谷氨酸誘導大鼠胃Cajal間質細胞自噬模型的建立*

譚人千， 張 智▲， 寧海恩， 張麗敏， 王 遠， 凌江紅, 2△

(1廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院， 廣西 南寧 530021；2上海市浦東新區(qū)周浦醫(yī)院， 上海 200120)

大量研究表明[1]，胃腸Cajal間質細胞(interstitial cells of Cajal，ICCs)作為胃腸活動的起搏者和調節(jié)者廣泛分布于胃腸道，并作為胃腸道內神經傳遞的中介，參與神經興奮的傳遞。ICCs的增殖、分化以及數(shù)量和結構的改變，可導致胃腸動力障礙性疾病，如功能性消化不良、胃輕癱、假性腸梗阻和胃食管反流病等。自噬是機體內一種保護性機制，在應激狀態(tài)下可將損傷的細胞器和細胞進行清理，維持機體的穩(wěn)態(tài)。當細胞自噬過度時可啟動細胞程序性死亡，從而導致細胞數(shù)量的減少，因此從自噬方面研究ICCs對理解胃腸動力障礙性疾病的機制有重要意義。本課題組前期動物實驗已證明ICCs自噬可導致功能性消化不良[2-3]，因此構建ICCs自噬模型為進一步研究胃腸動力障礙的機制提供細胞模型基礎。目前，谷氨酸的興奮性毒性已得到證明，并且已有谷氨酸誘導神經元自噬損傷的模型[4],但尚缺乏構建ICCs自噬的模型。為此，本研究用谷氨酸對胃ICCs進行干預，通過CCK-8法檢測細胞活力，透射電鏡檢測自噬體和超微結構的變化，Western blot和免疫熒光實驗檢測自噬標志蛋白LC3的表達，進一步探討ICCs自噬模型的建立。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

SPF級SD大鼠30只，雌雄不限，體重200 g左右，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(桂)2014-0002。

2 主要試劑

M199培養(yǎng)基(HyClone)；胎牛血清(Gibco)；Ⅱ型膠原酶、大鼠干細胞因子(stem cell factor，SCF)和L-谷氨酸(Sigma)；胰蛋白酶、青-鏈霉素混懸液、D-Hanks緩沖液和抗熒光淬滅封片液(杭州吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司)； CCK-8試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒、Western blot的I抗稀釋液及DAPI溶液(即用型)(碧云天生物技術研究所)；抗兔IgG和兔抗鼠微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)抗體(Novus)；兔抗大鼠c-Kit蛋白多克隆抗體(Pierce)； Dylight 488 Conjugated Goat anti-Rabbit IgG(聯(lián)科生物公司)；抗GAPDH抗體(SAB)；抗兔及抗小鼠熒光 II 抗(LI-COR Biosciences)。

3 方法

3.1原代培養(yǎng)大鼠胃ICCs 參照參考文獻[5-6]，取SD大鼠，雌雄不限, 禁食不禁水8 h，10%水合氯醛按3 mL/kg腹腔注射麻醉后無菌開腹取胃, 沿胃小彎剪開, 用D-Hanks緩沖液(含雙抗)清洗3遍, 在解剖顯微鏡下用銳性鑷子剝去胃黏膜層, 將胃肌條剪碎至0.1 cm×0.1 cm大小，加入Ⅱ型膠原酶消化液(用不含血清的M199培養(yǎng)基配制，終濃度1.3 g/L)于37 ℃恒溫水浴箱中消化胃組織碎塊50 min左右, 1 000 r/min、5 min離心棄上清，D-Hanks緩沖液重懸并吹打5 min, 再離心棄上清, M199完全培養(yǎng)基(含M199培養(yǎng)基、10%胎牛血清、1%雙抗、0.5 mg/L兩性霉素B和25 μg/L干細胞因子)重懸細胞并過200目篩網(wǎng), 加入等量的Ficoll 400密度梯度液，1 000 r/min 離心7 min, 最后調整細胞密度為1×109/L, 每個25 cm2的培養(yǎng)瓶接種4 mL，于37 ℃、CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，24 h后換液, 沖去未貼壁的細胞, 此后每隔3 d換液1次。取對數(shù)生長期細胞進行下一步實驗。

3.2ICCs的免疫熒光鑒定 取對數(shù)生長期細胞，經冰凍甲醇固定10 min, 5%脫脂奶粉封閉10 min; 加入兔抗大鼠c-Kit蛋白多克隆抗體(1∶100)，4 ℃冰箱孵育過夜，PBST液沖洗3遍, 加入 II 抗(Dylight 488 Conjugated Goat anti-Rabbit IgG，1∶200)，37 ℃培養(yǎng)箱避光孵育1 h，PBST清洗3遍, 最后加抗淬滅封片液封片，置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

