)確性高，假陽(yáng)性和假陰性低的優(yōu)點(diǎn)，可提高產(chǎn)前篩查效率，減少染色體疾病患兒的出生，是快捷、安全、較介入性產(chǎn)前診斷易于接受、值得推廣的安全可靠的產(chǎn)前篩查方法，是今后發(fā)展的必然趨勢(shì)。但無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)出的高風(fēng)險(xiǎn)孕婦，也必須進(jìn)行羊水穿刺進(jìn)一步確診。

關(guān)鍵詞：無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)技術(shù)；胎兒非整倍染色體疾?。粺o(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查；臨床應(yīng)用

中圖分類號(hào)：R440；R714.55 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.10.022

文章編號(hào)：1006-1959（2018）10-0073-04

Clinical Application of Noninvasive DNA Detection Technology in Prenatal Screening

FENG Ju-mei

（Guangyuan Maternal and Child Health Hospital，Guangyuan 628000，Sichuan，China）

Abstract：Objective To explore the clinical value and significance of noninvasive DNA gene detection technology in prenatal screening.Methods The retrospective analysis of 553 pregnant women，including pre maternity age≥35 years old，in our hospital in January 2017-January 2015，was high risk，critical risk or abnormal single index，and ultrasonic soft index.After fully informed consent，the prenatal detection of fetal noninvasive DNA was selected after genetic counseling.The chromosome karyotype analysis was carried out for the pregnant women with high risk，and the low risk pregnant women were followed up by telephone follow-up.Results In 553 pregnant women， 541 cases had low risk and 12 cases had high risk.Among the high risk cases，7 cases showed trisomy 21 abnormality，2 cases showed chromosome 18 abnormality，1 case showed 13 trisomy abnormality and 2 cases showed fetal sex chromosome abnormality.12 cases of high-risk non-invasive DNA test results were performed with amniocentesis or umbilical cord blood puncture.Among the 7 cases with high risk of trisomy 21，7 cases were of 47，XN，+21；Of the 2 cases of 18 trisomy high risk，1 were 47，XN，+18， 1 cases were 46，XN；1 cases 13 trisomy high risk patients，1 cases were 47，XN，+13；2 cases of sex chromosomal abnormalities，1 case was XXY and 1 was 45X.Follow up was also made for the neonates born with noninvasive DNA test，and no complaints were found.The sensitivity of the noninvasive DNA detection technique was 100.00%，the specificity was 99.91%，the false negative rate was 0，the false negative rate was 0.09%，the coincidence rate of noninvasive DNA prenatal detection for 21-3 body，13-3 body and sex chromosome was 100.00%，and the coincidence rate for 18-3 body was 50.00%. Conclusion Non invasive DNA detection technique has the advantages of high accuracy，false positive and low false negative in prenatal screening.It can improve the efficiency of prenatal screening and reduce the birth of children with chromosomal diseases.It is a safe and reliable prenatal screening method which is easy to be accepted and worthy of popularization.It is an inevitable trend in the future development.But noninvasive DNA detection of high-risk pregnant women must also be further diagnosed by amniocentesis.

Key words：Noninvasive DNA detection technology；Fetal aneuploidy diseases；Noninvasive prenatal screening；Clinical application

