白藜蘆醇調(diào)控miR-34a表達(dá)對骨肉瘤MG-63細(xì)胞生長、侵襲和自噬的影響*

直彥亮， 張 震， 賀 憲

(1廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院， 廣東 廣州 511400；2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬深圳沙井醫(yī)院， 廣東 深圳 518104)

骨肉瘤是一類預(yù)后差、致死率高的原發(fā)惡性骨腫瘤，在兒童和青少年較為常見[1-2]。化療和輔助化療作為主要手段在治療骨肉瘤取得明顯效果，但化療給患者帶來嚴(yán)重的毒副作用，致使患者不能堅持治療，常導(dǎo)致治療失敗[3]。因而，研究新的診斷標(biāo)志物及安全有效的治療藥物，對治療骨肉瘤患者具有重要作用。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)參與調(diào)控正常及腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生理及病理過程，通過靶向調(diào)節(jié)特定蛋白發(fā)揮生理作用[4-5]。miR-34a 是一類腫瘤抑制基因，可調(diào)控p53表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡等過程[6-7]。白藜蘆醇(resveratrol,Res)是一類天然多酚類物質(zhì)[8]。諸多研究已證實白藜蘆醇主要藥理作用表現(xiàn)為抗炎、抗氧化和抗凋亡等[9]，對多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的殺傷作用。目前已有報道研究白藜蘆醇可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲[3]，但其具體機(jī)制是否與miR-34a表達(dá)存在調(diào)控關(guān)系仍不清楚。本研究擬探討白藜蘆醇對miR-34a表達(dá)的影響及通過調(diào)控miR-34a而影響骨肉瘤MG-63細(xì)胞活力、侵襲能力和自噬的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 主要材料和儀器

人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63 來自中科院細(xì)胞所。DMEM 培養(yǎng)基和Lipofectamine 2000試劑盒(Invitrogen);白藜蘆醇(Sigma-Aldrich)；胎牛血清(Gibco)；MTT試劑盒(碧云天生物科技有限公司)；PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒和TaqMan?MicroRNA Assays試劑盒[大連寶生物工程(大連)有限公司]；鼠抗人LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和beclin-1單克隆抗體(CST)；辣根過氧化酶標(biāo)記的兔抗鼠酶標(biāo)的 II 抗(碧云天生物科技有限公司)；miR-34a和U6引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]。7500型PCR儀(Applied Biosystems)；凝膠成像分析儀(Bio-Rad)。

2 實驗方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 MG-63細(xì)胞用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)， 37 ℃、5% CO2環(huán)境。當(dāng)70%～80%細(xì)胞融合時，將細(xì)胞分為6組，分別給予不同濃度(0、10、20、40、60 和80 μmol/L)白藜蘆醇處理細(xì)胞48 h后，提取各組細(xì)胞RNA和總蛋白。

2.2MTT法檢測細(xì)胞活力 在96孔板中每孔接種1 000個細(xì)胞，每組設(shè) 3重復(fù)孔，同時設(shè)對照孔，相應(yīng)時點在每孔加入20 μL MTT工作液，37 ℃培養(yǎng)箱4 h后棄去培養(yǎng)液后，加入100 μL DMSO，振蕩混勻和瞬時離心，在酶標(biāo)儀上以490 nm測量各孔吸光度(A)值。

2.3Transwell小室實驗檢測細(xì)胞侵襲能力 加入基質(zhì)至Transwell上室后培養(yǎng)4 h。用胰酶消化細(xì)胞，然后用無血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，往transwell上室均勻加入10 000個(100 μL)細(xì)胞懸液，往Transwell下室加入600 μL含血清完全培養(yǎng)基，24 h后移除上室培養(yǎng)液。用棉簽輕輕去除上室滲透膜上細(xì)胞，PBS洗滌滲透膜下層。后用福爾馬林固定15 min。1%結(jié)晶紫染色液染色8～10 min，拍照觀察染色細(xì)胞分布情況。

