Myocardin重組蛋白表達(dá)及其在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞重編程為血管平滑肌細(xì)胞中的作用*

麥麗萍， 楊翔宇， 吳岳恒， 余細(xì)勇， 何國東， 李曉紅△

(1廣東省人民醫(yī)院， 廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)研究部， 廣東省華南結(jié)構(gòu)性心臟病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510080;2廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 廣東 廣州 511436)

血管再生是一個(gè)非常復(fù)雜的生理和病理過程，而血管重建依賴于原來存在的血管，血管壁上各種細(xì)胞發(fā)生增殖、遷移而形成新的血管分支，對(duì)損傷的血管起到修復(fù)作用，在冠心病、高血壓等心血管疾病中普遍存在并影響疾病的預(yù)后。人工血管作為一種修復(fù)和替代病變血管的假體，需要生物材料與種子細(xì)胞相結(jié)合，在大血管疾病的治療中發(fā)揮著重要作用[1]。目前血管平滑肌作為人工血管中重要的種子細(xì)胞，其來源主要有血管壁細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞，但均不是理想的細(xì)胞來源，細(xì)胞重編程技術(shù)是我們獲取血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，vSMCs)的另一條重要途徑。

心肌素(myocardin)是2001年從小鼠心臟cDNA 文庫中分離和克隆出來的一個(gè)基因，其通過與血清反應(yīng)因子(serum response factor，SRF)結(jié)合，形成復(fù)合物后激活CArG-box依賴性的肌細(xì)胞特異性基因啟動(dòng)子。Myocardin能影響細(xì)胞的增殖、遷移、分化和凋亡，在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的分化中，尤其在心臟基因表達(dá)、心肌發(fā)育早期和心臟血管形成中起著重要的作用[2-3]。研究表明， myocardin在7.75 d的胚胎心臟和成年心臟組織中均有表達(dá)[4]；而在后來發(fā)育階段中，myocardin 的mRNA 水平在正發(fā)育的小鼠心臟中表達(dá)并持續(xù)升高，在腸道和脈管的平滑肌細(xì)胞中也可以表達(dá)[5]。Myocardin是促進(jìn)血管平滑肌分化的重要轉(zhuǎn)錄因子，在Rho-actin信號(hào)和SRF依賴性的轉(zhuǎn)錄中起著橋梁作用，可調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化[6-7]。因此我們嘗試將myocardin用于細(xì)胞的重編程以獲取誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞(inducible smooth muscle cells，iSMCs)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞株

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs)購自賽業(yè)生物科技有限公司(貨號(hào)：HUXMA-01001)，該細(xì)胞株已鑒定CD44、CD105、CD29和CD73的表達(dá)>98%，CD34表達(dá)<0.6%，CD45和CD11b的表達(dá)<0.1%,可分化為成脂或成骨細(xì)胞。

2 主要試劑和儀器

胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gibco；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基和pET30a載體購自賽業(yè)生物科技有限公司；LB培養(yǎng)基購自Sigma；綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)購自義翹神州生物技術(shù)有限公司；PBS 購自Life Technologies；抗平滑肌肌球蛋白重鏈(smooth muscle myosin heavy chain,smMHC)抗體購自Abcam；抗His抗體購自CST；DNA 上樣緩沖液、DNA marker、PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)和SYBR Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)購自TaKaRa。熒光顯微鏡購自Leica；電泳系統(tǒng)購自大連捷邁科貿(mào)有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購自GE。

3 主要方法

3.1重組pET30a-myocardin表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 利用PCR引物(正向引物為5’-CCAATTGCGGCCGCCTTGGCCCCAGCACCCCC-3’， 反向引物為5’-CGGTTT-CTCGAGCTACCACTGCTGCAAGTGAAGGTCCAT-3’)，以人心臟cDNA文庫為模板， 用PCR擴(kuò)增myocardin基因。反應(yīng)條件為： 94 ℃預(yù)熱2 min; 94 ℃變性30 s， 60 ℃退火45 s， 68 ℃延伸3.5 min， 30個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 10 min。

