IL-6和AG490對移植裸鼠的彌漫大B細胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤生長的影響*

庹櫻籃， 王玲玲， 馮江龍， 李品浩， 楊文秀

(貴州醫(yī)科大學病理學教研室， 貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院病理科， 貴州 貴陽 550004)

彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)和伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma，BL)是常見的、侵襲性非霍奇金淋巴瘤,它們在病因學、形態(tài)學、免疫表型、遺傳學和臨床表現(xiàn)等方面都具有明顯的異質性。信號轉導和轉錄激活因子(singnal transcducers and activators of transcription，STAT)在腫瘤細胞中異常的持續(xù)活化，尤其是STAT3與腫瘤的生物學行為及其發(fā)生機制密切相關[1]。有關淋巴瘤中存在STAT3通路異?；罨捏w外研究較多，也取得了一些研究成果，但對淋巴瘤動物體內研究的報道甚少。本研究利用STAT3通路激動劑白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)及抑制劑AG490對DLBCL細胞株OCI-LY8和BL細胞株Raji荷瘤鼠進行體內實驗性研究,以探討STAT3信號通路對DLBCL和BL生長的影響。

材 料 和 方 法

1 動物

SPF級BALB/c裸鼠30只，雌性，4～6周齡，體重16～20 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，動物質量合格證編號為SCXK(京)2014-0004。飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學動物實驗中心，實驗動物飼養(yǎng)設施合格證號為SCXK(黔)2012-0001。彌漫大B細胞淋巴瘤OCI-LY8細胞株購于University Health Network;伯基特淋巴瘤Raji細胞株購于中國科學院上海細胞庫。

2 主要試劑

AG490(上海碧云天生物技術有限公司)；IL-6(PeproTech)；兔抗人p-STAT3 (Tyr705) 單克隆抗體和兔抗人survivin單克隆抗體(CST)；兔抗人血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)多克隆抗體(Abcam)；RIPA裂解液和PMSF(上海碧云天生物技術有限公司)；逆轉錄試劑盒和FastStart Universal SYBR Green Master (ROX)購自Roche。

3 主要方法

3.1細胞培養(yǎng) 復蘇凍存于液氮罐中的彌漫大B細胞淋巴瘤細胞株OCI-LY8和伯基特淋巴瘤細胞株Raji，分別于20%胎牛血清+80% IMDM培養(yǎng)基+1%青、鏈霉素混合培養(yǎng)液和10%胎牛血清+90% RPMI-1640培養(yǎng)基+1%青、鏈霉素混合培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2的溫箱中培養(yǎng)。

3.2裸鼠移植彌漫性大B細胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤模型的建立 BALB/c裸鼠飼養(yǎng)(SPF級)，適應性喂養(yǎng)5～7 d后，通過腹腔注射環(huán)磷酰胺注射液(75 mg/kg)進行預處理(連續(xù)2 d，停藥3 d)，取對數(shù)生長期的OCI-LY8細胞和Raji細胞以密度2×1010/L、無菌條件下于裸鼠右前肢近腋窩處皮下接種，每只0.2 mL。

3.3實驗分組及用藥 根據(jù)細胞株類型，分為OCI-LY8和Raji細胞2組，每組15只裸鼠。分別接種細胞成瘤后隨機分為對照(生理鹽水,control)組、IL-6 (0.1 mg/kg)組和AG490 (8 mg/kg)組3個小組，注射體積均為每只0.2 mL，隔日1次，共5次。

3.4用藥后的觀察及測量 每日觀察裸鼠的飲食和活動等情況，于用藥第1、3、5、7、9和10天記錄裸鼠體重及移植瘤體積(瘤體積=a×b2/2,其中a為腫瘤長徑，b為腫瘤短徑)的變化，并繪制移植瘤生長曲線圖，并在干預周期結束后第2天脫頸椎處死動物，將腫瘤組織液氮速凍后于-80 ℃保存。

3.5p-STAT3、survivin和VEGF蛋白水平的免疫組織化學和Western blot檢測 采用免疫組化PV兩步法檢測p-STAT3、survivin和VEGF的蛋白表達。操作按試劑盒說明書進行，用PBS代替 I 抗作為陰性對照，I 抗工作濃度分別為p-STAT3(1 ∶200)、survivin(1∶300)和VEGF(1∶100)。同時采用Western blot檢測p-STAT3、survivin和VEGF的表達，將瘤組織加液氮進行研磨至碎后提取細胞總蛋白，定量煮沸后經10% SDS-PAGE，將蛋白轉移至PVDF膜上，加入血清封閉液室溫封閉1 h,加入兔抗人p-STAT3單克隆抗體(1∶1 800)、兔抗人survivin單克隆抗體(1∶2 000)、兔抗人VEGF 多克隆抗體(1∶1 000)和鼠抗人β-actin抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，再加入辣根酶標記山羊抗兔IgG(1∶3 000)37 ℃孵育1 h,再經化學發(fā)光劑反應，X線片壓片曝光。將曝光后的條帶掃描并用ImageJ分析數(shù)據(jù)。以β-actin蛋白條帶作為內參照，最后數(shù)據(jù)以蛋白質表達的相對水平比予以表示。