3.3CCK-8法檢測不同濃度谷氨酸對ICCs活力的影響 取對數(shù)生長期ICCs，經0.25%胰蛋白酶消化并收集離心。重懸計數(shù)后接種于96孔板，每孔接種1×104的細胞量，24 h后換液并分別加入高、中和低濃度(分別為10 mmol/L、5 mmol/L和2.5 mmol/L)的谷氨酸，每組重復6孔，于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，分別加入10 μL CCK-8 孵育4 h后，酶標儀以450 nm為檢測波長、630 nm為參比波長, 采用單步測量法測其吸度光(A)。

3.4Western blot檢測自噬標志蛋白LC3的表達水平 取生長對數(shù)期ICCs, 經胰酶消化離心后計數(shù)，并接種2×105個細胞至25 cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，貼壁24 h后，更換新的培養(yǎng)基, 并給予高、中和低濃度谷氨酸分別干預3 h、6 h和24 h后，經預冷PBS洗滌3次，每次5 min，用微量移液器吸凈殘余PBS, 加入100 μL含1% PMSF的RIPA細胞裂解液，細胞刮子收集細胞及蛋白, 冰浴30 min,4 ℃、12 000 r/min離心20 min，吸取上清液, BCA法測量蛋白濃度，取100 μg蛋白與相應量的上樣緩沖液混合，沸水變性5 min后放置冰上備用。蛋白經12% SDS-PAGE分離膠和5% SDS-PAGE濃縮膠分離后轉移至0.45 μm的PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，加入抗LC3 抗體(1∶1 000)及抗內參照GAPDH抗體(1∶1 000) 4 ℃過夜，洗膜3次，每次5 min，加入遠紅外熒光 II 抗(1∶10 000)，37 ℃孵育1 h，洗膜3次，每次5 min，最后使用Odyssey雙色紅外成像系統(tǒng)進行掃膜成像, 通過Quantity One軟件對Western blot條帶進行定量分析。

3.5透射電鏡檢測谷氨酸誘導后ICCs的自噬體和超微結構的變化 取對數(shù)生長期的ICCs，經胰酶消化離心后計數(shù)接種至6孔板中，每孔接種1×106的細胞量，貼壁24 h后，棄去孔內舊培養(yǎng)基，加入中濃度谷氨酸與ICCs作用3 h后，經預冷PBS洗滌3次，每次3 min。使用胰蛋白酶消化細胞并收集離心去上清，最后加入3%戊二醛、1%鋨酸雙重固定，丙酮逐級脫水及二甲酸二丙烯酯包埋，超薄切片處理，使用透射電鏡進行觀察和攝圖。

3.6免疫熒光法檢測谷氨酸誘導后ICCs自噬蛋白LC3的表達 取對數(shù)生長期的ICCs，經胰酶消化離心后計數(shù)，接種至含無菌圓形蓋玻片的24孔板中，每孔接種5×103個細胞，貼壁24 h后，加入中濃度谷氨酸與ICCs孵育3 h，棄去舊培養(yǎng)基，PBS清洗，用預冷的多聚甲醛固定10 min，PBST清洗3次,每次5 min，再加入5%脫脂奶粉封閉10 min，PBST清洗3次；將玻片置于染色盒內，加入兔抗鼠LC3抗體(1∶100)，37 ℃孵育30 min。PBST清洗3次，加入 II 抗：FITC標記羊抗兔抗體(1∶200)避光置于37 ℃孵育30 min。PBST清洗3次，再加入DAPI染液室溫孵育10 min，最后加抗熒光淬滅液封片，熒光顯微鏡下觀察LC3的表達。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。實驗重復3次以上，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，進行方差齊性檢驗，兩組間均數(shù)比較采用Student’st檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 ICCs免疫熒光鑒定

免疫熒光染色對ICCs內特異性c-Kit蛋白染色，可鑒定培養(yǎng)的原代ICCs。普通顯微鏡和熒光顯微鏡下ICCs特征明顯，胞體呈三角形、菱形，核大，核周胞質較少，胞體可見2個以上長突起，相互連接并與周圍細胞緊密相連；熒光顯微鏡下c-Kit蛋白呈陽性表達，胞體明顯著色，呈綠色陽性顯色,見圖1。

2 不同濃度谷氨酸對ICCs活力的影響

與空白對照組相比，谷氨酸各濃度組所測得的A值均顯著降低(P<0.01)；此外，中、高濃度組所測得A值均顯著低于低濃度組(P<0.01)，而中濃度與高濃度組間差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖2。

Figure 1. Immunofluorescence identification of ICCs. A: morphology of ICCs under phase-contrast inverted microscope (×40); B～D: morphology of ICCs under fluorescence microscope (B:c-Kit immunostaining,×40; C: c-Kit immunostaining,×200; D: DAPI staining, ×200).

Figure 2. The viability of ICCs treated with glutamic acid. Mean±SD.n=6.##P<0.01vscontrol group；&P<0.05vslow dose group.