純化的PCR產(chǎn)物克隆入pMD-18T載體，并行DNA測(cè)序鑒定。提取myocardin序列正確的重組pMD-18T-myocardin質(zhì)粒,用NcoI和XhoI雙酶切pMD-18T-myocardin質(zhì)粒和pET30a載體，純化酶切產(chǎn)物，將myocardin基因片段克隆入pET30a載體。用NcoI和XhoI雙酶切篩選鑒定重組pET30a-myocardin質(zhì)粒，并送Invitrogen公司測(cè)序鑒定。

3.2重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-myocardin轉(zhuǎn)化BL21后，鋪板，挑克隆到含卡那霉素的1 mL LB培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日將菌液全部倒入400 mL 含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、230 r/min振蕩培養(yǎng)，至吸光度(A)值為1.5時(shí)，不同于常規(guī)1∶1誘導(dǎo)，本實(shí)驗(yàn)采用高濃度誘導(dǎo)法：按2 ∶1轉(zhuǎn)換培養(yǎng)液為M9 minimal medium，再額外添加2倍的葡萄糖，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)1 h，至A值達(dá)到3.5～4.0，然后加入0.5 mmol/L的IPTG，在37 ℃下進(jìn)行誘導(dǎo)。整個(gè)誘導(dǎo)過程始終檢測(cè)培養(yǎng)液的pH值，應(yīng)維持在6.0以上。經(jīng)3 h后裂解細(xì)菌的，過柱純化，再進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況。SDS-PAGE 具體方法如下：把5 mL 12%分離膠液緩緩地注入2層玻璃板中間處，當(dāng)加至距離玻璃板頂部大約3 cm處時(shí)，用異丙醇加滿進(jìn)行封膠；室溫下靜置30 min，膠凝固后倒入5%濃縮膠液，在室溫下靜置15 min；在電泳槽內(nèi)裝上已凝固的膠和玻璃板，在各加樣孔中加入已處理的蛋白樣品，另將marker加入其中1孔內(nèi)；100 V電泳1.5 h。

3.3重組蛋白的分離純化 用結(jié)合緩沖液平衡好鎳親和層析柱后，將超聲裂解得到的菌體上清緩慢過柱，用10倍體積的結(jié)合緩沖液洗滌，然后再用含10 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液充分洗滌非特異性結(jié)合的雜蛋白。每一步都需收集樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)洗滌情況，上述過程均在4 ℃的冷庫中進(jìn)行。最后用10%甘油和2% SDS配制成的洗脫液進(jìn)行洗脫，收集特異性結(jié)合的目的蛋白。本研究中采用以下3種洗脫方式：(1)常溫下，采用傳統(tǒng)的500 mmol/L的imidazole洗脫液進(jìn)行過柱洗脫；(2)常溫下，用洗脫液溶解結(jié)合有目的蛋白的柱凝膠，溫和攪拌30 min，10 000 r/min，4 ℃離心后取上清保存；(3)在37 ℃用洗脫液溶解結(jié)合有目的蛋白的柱凝膠，溫和攪拌30 min，10 000 r/min，4 ℃離心后取上清保存。

3.4目的蛋白dot blot 檢測(cè) 將各次分離純化后的蛋白樣本各50 μL滴加到硝酸纖維素膜上，陰性對(duì)照使用無關(guān)蛋白樣品。用鼠抗人myocardin單克隆抗體4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠II抗在室溫孵育2 h，加顯色液后暗室顯影沖片，得到特異性的蛋白點(diǎn)。Dot blot 陽性結(jié)果顯黑色斑點(diǎn)，陰性結(jié)果不顯影。