2.4Western blot檢測自噬標(biāo)志蛋白的表達(dá) 根據(jù)蛋白提取試劑盒操作步驟提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白總量。根據(jù)LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和beclin-1蛋白的分子量，用合適濃度的SDS-PAGE分離，繼而轉(zhuǎn)膜和封閉，稀釋 I 抗后放置在4 ℃冰箱過夜；用TBST洗滌3次， II 抗孵育60 min后繼續(xù)TBST洗滌3次，化學(xué)發(fā)光后采集圖像。

2.5RT-qPCR實驗 采用TRIzol法提取細(xì)胞總mRNA。采用TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription kit反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)總體系為10 μL。用TaqMan?MicroRNA Assays試劑盒檢測miR-34a的表達(dá)，以U6作為內(nèi)參照。miR-34a 的上游引物序列為5’-ACACTCCAGCTGGGTGGCAGTGTCTTAG-3’，下游引物序列為5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCG-3’，產(chǎn)物為81 bp；U6的上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，產(chǎn)物94 bp。每組設(shè)3個重復(fù)，根據(jù)各樣本的平均Ct 值，以 2-ΔΔCt表示miRNA相對表達(dá)水平，所有反應(yīng)均在ABI 7500實時定量PCR儀完成。

2.6細(xì)胞轉(zhuǎn)染 當(dāng)細(xì)胞融合至70%～80%時，在6孔板中鋪6×105個細(xì)胞，將細(xì)胞分成5組：對照(control)組、miR-34a mimic轉(zhuǎn)染(miR-34a mimic)組、miR-34a mimic陰性對照轉(zhuǎn)染(miR-34a mimic negative control, miR-34a NC)組、白藜蘆醇(Res)組和miR-34a mimic轉(zhuǎn)染+白藜蘆醇(miR-34a mimic+Res)組。將 miR-34a mimic和陰性對照分別轉(zhuǎn)染至MG-63細(xì)胞，室溫中放置20 min后，分別加入培養(yǎng)孔，繼續(xù)孵育4 h。其中對照組不做任何處理；白藜蘆醇處理組用60 μmol/L 白藜蘆醇處理細(xì)胞48 h；miR-34a mimic轉(zhuǎn)染+白藜蘆醇組在轉(zhuǎn)染后，更換含有血清的完全培養(yǎng)基，再用60 μmol/L 白藜蘆醇處理48 h。轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine 2000試劑盒說明，將目的細(xì)胞按1×108/L接種在24 孔板中，于第2天使用Lipofectamine 2000將20 nmol miR-34a mi-mics轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞。提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測miR-34a。提取總蛋白檢測自噬標(biāo)志蛋白的表達(dá)，方法同2.4。

3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析所有數(shù)據(jù)，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間數(shù)據(jù)的比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，所有實驗均重復(fù)3次以上。

結(jié) 果

1 白藜蘆醇對骨肉瘤MG-63細(xì)胞活力、侵襲力和自噬的影響

MG-63細(xì)胞經(jīng)過不同濃度的白藜蘆醇分別處理1、2和3 d。培養(yǎng)2 d后MG-63細(xì)胞活力明顯降低，侵襲能力隨白藜蘆醇濃度增加呈逐漸減弱的趨勢，而自噬標(biāo)志蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1～3。

Figure 1. Resveratrol (Res) reduced the viability of MG-63 cells concentration-dependently. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

Figure 2. Resveratrol (Res) inhibited the invasion ability of MG-63 cells in a concentration-dependent manner. The cells were incubated with Res for 48 h (crystal violet staining, ×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

Figure 3. Resveratrol (Res) increased the ratio of LC3-II/LC3-I and the protein expression of beclin-1 in the MG-63 cells in a concentration-dependent manner. The cells were incubated with Res for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

2 白藜蘆醇對骨肉瘤MG-63細(xì)胞miR-34a表達(dá)的影響

與對照組比較，不同濃度的白藜蘆醇處理MG-63細(xì)胞后，miR-34a的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，見圖4。

Figure 4. The effect of resveratrol (Res) on the expression of miR-34a in the MG-63 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

3 miR-34a轉(zhuǎn)染對骨肉瘤MG-63細(xì)胞的活力、侵襲能力和自噬的影響

與miR-34a mimic NC組及對照組比較，miR-34a mimic組(處理48 h)、白藜蘆醇處理組(處理48 h)以及miR-34a mimic+白藜蘆醇處理組的細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05)，侵襲能力明顯減弱(P<0.05)，自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高和beclin-1上調(diào)更明顯(P<0.05)，且miR-34a mimic+白藜蘆醇處理組與單純miR-34a mimic組和白藜蘆醇組相比其抑制細(xì)胞活力和侵襲能力的作用更強(qiáng)，自噬程度更明顯(P<0.05),見圖5～7。

Figure 5. The effect of miR-34a on the viability of the MG-63 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsRes group.