我國(guó)是出生缺陷的高發(fā)國(guó)。據(jù)2012年中國(guó)出生缺陷防治報(bào)告顯示，目前我國(guó)出生缺陷率約為5.6%，每年新增出生缺陷兒約90萬(wàn)例，染色體疾病是最為嚴(yán)重的出生缺陷之一[1]。染色體異常造成的出生缺陷，存活下來(lái)的出生患兒多為終生殘疾或智力障礙，無(wú)法治愈，由此給社會(huì)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，對(duì)家庭造成的心理負(fù)擔(dān)和精神痛苦更是無(wú)法用金錢來(lái)衡量。染色體異常中最為常見(jiàn)，包括21三體綜合征、18三體綜合征、13三體綜合征及Turner綜合征，但迄今為止尚無(wú)有效治療手段。目前只能通過(guò)產(chǎn)前檢測(cè)預(yù)防患兒出生。臨床二級(jí)預(yù)防出生缺陷的主要方法是通過(guò)血清學(xué)篩查，但目前國(guó)內(nèi)臨床應(yīng)用比較廣泛的孕中期產(chǎn)前篩查模式，是通過(guò)孕婦血清標(biāo)志物水平間接反映胎兒情況，存在一定的假陽(yáng)性和假陰性。 侵入性絨毛、羊水/臍血穿刺可能造成流產(chǎn)，感染等風(fēng)險(xiǎn)。 無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)技術(shù)的臨床開(kāi)展，無(wú)疑是一個(gè)不錯(cuò)的選擇，它具有無(wú)創(chuàng)優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，將對(duì)21、18、13三體綜合癥的檢出率提高到99%，作為一種新的近似于產(chǎn)前診斷的產(chǎn)前篩查技術(shù)，降低出生缺陷。對(duì)2015年1月～2017年1月我院產(chǎn)科進(jìn)行無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)的孕婦553例，進(jìn)行檢測(cè)研究分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年1月～2017年1月在廣元市婦幼保健院產(chǎn)科進(jìn)行無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)的孕婦553例。年齡19～38歲，平均年齡（29.88±2.31）歲，孕周13～22+6周，平均孕周（6.50±1.89）周，單胎540例、雙胎13例。其中87例是產(chǎn)篩高風(fēng)險(xiǎn)含高齡預(yù)產(chǎn)期孕婦，年齡≥35周歲；243例臨界風(fēng)險(xiǎn)或單項(xiàng)指標(biāo)異常；29例直接無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)（含錯(cuò)過(guò)唐篩時(shí)間者）；194例超聲染色體軟指標(biāo)：如心室強(qiáng)回聲、NT異常、脈絡(luò)叢囊腫等。對(duì)產(chǎn)篩高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦均得到遺傳咨詢及充分的告知并了解了無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)技術(shù)的局限性及風(fēng)險(xiǎn)性，并簽署知情同意書(shū)。對(duì)于無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)出的高風(fēng)險(xiǎn)結(jié)果再進(jìn)行羊水及臍血培養(yǎng)和核型分析以明確診斷。

1.2方法 標(biāo)本采集采用EDTA真空采血管采集靜脈血5 ml，于2～8 C°保存，在2 h內(nèi)離心分離血漿提取DNA，在冷鏈條件下運(yùn)送到四川省婦幼保健院檢驗(yàn)中心進(jìn)行胎兒DNA分析。實(shí)驗(yàn)室提取母體外周血血漿中游離DNA片段，進(jìn)行高通量測(cè)序，將每條DNA片段測(cè)序所得的序列與人類基因組圖進(jìn)行比對(duì)，從中篩選每一條染色體上完全相吻合DNA序列總數(shù)。根據(jù)生物學(xué)統(tǒng)計(jì)原理，進(jìn)行生物信息分析，確定胎兒染色體是否存在非整倍性變化的風(fēng)險(xiǎn)值。產(chǎn)后隨訪：對(duì)所有檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性的孕婦，追蹤妊娠結(jié)局。同時(shí)對(duì)于檢測(cè)結(jié)果為陰性的孕婦做好觀察隨訪，確定無(wú)漏診率。

2結(jié)果

2.1唐氏篩查結(jié)果 2015年1月～2017年1月，在我院產(chǎn)科進(jìn)行7853例孕婦唐氏篩查后共有高風(fēng)險(xiǎn)432例，高風(fēng)險(xiǎn)率5.50%，其中21三體337例，陽(yáng)性率4.30%，18三體59例，陽(yáng)性率0.75%，開(kāi)放性神經(jīng)管缺陷（ONTD）高風(fēng)險(xiǎn)36例，陽(yáng)性率0.45%。

2.2三種檢測(cè)方法結(jié)果對(duì)比 在所有無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)的553例孕婦外周血中，541例提示低風(fēng)險(xiǎn)，12例提示高風(fēng)險(xiǎn)。高風(fēng)險(xiǎn)孕婦進(jìn)行羊水/臍血的檢測(cè)結(jié)果為1例陰性，其余11例與無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)結(jié)果一致，見(jiàn)表1。

2.3無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)異常結(jié)果與羊穿核型分析比較 12例無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)對(duì)21三體，13三體和性染色體的符合率為100.00%，對(duì)18-3體的符合率為50.00%，見(jiàn)表2。

2.4 隨訪結(jié)果 541例無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)低風(fēng)險(xiǎn)的孕婦均已完成電話隨訪541例，已經(jīng)出生胎兒541例，目前家屬口述正常健康；12例無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦依據(jù)染色體核形分析異常結(jié)果引產(chǎn)11例，其中7例胎兒明顯畸形，4例胎兒畸形不明顯的分別為47，XN， +21（3例）和45.X.（1例）。1例無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦依據(jù)染色體核形分析1例為46XN，目前已經(jīng)出生胎兒家屬口述正常健康。應(yīng)用無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)技術(shù)診斷胎兒染色體疾病的敏感度為100.00%（11/11），特異度為99.91%（540/541），假陰性率為0（0/553），假陰性率為0.09%（1/553），無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)對(duì)21三體，13三體和性染色體的符合率為100.00%，對(duì)18三體的符合率為50.00%。