3.5納米材料與蛋白結(jié)合 在200 μL 100 mg/L 的 myocardin蛋白溶液中加入0.4 μL的納米轉(zhuǎn)導(dǎo)材料(8 g/L)，即納米粒子與蛋白質(zhì)的摩爾比為4∶1，于4 ℃ 攪拌過夜[8]。

3.6重組蛋白細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn) 采用hBMSCs為研究對(duì)象，在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基中加入上述克隆表達(dá)得到的nano-myocardin蛋白，12 h后，固定細(xì)胞，采用抗His抗體免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白的轉(zhuǎn)染情況。

3.7細(xì)胞重編程實(shí)驗(yàn) 在培養(yǎng)皿中接種人來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，待細(xì)胞長滿至 70% 左右，將終濃度為0.4 mg/L的nano-myocardin加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液中與hBMSCs 過夜孵育，12 h后換為不加蛋白的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，48 h后再次給予蛋白誘導(dǎo)。重復(fù)以上蛋白誘導(dǎo)步驟4次?；A(chǔ)培養(yǎng)液包含2 mmol/L谷氨酰胺和0.4 mmol/L α-硫代甘油。觀察細(xì)胞形態(tài)變化，第8天用qPCR和免疫熒光檢測(cè)hBMSCs向vSMCs轉(zhuǎn)分化的情況。

3.8RNA提取及qPCR 細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白后去除培養(yǎng)基，用冷PBS洗細(xì)胞3次，吸干PBS，采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA。用NanoDrop 1000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific)測(cè)RNA濃度后按照PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)試劑盒說明書要求進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。將cDNA按照SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒說明書要求,利用ABI 7500 Real-Time PCR System進(jìn)行 qPCR檢測(cè)。Smoothelin(SMTN)的上游引物序列為5’-AAAGAGCTAAG CCGAGCCTG-3’， 下游引物序列為5’-CGTCGGTTCCTTTCTGGTGA-3’； caldesmon (CALD)的上游引物序列為5’-GTGACCAACCAGAAGGCTCA-3’， 下游引物序列為5’-CTTCGAGTCGCATCTCCTCC-3’； GAPDH的上游引物序列為5’-GCATCCTGGGCTACACTG-3’， 下游引物序列為5’-TGGTCGTTGAGGGCAAT-3’。

3.9細(xì)胞免疫熒光檢測(cè) 細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，用 PBS洗 3 次，每次5 min；4%多聚甲醛固定10 min；PBS洗3次，每次5 min；0.1% Triton X-100室溫通透15 min；2% BSA/0.2% Tween 20/PBS室溫封閉2 h；加入鼠來源抗smMHC和抗histone單克隆抗體。4 ℃孵育過夜；用2 % BSA洗3次，每次5 min；加入羊抗鼠II抗，室溫避光孵育2 h，1 % BSA洗3次，每次5 min；用含有封片劑的DAPI復(fù)染細(xì)胞核后，將細(xì)胞放至熒光顯微鏡下觀察并拍照；同時(shí)計(jì)算1 000個(gè)細(xì)胞中含有綠色熒光的細(xì)胞數(shù)目。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Myocardin片段的獲取

重組pET30a-myocardin表達(dá)載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶NcoI和XhoI雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，編碼myocardin蛋白質(zhì)的DNA序列長度為2 288 bp，從圖1中可以看出pET30a-myocardin經(jīng)酶切后有目標(biāo)片段出現(xiàn)，該片段長度在2 000～3 000 bp之間。

Figure 1. The agarose gel electophoresis result of recombinant plasmid pET30a-myocardin digested byNcoI andXhoI.