3.6Real-time PCR檢測suvivin和VEGF的mRNA表達水平 將腫瘤組織用TRIzol、氯仿和異丙醇等進行總RNA提取，測定濃度和定量后立即逆轉錄成cDNA。引物由上海生工生物工程公司合成，survivin的上游引物為5’-GCCAGATTTGAATCGCGGGA-3’，下游引物為5’-GCAGTGGATGAAGCCAGCCT-3’；VEGF 的上游引物為5’-CTGTCTTGGGTGCATTGGA-3’，下游引物為5’-ATTGGATGGCAGTAGCTGC-3’；β-actin的上游引物為5 ’-CACCAACTGGGACGACAT-3’，下游引物為5’-ATCTGGGTCATCTTCTCGC-3’。熒光定量PCR擴增反應采用20 μL體系，反應條件為:95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，擴增40個循環(huán)。PCR擴增產物計算RNA的相對量用2-ΔΔCt法計算。

4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，兩組裸鼠成瘤率之間的比較采用Fisher確切概率法，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 成瘤率

裸鼠總成瘤率為83.3%(25/30)，OCI-LY8細胞株成瘤率為66.7%(10/15)，明顯低于Raji細胞株(100%，15/15)(P<0.05)。

2 IL-6和AG490對裸鼠皮下移植DLBCL和BL生長的影響

荷瘤鼠體重及移植瘤生長情況的統(tǒng)計結果顯示，DLBCL和BL荷瘤鼠的IL-6組中第9和10天裸鼠體重較相應對照組增高(P<0.05)；2種移植瘤在第10天與第1天瘤體積的差值上與對照組的之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；此外，BL荷瘤鼠第7天瘤體積與第5天瘤體積差值有增大趨勢,但無統(tǒng)計學差異。AG490組中裸鼠體重及瘤體積與對照組之間的差異均無統(tǒng)計學顯著性，見圖1、2和表1、2。

Figure 1. Growth curves of DLBCL xenografts in the nude mice. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

Figure 2. Growth curves of Burkitt lymphoma xenografts in the nude mice. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

3 腫瘤組織的病理學檢查

大體觀察可見腫瘤呈結節(jié)狀，無包膜，邊界清楚無黏連，腫塊可活動；切面灰紅或灰白色實性質軟，呈魚肉狀，出血壞死較少，見圖3。

表1 藥物對OCI-LY8細胞株荷瘤鼠體重的影響

*P<0.05vscontrol group.

表2 藥物對Raji細胞株荷瘤鼠體重的影響

*P<0.05vscontrol group.

彌漫大B細胞淋巴瘤移植瘤組織學特點為一致的中心母細胞樣腫瘤細胞彌漫分布，細胞圓，體積較大，細胞核可呈圓形或橢圓型，染色質呈泡狀，核膜厚，可見2～3個小核仁貼于核膜，細胞漿嗜雙色性或嗜堿；伯基特淋巴瘤移植瘤鏡下特點為腫瘤細胞中等大小，形態(tài)單一，彌漫分布，其間見星空現(xiàn)象,核圓，染色質粗，胞質深嗜堿性，見圖4。

4 p-STAT3、survivin及VEGF 蛋白和mRNA水平的變化

免疫組織化學染色結果顯示,p-STAT3陽性信號定位于細胞核，細胞核中見棕黃色顆粒;survivin和VEGF陽性信號定位于細胞漿，以細胞漿見棕黃色顆粒為陽性,見圖5A。Western blot結果顯示，與相應對照組相比，DLBCL 移植瘤IL-6組survivin和VEGF明顯升高(P<0.05)，AG490 組p-STAT3 及VEGF 明顯降低(P<0.05)，survivin未見明顯改變，見圖5B； BL移植瘤IL-6處理組p-STAT3和VEGF明顯升高(P<0.05)，而survivin表達無明顯改變，在AG490處理組3種蛋白均明顯降低(P<0.05)，見圖5C。

與對照組比較，DLBCL移植瘤中survivin和VEGF的mRNA表達水平在IL-6組的差異無統(tǒng)計學顯著性，在AG490 組與對照組之間差異亦無統(tǒng)計學顯著性，見圖6。

討 論

腫瘤微環(huán)境是體外實驗研究不能實現(xiàn)的。因此，移植瘤模型建立的活體內實驗是腫瘤研究不可或缺的手段。本研究采用DLBCL細胞(OCI-LY8細胞株)和BL細胞(Raji細胞株)建立移植瘤模型，為體內研究搭建平臺。

