Zeste基因增強(qiáng)子同源物2通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路影響腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡*

李 巍， 邢曉紅， 邊志穎， 彭延波

(1唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系， 河北 唐山 063000；2保定市第一中心醫(yī)院內(nèi)分泌三科，河北 保定 071000；3華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 河北 唐山 063000)

腦膠質(zhì)瘤起源于神經(jīng)外胚層，是最為常見的神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，在全部的顱內(nèi)腫瘤中約占45%。其中，星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤在全部腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中最為常見，放療、化療及綜合治療等是常見的治療手段，這些方法已經(jīng)取得了很多進(jìn)步，但是由于膠質(zhì)瘤的惡性程度較高，還需要尋找有效的方法延長膠質(zhì)瘤患者的生存期，隨著人們對腫瘤發(fā)病機(jī)制的不斷研究，基因靶向治療已經(jīng)成為了重要的治療方法[1-3]。Zeste基因增強(qiáng)子同源物2(enhancer ofzestehomolog 2，EZH2)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種與果蠅zeste基因的增強(qiáng)子有關(guān)的人類同源基因，其在腫瘤中是多種高度沉默的基因的轉(zhuǎn)錄抑制因子，在膀胱癌、乳腺癌和膠質(zhì)瘤等腫瘤中高度表達(dá)，并且與腫瘤細(xì)胞的增殖等有關(guān)，而對于其作用機(jī)制尚不十分清楚[4-6]。Wnt/β-catenin信號通路在腫瘤中過度激活，并且與細(xì)胞內(nèi)癌基因和抑癌基因調(diào)控腫瘤的發(fā)展有關(guān)[7]。本實(shí)驗(yàn)以膠質(zhì)瘤細(xì)胞為體外研究對象，探討EZH2在膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制，為靶向EZH2治療膠質(zhì)瘤提供理論參考。

材 料 和 方 法

1 主要材料

膠質(zhì)瘤U87、H4和U251細(xì)胞和正常人腦星形細(xì)胞(normal human astrocytes,NHA)購自ATCC，細(xì)胞以10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。RT-qPCR試劑盒購自大連寶生物；β-actin和EZH2引物由上海生工合成；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)定量試劑盒和caspase-3活性檢測試劑盒購自碧云天；RNA提取試劑盒購自北京索萊寶；抗EZH2、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)和c-Myc抗體購自CTS。

2 方法

2.1RT-qPCR檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞中EZH2 mRNA的表達(dá) 膠質(zhì)瘤U87、H4和U251細(xì)胞和NHA用TRIzoi法細(xì)胞RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 后，進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)條件為：95 ℃ 2 min; 95 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt法計(jì)算EZH2表達(dá)水平。β-actin為內(nèi)參照。EZH2的上游引物序列為5′-TGATGACGATGATGATGATGGAGAC-3′， 下游引物序列為5′-TGTGCCCTTATCTGGAAACATTGAG-3′；β-actin的上游引物序列為5′-GGACCTGACTGACTACCTC-3′，下游引物序列為5′-TACTCCTGCTTGCTGAT-3′。

2.2Western blot檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞中EZH2的蛋白表達(dá) 膠質(zhì)瘤U87、H4和U251細(xì)胞和NHA按照細(xì)胞蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞中的總蛋白，以BCA蛋白定量試劑盒檢測各組蛋白樣品的濃度。取蛋白樣品，每個(gè)泳道添加40 μg蛋白進(jìn)行電泳，實(shí)驗(yàn)所用凝膠為5%濃縮膠和10%分離膠。初始電泳電壓為80 V，電泳時(shí)間為30 min，再把電壓調(diào)整到120 V，繼續(xù)電泳約2 h后，取出凝膠，把裁剪好的NC膜在轉(zhuǎn)移緩沖液中充分浸泡后，在300 mA電流中轉(zhuǎn)膜。取出膜，以5%的脫脂奶粉在室溫孵育120 min。封閉結(jié)束以后，把膜放在1∶800稀釋后的EZH2抗體中，置于4 ℃過夜。取出膜，再與1 ∶4 000稀釋的II抗孵育，于室溫中孵育1 h。ECL發(fā)光以后，曝光，對各組蛋白的灰度值進(jìn)行定量，以每組樣品中GAPDH的灰度值作為對照，對蛋白表達(dá)進(jìn)行定量。

2.3細(xì)胞分組 膠質(zhì)瘤細(xì)胞H4在轉(zhuǎn)染前1 d，以5×108/L的細(xì)胞密度接種到6孔板中，細(xì)胞融合度約為60%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。取250 μL的Opti-MEM培養(yǎng)液和5 μL的Lipofectamine 2000混合后，靜置5 min；再取250 μL的Opti-MEM培養(yǎng)液分別和5 μL的EZH2 siRNA和 siRNA control混合，靜置5 min。把上述2種混合液混合后，靜置20 min。添加到上述細(xì)胞中，6 h后，把上清吸除，加入細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行RT-qPCR和Western blot檢測，測定細(xì)胞中EZH2的表達(dá)，具體操作方法同上。膠質(zhì)瘤細(xì)胞H4中轉(zhuǎn)染EZH2 siRNA和 siRNA control后記為EZH2 siRNA組和siRNA-NC組，同時(shí)把只在細(xì)胞中添加轉(zhuǎn)染試劑的細(xì)胞作為對照(control)。