2 Myocardin重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)情況

重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-myocardin經(jīng)轉(zhuǎn)化后進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果顯示高濃度法獲取的蛋白質(zhì)表達(dá)量比常規(guī)誘導(dǎo)法高。重組myocardin蛋白質(zhì)量為97 kD，從圖2中可以看出常規(guī)誘導(dǎo)法和高濃度誘導(dǎo)法在90 kD～110 kD之間均有目標(biāo)片段出現(xiàn)。

3 Myocardin重組蛋白的分離純化效率

本研究的蛋白分離純化方法采用了3種不同的洗脫方式。結(jié)果顯示，采用新開發(fā)的2種洗脫方式(在常溫下用洗脫液溶解結(jié)合有目的蛋白的柱凝膠，溫和攪拌30 min，離心后取上清保存，見圖3B；在37 ℃用洗脫液溶解結(jié)合有目的蛋白的柱凝膠，溫和攪拌30 min，離心后取上清保存，見圖3C)，myocardin的蛋白洗脫量與傳統(tǒng)方法(圖3A所示的常溫下采用500 mmol/L的imidazole洗脫液進(jìn)行過柱洗脫)相比，效率有較大提高(P<0.05)。

4 Myocardin重組蛋白的鑒定

Figure 2. The expression of myocardin protein induced by high concentration method. M: marker; A: regular induction; B: high-concentration induction.

采用dot blot 方法檢測(cè)各次分離純化后的蛋白，結(jié)果可見目的蛋白在硝酸纖維素膜上出現(xiàn)明顯黑色斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照則不顯影，見圖4。

Figure 3. The elution effect of recombinant myocardin protein by different elution methods. M: marker; A: regular elution; B: stirred elution; C: warmed and stirred elution. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA.

Figure 4. The isolated and purified myocardin detected by dot blot.

5 納米-myocardin復(fù)合體轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期的研究[8]，納米轉(zhuǎn)導(dǎo)材料能夠以復(fù)合體的形式攜載蛋白，穿膜后在胞內(nèi)釋放并表達(dá)；且納米粒子與蛋白質(zhì)的最適摩爾比為4 ∶1，此時(shí)綠色熒光強(qiáng)度最大。把納米-myocardin復(fù)合體轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后可見轉(zhuǎn)染率高達(dá)95%，見圖5。

6 Myocardin重組蛋白能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向平滑肌樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化

細(xì)胞培養(yǎng)基中加入myocardin重組蛋白后，hBMSCs開始向平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。細(xì)胞培養(yǎng)至第8天時(shí)，采用qPCR的方法檢測(cè)了平滑肌的特異性標(biāo)志物平滑肌細(xì)胞分化特異性抗原SMTN和鈣結(jié)合蛋白CALD的mRNA表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)myocardin重組蛋白能夠明顯促進(jìn)SMTN和CALD的mRNA表達(dá)，見圖6A；同時(shí)對(duì)平滑肌的特異性標(biāo)志物smMHC進(jìn)行檢測(cè)，顯微鏡下計(jì)數(shù)每1 000個(gè)細(xì)胞中有綠色熒光(smMHC)的細(xì)胞數(shù)目，陽性細(xì)胞占(17.37±0.07)%，見圖6B。Myocardin重組蛋白誘導(dǎo)至第8天時(shí)，可見hBMSCs向平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化，見圖7。

Figure 5. Observation of bone marrow mesenchymal stem cells transfected with nano-myocardin complexes. The scale bar=100 μm. Mean±SD.n=3.**P<0.05vscontrol group.

Figure 6. The expression of specific markers of vSMCs in the cells after adding myocardin recombinant protein. A: the mRNA expression of smoothelin and caldesmon in the cells; B: the number of smMHC-positive cells in every 1 000 cells was counted under microscope. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsMSCs.

Figure 7. The expression of the smooth muscle cell marker after adding myocardin recombinant protein. The scale bar=100 μm. A: DAPI showed blue; B: smMHC showed green; C: Merged.