JAK/STAT信號轉導和轉錄激活因子信號通路已被證實與結腸癌、肝細胞癌和肺癌等多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關[2]，其在化療耐藥中的作用也被研究證實[3-4]。其中，STAT3雖然不是真正定義上的癌基因，但其對很多癌基因、抑癌基因表達的強大轉錄調控作用與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切，其主要是通過對其下游靶基因的轉錄調控而參與腫瘤的發(fā)生和演進過程。而細胞因子在腫瘤微環(huán)境中起到關鍵作用[5]，有報道腫瘤相關細胞因子IL-6不僅能被STAT3上調表達，而且是STAT3信號通路的激活子[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-6處理的移植瘤體積和裸鼠體重有所增加；IL-6處理后p-STAT3蛋白表達在DLBCL和BL中均有所升高,與既往的研究報道和我們在體外細胞實驗中的結果一致。而目前研究較多的JAIK/STAT通路特異性阻斷劑AG490，可通過抑制STAT3磷酸化及下調細胞中STAT3的表達來阻斷該信號通路[7-8]。大量體內外研究表明，AG490可抑制多種實體瘤細胞的增殖、侵襲和轉移，對U266骨髓瘤和ALCL瘤細胞的增殖[8]和NK T細胞淋巴瘤細胞株中STAT3 的活化[9]均有抑制作用。本課題組的前期體外細胞實驗也發(fā)現(xiàn)，AG490抑制培養(yǎng)的DLBCL和BL細胞內STAT3活化，減少STAT3的靶基因survivin和TIMP1的表達。本研究中AG490處理的2種淋巴瘤移植瘤組織中p-STAT3蛋白表達明顯下調，瘤體生長曲線也比對照組曲線上升幅度小，這與前期的體外細胞實驗結果符合。

Figure 5. The images of IHC (A; ×200) and Western blot for determining the protein levels of p-STAT3, survivin and VEGF in the DLBCL (B) and BL (C) transplanted tumors with different treatments. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

Figure 6. The 2-ΔΔCtvalues for evaluating the mRNA relative expression levels of survivin and VEGF in AG490, control and IL-6 groups of DLBCL. Mean±SD.n=3.

Survivin既是一個細胞凋亡抑制因子，又是細胞周期調控因子。它是一個很有前景的腫瘤治療靶點[10]。在侵襲性NHL中survivin表達明顯高于惰性NHL，而且在DLBCL及間變性大細胞淋巴瘤中survivin陽性表達病例預后差、5年生存率明顯降低[11]。在研究間變性大細胞淋巴瘤時發(fā)現(xiàn)，p-STATS表達與survivin表達呈明顯的正相關[12]。本課題組前期體外研究已發(fā)現(xiàn)survivin蛋白表達與STAT3和p-STAT3的水平呈現(xiàn)正相關關系。本研究結果與前期實驗結果基本一致,提示DLBCL中STAT3活化可能是survivin高表達的重要分子機制，survivin應該是DLBCL治療的一個重要靶點。然而，由于DLBCL的高度異質性，篩選適合該靶向治療的DLBCL亞型將成為一個很有意義研究熱點。

VEGF是一個重要的血管生成調節(jié)分子，故其表達異常與腫瘤的侵襲力和轉移有著密切關系。在DLBCL中，Ⅲ、IV期患者VEGF的表達明顯高于I、Ⅱ期患者，具有伴發(fā)癥狀的患者表達也增高[13-14]。目前已有研究證實，VEGF基因是STAT3的靶基因，通過STAT3可上調VEGF的表達[15]。在本研究中，DLBCL和BL兩細胞株裸鼠移植瘤組織中VEGF蛋白表達在AG490處理組降低，在IL-6處理組增高，且與p-STAT3蛋白表達一致。結果表明在DLBCL和Burkitt淋巴瘤中VEGF表達上調可能也是STAT3活化的結果。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)survivin和VEGF的mRNA 表達量在IL-6和AG490處理組之間的差異均無統(tǒng)計學顯著性。這提示survivin和VEGF表達可能存在轉錄后調控的機制或者存在其它通路對survivin及VEGF的調控，有待進一步研究的探討。

綜上所述，在IL-6和AG490作用下，DLBCL和Burkitt淋巴瘤裸鼠移植瘤的體積和裸鼠體重有一定程度變化，腫瘤組織中STAT3的活化出現(xiàn)明顯異常，其下游靶基因survivin和VEGF表達變化與STAT3的變化一致。腫瘤的變化與STAT3的活化異常有關，survivin和VEGF異常可能是STAT3活化異常的結果。2種淋巴瘤移植瘤中survivin和VEGF表達異?？赡苁荢TAT3活化影響淋巴瘤生長的相關分子機制。