2.4MTT法測定細(xì)胞活力 Control組、siRNA-NC組和EZH2 siRNA組細(xì)胞分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h和96 h，在每孔中添加5 g/L的MTT各20 μL，置于37 ℃條件下孵育4 h。把每個(gè)孔內(nèi)的液體吸除以后，以每孔中添加150 μL DMSO，避光反應(yīng)10 min。測定每孔490 nm的吸光度(A)值。

2.5流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡 Control組、siRNA-NC組和EZH2 siRNA組細(xì)胞在培養(yǎng)48 h后用胰蛋白酶消化，在細(xì)胞沉淀中添加PBS，把細(xì)胞洗滌3次。在細(xì)胞內(nèi)加入400 μL的binding buffer，懸浮以后，在細(xì)胞懸浮液內(nèi)依次加入5 μL的Annexin V-FITC，置于4 ℃的避光環(huán)境中孵育15 min。再添加10 μL的PI，立即用流式細(xì)胞術(shù)檢測。

2.6分光光度計(jì)法檢測caspase-3活性 Control組、siRNA-NC組和EZH2 siRNA組細(xì)胞在培養(yǎng)48 h以后，用分光光度計(jì)法檢測各組膠質(zhì)瘤細(xì)胞中caspase-3活性，具體操作方法參照caspase-3活性測定試劑盒。結(jié)果以轉(zhuǎn)染以后的細(xì)胞A值與control細(xì)胞A值的比值作為caspase-3活性水平。

2.7Western blot測定β-catenin和c-Myc的蛋白水平 Control組、siRNA-NC組和EZH2 siRNA組細(xì)胞在培養(yǎng)48 h后，用Western blot方法測定各組膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的β-catenin和c-Myc蛋白水平，操作方法同上。

2.8激活 Wnt/β-catenin信號通路對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響EZH2 siRNA細(xì)胞培養(yǎng)液中添加Wnt/β-catenin信號通路激活劑LiCl，LiCl的濃度為15 mmol/L，記為EZH2 siRNA+LiCl組，流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡，Western blot測定β-catenin和c-Myc蛋白水平，分光光度計(jì)法測定細(xì)胞中caspase-3活性，操作方法同上。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組數(shù)據(jù)間比較經(jīng)t檢驗(yàn)，多組差異比較采用單因素方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 EZH2在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)

U87、H4和U251細(xì)胞中EZH2的mRNA和蛋白水平明顯高于NHA(P<0.05)。H4細(xì)胞中EZH2的mRNA和蛋白水平明顯高于U251和U87細(xì)胞(P<0.05)，見圖1。這說明EZH2在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)升高，并且在H4細(xì)胞中的表達(dá)水平最高，因此我們選用H4細(xì)胞做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Figure 1. The expression of EZH2 in glioma U87, H4 and U251 cells and NHA. A: the mRNA expression of EZH2; B： the protein expression of EZH2 determined by Western blot.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNHA;#P<0.05vsU87 and U251.

2 轉(zhuǎn)染EZH siRNA后膠質(zhì)瘤細(xì)胞中EZH2的表達(dá)

siRNA-NC組細(xì)胞中EZH2的mRNA和蛋白水平與control組相比差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；EZH2 siRNA組細(xì)胞中EZH2的mRNA和蛋白水平與control組相比明顯降低(P<0.05)，見圖2。

3 EZH2表達(dá)下調(diào)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的活力

MTT細(xì)胞活力檢測結(jié)果顯示，control組、siRNA-NC組和EZH2 siRNA組細(xì)胞24 h的A值無明顯變化；siRNA-NC組細(xì)胞48 h、72 h和96 h的A值與control組相比差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；EZH2 siRNA組48 h、72 h和96 h的A值與control組相比明顯降低(P<0.05)，見圖3。

4 EZH2下調(diào)誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡

siRNA-NC組細(xì)胞的凋亡率和caspase-3活性與control組相比差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；EZH2 siRNA組細(xì)胞凋亡率和caspase-3活性與control組相比明顯升高(P<0.05),見圖4。這說明EZH2下調(diào)可以誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。

Figure 2. The expression of EZH2 in the glioma cells after transfection. A: the mRNA expression of EZH2 determined by real-time PCR; B the protein expression of EZH2 determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2轉(zhuǎn)染后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中EZH2表達(dá)水平的變化

Figure 3. The changes of cell growth curves after knockdown ofEZH2 expression. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

5 EZH2下調(diào)抑制Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

siRNA-NC組細(xì)胞中β-catenin和c-Myc蛋白水平與control組相比差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；EZH2 siRNA組細(xì)胞的β-catenin和c-Myc蛋白水平與control組相比明顯降低(P<0.05)，見圖5。這說明c-Myc下調(diào)抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活。

