Survivin在不同TNM分期肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及意義

黨存曙，王 涵，劉大鵬，劉志春，邊 佺

(1.中國石油天然氣集團(tuán)公司中心醫(yī)院，河北 廊坊 065000；2.天津醫(yī)院，天津 300211)

原發(fā)性肝癌多起病隱匿，預(yù)后較差，是目前世界上癌癥相關(guān)死亡的第二大惡性腫瘤[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年新發(fā)原發(fā)性肝癌約748 300例，死亡695 900例，新發(fā)與死亡病例中的50%以上發(fā)生在中國[2]。肝細(xì)胞癌是肝癌中最主要的病理類型，生存率極低。生存素(Survivin)是近年發(fā)現(xiàn)的抑制蛋白家族新成員，可抑制細(xì)胞凋亡，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂、促進(jìn)腫瘤血管生長等功能，密切影響著腫瘤的分化及增殖[3]。研究發(fā)現(xiàn)，Survivin在結(jié)腸癌[4]、甲狀腺癌[5]、肺癌[6]等多種腫瘤中異常表達(dá)，在肝癌組織及外周血中的表達(dá)也有報(bào)道[7]。本研究通過檢測Survivin在不同TNM分期原發(fā)性肝癌組織、癌旁組織中的表達(dá)情況，探討了其與肝細(xì)胞癌分期的關(guān)系，旨在為肝細(xì)胞癌的化學(xué)診斷提供更多參考依據(jù)。

1 臨床資料

1.1組織標(biāo)本來源 收集2011年9月—2016年12月于中國石油天然氣集團(tuán)公司中心醫(yī)院行肝癌手術(shù)切除且病理分型為肝細(xì)胞癌的40例患者癌組織及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本，其中男31例，女9例；年齡33～70(51.42±8.33)歲；TNM臨床分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期14例，Ⅲ期11例，Ⅳ期4例；患者術(shù)前均未進(jìn)行放化療等抗腫瘤治療，癌旁組織為癌灶旁2～3 cm的肝臟組織，部分標(biāo)本為肝硬化組織。另取同期因肝臟損傷手術(shù)或肝血管瘤手術(shù)切除的10例患者正常肝組織標(biāo)本作為對(duì)照，其中男8例，女2例；年齡32～69(51.45±8.38)歲。

1.2試劑及儀器 一抗Survivin兔抗人單克隆抗體及免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購自美國羅氏公司。

1.3研究方法 采用免疫組織化學(xué)法檢測Survivin在各期癌組織、癌旁組織及正常肝組織中的表達(dá)。

1.3.1組織標(biāo)本切片制作 術(shù)后組織標(biāo)本經(jīng)含4%多聚甲醛的磷酸緩沖鹽(PBS)溶液灌流，于4 ℃下固定2h后，放入同溫度下4%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液中脫鈣，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。

1.3.2免疫組化染色 常規(guī)烤片、脫蠟至水、室溫冷卻，PBS封閉15 min，山羊血清封閉15 min，一抗(Survivin 濃度為1∶100)4 ℃冰箱孵育過夜，次日PBS沖洗，滴加二抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色、復(fù)染、脫水、透明、干燥封片。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，光學(xué)顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)并攝片。

1.4結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 所有切片由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師進(jìn)行評(píng)價(jià)，意見不一致時(shí)協(xié)商統(tǒng)一。①陽性細(xì)胞計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：隨機(jī)選取每張切片的5個(gè)高倍視野觀察，Survivin表達(dá)于肝細(xì)胞的胞核及胞漿，以陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)≤5%計(jì)0分，5%<陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)≤25%計(jì)1分，25%<陽性細(xì)胞數(shù)≤50%計(jì)2分，50%<陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)≤75%計(jì)3分，陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)>75%計(jì)4分。②染色強(qiáng)度計(jì)分：細(xì)胞不著色計(jì)0分，細(xì)胞著色為淺黃色計(jì)1分，細(xì)胞著中黃色或棕色且無背景著色計(jì)2分，細(xì)胞著深棕色或棕褐色且無背景著色計(jì)3分。③依據(jù)兩項(xiàng)計(jì)分?jǐn)?shù)值相乘結(jié)果判斷切片染色的陽性等級(jí)：0～1分為陰性，2～4分為弱陽性(+)，5～8分為陽性()，9～12分為強(qiáng)陽性()。切片陽性表達(dá)率(%)=陽性(弱陽性+陽性+強(qiáng)陽性)表達(dá)例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以例(%)表示，率的比較采用2檢驗(yàn)，趨勢檢驗(yàn)應(yīng)用趨勢2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1Survivin在肝細(xì)胞癌組織、癌旁組織及正常肝組織中的表達(dá)情況 Survivin在正常肝組織中未見表達(dá)(見圖1)；在癌旁組織表達(dá)較少(見圖2)，陽性表達(dá)率為27.5%(11/40)；在肝細(xì)胞癌組織中大量表達(dá)(見圖3)，陽性表達(dá)率為80.0%(32/40)。Survivin在肝細(xì)胞癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于正常肝組織及癌旁組織(P均<0.05)。