3討論

染色體數(shù)目異?；蚪Y(jié)構(gòu)異常所致的疾病稱為染色體疾病，染色體疾病患者常表現(xiàn)為智力低下，發(fā)育遲緩，雖然醫(yī)療技術(shù)在不斷進(jìn)步，但目前為止，染色體異常還沒(méi)有有效的治療方法[2]。胎兒染色體三體是孕婦需要進(jìn)行產(chǎn)前篩查的一個(gè)主要原因，21三體是胎兒三體綜合征的最常見(jiàn)類型，每年的發(fā)病率為1/800-1/600[3]。本研究發(fā)現(xiàn)7例21三體綜合征，2例18三體綜合征，1例13三體綜合征，主要臨床表現(xiàn)為多發(fā)畸形，2例性染色體異常超聲下未見(jiàn)明顯異常。目前產(chǎn)前篩查及產(chǎn)前診斷成為避免染色體疾病患兒出生的重要手段之一。

近十余年，我國(guó)在預(yù)防出生缺陷方面做了大量卓有成效的工作，結(jié)合血清學(xué)篩查、超聲檢查和產(chǎn)前診斷，大大降低了出生缺陷的發(fā)生率。但目前應(yīng)用最為廣泛的中孕期三聯(lián)血清學(xué)產(chǎn)前篩查，它針對(duì)特定的沒(méi)有任何相應(yīng)疾病提示的人群（如所有的孕婦人群），通過(guò)檢查將其中患某一疾病可能性較大的高危人群篩選出來(lái)，以進(jìn)行其后的診斷性檢查，減少胎兒的丟失率[4]。血清學(xué)篩查在三體綜合征的診斷及某些出生缺陷篩查有一定的應(yīng)用價(jià)值。但是中孕期三聯(lián)血清學(xué)篩查技術(shù)仍然存在較低的檢出率（70%）和較高的假陽(yáng)性率（5%）[5]。較低的檢出率導(dǎo)致“漏診”的發(fā)生，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)；而較高的假陽(yáng)性率增加了不必要的侵入性產(chǎn)前診斷，給受檢孕婦帶來(lái)了極大的心理負(fù)擔(dān)，增加了正常胎兒丟失的風(fēng)險(xiǎn)，大大降低了產(chǎn)前診斷的依從性。

本組研究中553例血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)孕婦經(jīng)無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)結(jié)果異常為12例，羊水穿刺、細(xì)胞培養(yǎng)、胎兒染色體核型分析確診染色體異常11例，其中包括21三體綜合征7例、18三體2例，13三體1例，性染色體異常2例。

胎兒無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)是利用大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)對(duì)母體外周血中的游離DNA進(jìn)行深度測(cè)序，獲取胎兒染色體信息的方法，從而得出染色體數(shù)目異常風(fēng)險(xiǎn)程度的判斷。新一代測(cè)序技術(shù)的新型無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)，對(duì)孕婦外周血中存在的胎兒游離DNA進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)生物信息學(xué)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)胎兒染色體是否存在21、18、13號(hào)染色體三體，與血清學(xué)篩查相比，其準(zhǔn)確性和特異性較高[6]。游離胎兒DNA主要來(lái)源于胎盤組織，其在母血體血漿中的含量可能與胎盤屏障功能關(guān)系密切。如果存在胎盤發(fā)育不良、胎盤破損等胎盤屏障功能障礙，可能會(huì)導(dǎo)致母體血漿中游離胎兒DNA含量下降而影響檢測(cè)結(jié)果[7]。本研究中發(fā)現(xiàn)12例無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)異常孕婦中羊水穿刺染色體正常為1例，11例篩查結(jié)果與羊水穿刺結(jié)果相一致，敏感度為100.00%（11/11），特異度為99.91%（540/541），假陰性率為0（0/552），假陰性率為0.09%（1/552），無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)對(duì)21三體，13三體和性染色體的符合率為100.00%，對(duì)18三體的符合率為50.00%。相比于血清學(xué)篩查，無(wú)創(chuàng)DNA篩查更加準(zhǔn)確，誤診率低，有效地避免不必要的侵入性產(chǎn)前診斷。