6 激活Wnt/β-catenin信號通路對膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響

EZH2 siRNA+LiCl組細(xì)胞的凋亡率和caspase-3活性與EZH2 siRNA組相比明顯降低(P<0.05)。EZH2 siRNA+LiCl組細(xì)胞的β-catenin和c-Myc蛋白水平與EZH2 siRNA組相比明顯升高(P<0.05)，見圖6。這說明激活Wnt/β-catenin信號通路可以拮抗EZH2下調(diào)誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。

討 論

EZH2屬于Polycomb group (PcG)蛋白成員之一，而PcG蛋白家族參與調(diào)控組蛋白的修飾，而組蛋白的修飾與腫瘤的發(fā)生有關(guān)[8]。EZH2對于組蛋白去乙?；负虳NA甲基轉(zhuǎn)移酶等均有調(diào)控作用，可以通過抑制靶基因的激活誘導(dǎo)細(xì)胞的生長；EZH2可以通過作用于細(xì)胞增殖相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄影響胃癌細(xì)胞的增殖，并且其在腫瘤干細(xì)胞基因激活和抑癌基因的轉(zhuǎn)錄中均有重要作用；EZH2在很多惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，在小鼠中抑制EZH2活性可以阻礙腫瘤的發(fā)展；EZH2還能夠調(diào)控前列腺癌、淋巴瘤和大腸癌等多種腫瘤細(xì)胞的生長[9-15]。本實(shí)驗(yàn)表明，EZH2在膠質(zhì)瘤U87、H4和U251細(xì)胞中的表達(dá)水平高于NHA；敲減EZH2后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞從48 h開始，增殖活性受到抑制。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，敲減EZH2表達(dá)后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中caspase-3的活性升高，細(xì)胞凋亡率也明顯升高，即敲減EZH2可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。腫瘤細(xì)胞的凋亡與細(xì)胞內(nèi)的多種基因和信號的傳遞有關(guān)，是一個(gè)復(fù)雜的多環(huán)節(jié)過程。Caspase蛋白家族含有多個(gè)蛋白成員，其可以被外界因子和信號激活，caspase凋亡反應(yīng)的起始因子到效應(yīng)因子迅速被激活，最終發(fā)揮凋亡執(zhí)行的作用，caspase蛋白以沒有活性的酶原形式存在于細(xì)胞內(nèi)，只有經(jīng)過活化后才可以發(fā)揮其生物學(xué)作用[16]。EZH2可以通過激活caspase級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而caspase-3是凋亡的執(zhí)行因子，是重要的凋亡促進(jìn)因子[17-18]。

Figure 4. Knockdown ofEZH2 expression induced apoptosis of glioma cells. A: flow cytometry was used to determine the apoptosis rate after down-regulation ofEZH2; B: the changes of caspase-3 activity. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

Figure 5. Knockdown ofEZH2 expression inhibited the levels of Wnt/β-catenin signaling pathway-related proteins. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

Wnt/β-catenin信號通路在人類的疾病發(fā)生中具有廣泛的調(diào)控作用，其具有高度保守性，在組織胚胎的發(fā)育中有關(guān)鍵作用，在正常的組織中激活水平極低[19]。近年來研究顯示，Wnt/β-catenin信號通路在腫瘤中呈激活狀態(tài)，與腫瘤惡性程度有關(guān)[20]。β-catenin在正常的細(xì)胞中以復(fù)合體的形式在細(xì)胞膜上存在，在受到相關(guān)信號的刺激以后，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累，轉(zhuǎn)入到細(xì)胞核內(nèi)，啟動下游靶基因c-myc的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[21]。有研究報(bào)道稱，Wnt/β-catenin信號通路與EZH2具有一定的內(nèi)在聯(lián)系，EZH2可以通過促進(jìn)β-catenin表達(dá)增加乳腺癌細(xì)胞擴(kuò)增能力；RNA干擾腎癌細(xì)胞中EZH2表達(dá)可以通過下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路的激活水平降低細(xì)胞的侵襲能力；同樣在結(jié)腸癌細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞中證實(shí)，EZH2具有正調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路的作用[22-26]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，EZH2下調(diào)后的Wnt/β-catenin信號通路激活水平降低，并且Wnt/β-catenin信號通路激活劑可以減弱下調(diào)EZH2對膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的作用，說明EZH2表達(dá)下調(diào)可以通過Wnt/β-catenin信號通路影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。

Figure 6. Effect of activation of Wnt/β-catenin signaling pathway on glioma cell apoptosis after knockdown ofEZH2 expression. A: Western blot was used to determined the protein levels of β-catenin and c-Myc in the cells; B: flow cytometry was used to determine the apoptosis; C: the changes of caspase-3 activity in the cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs EZH2 siRNA group.

以上表明，EZH2表達(dá)下調(diào)通過抑制Wnt/β-catenin信號通路誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。EZH2可能是治療膠質(zhì)瘤的一個(gè)潛在靶點(diǎn)，對于其在其它膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的作用還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究為探討EZH2在腫瘤中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，對于研究腫瘤的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。