3 不同濃度的谷氨酸作用于ICCs不同時間后自噬蛋白LC3的表達

與空白對照組比較，中、高濃度谷氨酸分別干預不同時間均可顯著提高自噬蛋白LC3-II/LC3-I的比值(P<0.01)，其中以中濃度谷氨酸干預作用3 h的LC3-II/LC3-I比值最高(P<0.01)，隨著作用時間的增加，細胞自噬活性相對逐漸下降(P<0.01)，見圖3。

4 ICCs內自噬體和超微結構的變化

透射電鏡下，空白組ICCs內可見豐富的線粒體和內質網(wǎng)等細胞器，未見明顯的自噬體或自噬溶酶體；谷氨酸中濃度3 h組可見明顯的自噬泡，自噬體內可見未被完全消化的細胞器，并且細胞質內空泡增多，線粒體和內質網(wǎng)等細胞器數(shù)量明顯減少，見圖4。

Figure 3. The ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ in the ICCs treated with glutamic acid at different concentrations for different periods. Mean±SD.n=3.#P<0.05,##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vshigh dose group；△△P<0.01vs24 h group；▲▲P<0.01vs6 h group.

5 ICCs內自噬蛋白LC3熒光表達量的比較

正常細胞內自噬蛋白LC3呈均勻性低水平表達；谷氨酸中濃度組的ICCs可見LC3的表達增強，并在胞漿中聚集呈斑點樣，LC3的平均熒光強度較空白組顯著增強(P<0.01),見圖5。

討 論

谷氨酸是維持機體正常生理功能、參與多種蛋白質合成及神經遞質傳遞的重要氨基酸。谷氨酸在動物腦部含量最多，并作為興奮性氨基酸被認識；而過量的谷氨酸由于其興奮毒性和氧化應激的損傷可誘導神經元自噬[7]。孟晶等[8]研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸可損傷視網(wǎng)膜神經細胞，隨著細胞外谷氨酸濃度增加，細胞膜上的谷氨酸受體被激活，進而導致鈣離子內流，不斷增加的鈣離子可激活鈣調蛋白依賴性激酶介導的自噬[9]。過量的谷氨酸導致正常細胞自噬性損傷，與機體在不良應激時導致的損傷有相似之處。因此應用谷氨酸可以更好地模擬外界不良應激對ICCs產生的作用，從而誘導自噬。本實驗以谷氨酸作用于體外培養(yǎng)的SD大鼠胃ICCs，CCK-8法檢測結果提示各濃度谷氨酸均可降低ICCs的活力，且中、高濃度組的細胞活力均顯著低于低濃度組。

自噬標志蛋白LC3是目前為止在哺乳動物中被了解最透徹的一種自噬相關蛋白。在細胞中有2種存在形式，分別為LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ，前者位于胞漿內，而后者位于自噬泡膜表面。在自噬體形成過程中，LC3-Ⅰ與自噬膜的磷脂以酰胺鍵進行結合，形成LC3-Ⅱ參與自噬膜的合成。Sou等[10]研究顯示去除LC3-Ⅱ將不能形成完整閉合的自噬體結構，故LC3-Ⅱ對于自噬體的形成十分必要。發(fā)生自噬時LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值與自噬泡數(shù)量成正比，故常作為評估細胞自噬強弱的重要依據(jù)[11]。本實驗用Western blot法檢測不同濃度、不同作用時間ICCs內自噬蛋白LC3的表達，結果表明中濃度(5 mmol/L)谷氨酸作用3 h時ICCs自噬活性最強。為繼續(xù)驗證谷氨酸在此濃度及時間下的作用效果，我們通過透射電鏡及免疫熒光觀察，顯示谷氨酸中濃度組較空白組出現(xiàn)了明顯的自噬泡，細胞質內空泡增多，細胞器減少，并且自噬蛋白LC3熒光表達顯著增強，說明本實驗成功誘導了ICC的自噬。根據(jù)實驗結果我們發(fā)現(xiàn)，中、高濃度谷氨酸作用3 h時自噬活性最強，而作用6 h和24 h時自噬活性相對逐漸下降，這可能與自噬保護作用有關，細胞發(fā)生應激性反應初期，由于細胞內產生大量受損的亞細胞器、錯誤折疊蛋白等，細胞自噬活性增加，通過自噬清除這些廢物[12]，而隨著時間延長，錯誤折疊蛋白和細胞器被清除后，細胞逐漸恢復穩(wěn)態(tài)，細胞自噬的活性隨之而逐漸減弱。

Figure 4. The autophagosomes/autophagic vacuoles and ultrastructure of ICCs observed under transmission electron microscope (×30 000). ▲： initial autophagic vacuoles (AVi)； →： degrading autophagic vacuoles (AVd).

Figure 5. Observation of LC3 in the ICCs of each group under fluorescence microscope (×200). Mean±SD.n=20.##P<0.01vscontrol group.

總之，本實驗證明了谷氨酸可以誘導大鼠胃ICCs的自噬，其最佳作用濃度和時間分別為5 mmol/L和3 h，為進一步研究ICCs自噬的分子機制及相關藥物的研發(fā)提供了有效的細胞模型。