討 論

骨肉瘤是一類在青少年人群中較為常見的原發(fā)惡性骨腫瘤，發(fā)病率約逐年增加，因其預(yù)后效果差、致死率高，給患者社會帶來沉重負(fù)擔(dān)[10]。白藜蘆醇是一類來自于天然植物的多酚類物質(zhì)，具有抗氧化和抗衰老等多種藥理作用，能夠促進(jìn)肺癌、胃癌和骨肉瘤等腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制其增殖和轉(zhuǎn)移[11]，但在不同腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出不一樣的抗腫瘤機(jī)制。用白藜蘆醇處理骨肉瘤細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)MMP-2蛋白表達(dá)下調(diào)[12]。研究發(fā)現(xiàn)miR-34a具有抑癌功能，在結(jié)直腸癌和骨肉瘤等多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，而過表達(dá)miR-34a可明顯抑制腫瘤的增殖、侵襲和遷移能力[13-15]。

白藜蘆醇能夠影響miRNA的表達(dá)，表現(xiàn)出抗腫瘤活性[16]，本研究首先證實不同濃度的白藜蘆醇對骨肉瘤MG-63細(xì)胞miR-34a表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著白藜蘆醇濃度增加，骨肉瘤細(xì)胞miR-34a的表達(dá)逐漸上調(diào)，呈顯著劑量效應(yīng)關(guān)系，同時白藜蘆醇隨著濃度增加促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞自噬和抑制侵襲能力越強(qiáng)，該結(jié)果與以往文獻(xiàn)報道一致[3]，因此，我們推測白藜蘆醇的抗腫瘤作用可能與上調(diào)miR-34a表達(dá)有關(guān)。為深入研究這種內(nèi)在調(diào)控聯(lián)系，本課題組將miR-34a模擬物與陰性對照分別轉(zhuǎn)染至骨肉瘤MG-63細(xì)胞，再用60 μmol/L白藜蘆醇處理，檢測骨肉瘤MG-63細(xì)胞的活力，侵襲能力和自噬的變化。結(jié)果顯示與未經(jīng)處理的骨肉瘤MG-63細(xì)胞及miR-34a模擬物陰性對照組比較， miR-34a模擬物、白藜蘆醇以及miR-34a模擬物+白藜蘆醇均可明顯抑制MG-63細(xì)胞的活力和侵襲，并促進(jìn)自噬標(biāo)志蛋白表達(dá)上調(diào)；但與白藜蘆醇組以及miR-34a模擬物組比較，miR-34a模擬物+白藜蘆醇組可明顯增加白藜蘆醇或miR-34a模擬物的抗腫瘤作用，對抗細(xì)胞生長和侵襲能力的抑制作用更強(qiáng)，自噬標(biāo)志蛋白的表達(dá)更顯著增加，提示白藜蘆醇可能通過上調(diào)miR-34a抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞的生長、侵襲并促進(jìn)自噬。

Figure 6. The effect of miR-34a on the invasive ability of MG-63 cells (crystal violet staining, ×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsRes group.

Figure 7. The effect of miR-34a on the ratio of LC3-II/LC3-I and the protein expression of beclin-1 in the MG-63 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsRes group.

綜上所述，白藜蘆醇可能通過上調(diào)miR-34a抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞的活力、侵襲和自噬等生物學(xué)行為，本研究的不足之處在于沒有繼續(xù)研究miR-34a通過調(diào)控哪些蛋白表達(dá)，從而影響骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移，且這種調(diào)控作用是否有其它miRNA參與尚不清楚，需要深入研究。