但胎兒無(wú)創(chuàng)DNA測(cè)序技術(shù)有一定的局限性，主要表現(xiàn)：①對(duì)染色體三體疾病中的雙胎，多胎情況，檢測(cè)技術(shù)的靈敏度與特異性可能會(huì)下降；②孕婦1年內(nèi)接受過(guò)異體輸血、移植手術(shù)、異體細(xì)胞治療等；③篩查的目標(biāo)疾病少，僅對(duì)21三體，18三體，13三體整倍體異常，不能檢測(cè)出胎兒染色體異位、倒位，微缺失等染色體結(jié)構(gòu)異常疾病，且對(duì)三體疾病中存在部分嵌合體，檢測(cè)存在難度[8]；④孕婦本人為染色體疾患患者或攜帶者；⑤孕期合并惡性腫瘤；如無(wú)法檢出可由細(xì)胞遺傳學(xué)方法檢出的其他染色體結(jié)構(gòu)異常，只對(duì)特定染色體檢出率高。篩查高風(fēng)險(xiǎn)結(jié)果還是需要經(jīng)羊水穿刺或絨毛，臍血穿刺給予確認(rèn)。

我國(guó)全國(guó)產(chǎn)前診斷技術(shù)專家于2012年就無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了論證。邊旭明等[9]指出，該檢測(cè)技術(shù)是一種“近似于診斷水平”、“目標(biāo)疾病指向精確”的產(chǎn)前篩查，應(yīng)與現(xiàn)有的產(chǎn)前篩查體系相結(jié)合，準(zhǔn)確把握臨床適用人群，包括：①有介入性產(chǎn)前診斷先兆流產(chǎn)、發(fā)熱、有出血傾向、感染未愈等禁忌證者；②產(chǎn)篩高危或臨界風(fēng)險(xiǎn)高危孕婦；③珍貴兒，知情后拒絕介入性產(chǎn)前診斷的孕婦；④對(duì)介入性產(chǎn)前診斷極度焦慮的孕婦；⑤就診時(shí)處于較大孕周，超出目前產(chǎn)前篩查范圍的孕婦。目前無(wú)法對(duì)其余的染色體進(jìn)行檢測(cè)，且不能分析染色體結(jié)構(gòu)上的異常。相比于血清學(xué)篩查，其費(fèi)用較高，無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)技術(shù)尚未全面普及。如何對(duì)它的應(yīng)用范圍、技術(shù)局限有清晰的認(rèn)識(shí)、如何對(duì)患者進(jìn)行正確的臨床指導(dǎo)，有賴于進(jìn)一步的研究和經(jīng)驗(yàn)積累。正確有效的咨詢能夠使患者充分了解各項(xiàng)技術(shù)的利弊并選擇最有利于自身的方案.除此之外，本研究發(fā)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)技術(shù)對(duì)于性染色異常的檢出率高達(dá)100.00%。

因此，本研究建議首先可通過(guò)傳統(tǒng)的血清學(xué)篩查從廣大普通孕婦人群中發(fā)現(xiàn)高危者，然后采用無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)技術(shù)對(duì)這些高危者進(jìn)行篩查，對(duì)異常者再進(jìn)一步進(jìn)行介入性手術(shù)，同時(shí)向孕婦充分解釋這些方法的可行性、有效性、局限性和相應(yīng)結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)，由知情權(quán)衡后個(gè)體化選擇。這項(xiàng)技術(shù)有效規(guī)避了流產(chǎn)和感染帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，并可極大降低孕婦及家屬的心理負(fù)擔(dān)，代表了當(dāng)前產(chǎn)前檢測(cè)和防止先天性缺陷兒出生的最新發(fā)展方向。隨著二胎政策的開(kāi)發(fā)，高齡孕婦的增多，對(duì)于出生缺陷的防控也是重中之重，雖然無(wú)創(chuàng)DNA高風(fēng)險(xiǎn)結(jié)果仍需其他產(chǎn)前診斷技術(shù)進(jìn)行確診，但它在孕婦產(chǎn)檢過(guò)程中減少了孕婦對(duì)羊膜腔穿刺技術(shù)的恐懼，而且無(wú)創(chuàng)DNA取代血清學(xué)篩查是趨勢(shì)，對(duì)于產(chǎn)前篩查來(lái)說(shuō)無(wú)創(chuàng)是一項(xiàng)重要的技術(shù)補(bǔ)充手段，無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)無(wú)疑是一個(gè)充滿活力的全新的發(fā)展方向。

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收稿日期：2018-2-2；修回日期：2018-2-15

編輯/李樺