圖1 Survivin在正常肝組織的表達(dá)(DAB，×100)

圖2 Survivin在癌旁組織的表達(dá)(DAB，×100)

圖3 Survivin在肝細(xì)胞癌組織的表達(dá)(DAB，×100)

2.2Survivin在不同TNM分期肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)情況 Survivin在不同TNM分期肝細(xì)胞癌組織中均有陽性表達(dá)，見圖4～7；且隨著TNM分期的增加，Survivin陽性表達(dá)率呈逐漸增高的趨勢(P<0.05)，見表1。

圖4 Survivin在TNMⅠ期癌組織中的表達(dá)(DAB，×100)

2.3Survivin在不同TNM分期肝細(xì)胞癌對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況 Survivin在不同TNM分期肝細(xì)胞癌癌旁組織中的陽性表達(dá)率隨分期的增加呈增高的趨勢(P<0.05)。見表2。

圖5 Survivin在TNMⅡ期癌組織中的表達(dá)(DAB，×100)

圖6 Survivin在TNM Ⅲ期癌組織中的表達(dá)(DAB，×100)

圖7 Survivin在TNM Ⅳ期癌組織中的表達(dá)(DAB，×100)

表1 Survivin在不同TNM分期肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)情況 例(%)

表2 Survivin在不同TNM分期肝細(xì)胞癌對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況 例(%)

3 討 論

原發(fā)性肝癌的發(fā)病率較高，其較低的早期確診率多使患者失去手術(shù)機(jī)會(huì)，而高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率大大降低了患者生存率[8]。目前原發(fā)性肝癌化學(xué)診斷的主要檢測指標(biāo)是血清腫瘤標(biāo)志物，其中甲胎蛋白(AFP)是廣泛應(yīng)用的血清蛋白質(zhì)腫瘤標(biāo)志物之一，但因其靈敏度較低，在一些非腫瘤性肝病、生殖系統(tǒng)和胃腸道惡性腫瘤中也經(jīng)常會(huì)異常升高，因此亟待發(fā)現(xiàn)新型的腫瘤標(biāo)記物。

Survivin基因定位于染色體17q25，編碼產(chǎn)生一個(gè)分子質(zhì)量為16.5 ku的結(jié)構(gòu)獨(dú)特蛋白，表達(dá)在癌細(xì)胞中的胞漿及細(xì)胞核。Survivin僅有BIR結(jié)構(gòu)域而無鋅指結(jié)構(gòu)是其與抑制蛋白家族中其他蛋白的不同之處，其是目前發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的凋亡抑制蛋白[9]。研究發(fā)現(xiàn)，Survivin致病機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路，直接抑制凋亡酶(caspase)發(fā)揮抗凋亡作用，上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)，參與腫瘤血管形成等有關(guān)[10]，這些機(jī)制有效抑制了腫瘤細(xì)胞的凋亡，在腫瘤擴(kuò)散、浸潤、發(fā)展過程中起到舉足輕重的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者的生存率隨Survivin的高表達(dá)有降低趨勢，并且與化療抵抗、腫瘤復(fù)發(fā)和腫瘤患者生存期有關(guān)，因而該蛋白成為腫瘤分子靶向治療的目標(biāo)之一[11]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Survivin蛋白在肝細(xì)胞癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織及正常肝組織，且陽性表達(dá)率有隨肝癌TNM分期增加上升的趨勢，與Jin等[12]研究結(jié)果一致。原發(fā)性肝癌是原癌基因激活、抑癌基因受抑制、凋亡過程受阻等多因素共同作用所致，由此推測隨著肝癌的惡化，Survivin在癌組織中的表達(dá)逐漸增多，放大凋亡抑制作用，促進(jìn)腫瘤惡化及擴(kuò)散。另外Survivin在癌旁組織中的陽性表達(dá)率雖然明顯低于癌組織，但其陽性表達(dá)率也有隨著腫瘤分期的升高而有增高的趨勢，且Ⅳ期肝癌的癌旁組織中有明顯陽性()表達(dá)，或許表明雖然癌旁組織暫未發(fā)現(xiàn)異型性的腫瘤細(xì)胞，但頗具腫瘤特征的凋亡抑制改變已經(jīng)產(chǎn)生,促進(jìn)了腫瘤組織的局部擴(kuò)散，癌旁組織的細(xì)胞功能特性已明顯不同于正常組織。Morinaga等[13]的研究表明，正常肝組織中Survivin有少量表達(dá)，而本研究中正常肝組織中未見Survivin表達(dá)，可能與這部分組織標(biāo)本數(shù)量較少及手術(shù)取材部位選擇的偶然性有關(guān)。

綜上所述，Survivin在肝細(xì)胞癌組織中有大量表達(dá)，且隨腫瘤TNM分期的增加，其在癌組織及癌旁組織中的陽性表達(dá)率有增高的趨勢，為研究Survivin在肝細(xì)胞癌化學(xué)診斷方面應(yīng)用的可能性提供了理論基礎(chǔ)及依據(jù)。