討 論

隨著生物技術(shù)迅速發(fā)展，利用DNA重組技術(shù)，將我們所需的編碼蛋白DNA序列克隆到表達(dá)載體上，能實(shí)現(xiàn)目的蛋白的大量表達(dá)。目前，表達(dá)蛋白已經(jīng)變得相對(duì)比較容易，但由于蛋白的多樣性，純化就顯得非常繁雜，尤其對(duì)于不熟悉純化的研究者而言，往往是一個(gè)技術(shù)的瓶頸。本研究利用鎳柱親和層析來分離純化所得裂解上清中的myocardin蛋白，分離效果較好。由于鎳對(duì)含有6個(gè)組氨酸蛋白具有特異吸附能力，在天然或變性條件下，對(duì)于表達(dá)系統(tǒng)中含組氨酸親和標(biāo)簽蛋白，具有較好的純化效果。

但在研究過程中，經(jīng)常會(huì)遇到蛋白保留在層析柱中難洗脫的情況，即使采用更強(qiáng)的洗脫條件，如直接用500 mmol/L咪唑加到6 mol/L鹽酸胍進(jìn)行洗脫，在親和柱上仍會(huì)有大部分目的蛋白吸附。因此，對(duì)于采用常規(guī)方法難于洗脫的蛋白，能開發(fā)出一種能夠充分洗脫的方法顯得非常有意義。本研究采用洗脫液溶解結(jié)合有目的蛋白的柱凝膠，溫和攪拌30 min，離心后取上清保存方法，與傳統(tǒng)方法相比較，洗脫效果更好。

目前細(xì)胞重編程是采用病毒、miRNA或化學(xué)小分子的方式進(jìn)行的。病毒或者質(zhì)粒的方式過表達(dá)重編程因子效率低下，并且由于安全性問題，病毒介導(dǎo)方式或者基因整合機(jī)制會(huì)給臨床應(yīng)用帶來安全隱患。小分子化合物是通過影響細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)而達(dá)到重編程效果的，由于不同細(xì)胞和同類細(xì)胞內(nèi)信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，小分子誘導(dǎo)難以獲得穩(wěn)定而高效的重編程效果。而相對(duì)安全的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)方式是非病毒、非基因整合技術(shù)，安全而有效，具備較大的臨床應(yīng)用可能性。大多數(shù)外源性蛋白質(zhì)分子不能自由進(jìn)出細(xì)胞膜，而難以發(fā)揮生物效應(yīng)，需要一個(gè)載體來協(xié)助目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。研究顯示TAT穿膜肽和碳納米管等載體類型效率并不高[9-10]，為解決這個(gè)難題，我們先前的研究采用新型納米材料轉(zhuǎn)運(yùn)GATA4、HAND2、MEF2C和TBX5等心臟特異性轉(zhuǎn)錄因子到人成纖維細(xì)胞內(nèi)，成功將其重編程為心臟祖細(xì)胞[11]。但目前尚未有采用此方法獲得血管平滑肌的報(bào)道。

本研究中所獲得的純化蛋白經(jīng)鑒定后，使用本實(shí)驗(yàn)室前期的研究所得的納米轉(zhuǎn)導(dǎo)材料，與myocardin形成復(fù)合體后轉(zhuǎn)染骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，其轉(zhuǎn)染率較高。與目前轉(zhuǎn)染應(yīng)用最多的病毒型載體相比，具有轉(zhuǎn)染效率高，安全性好，可避免病毒的免疫排斥反應(yīng)和所介導(dǎo)的隨機(jī)整合等可能潛在危害等優(yōu)點(diǎn)。而hBMSCs經(jīng)myocardin重組蛋白干預(yù)后，hBMSCs開始向平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。以上結(jié)果提示，本研究所構(gòu)建的myocardin重組蛋白能應(yīng)用細(xì)胞重編程中，為平滑肌細(xì)胞的再生提供了一個(gè)新途徑。但存在的問題是重編程成為iSMCs的效率還不夠高，仍需進(jìn)一步研究改進(jìn)方案。后續(xù)仍需繼續(xù)探索iSMCs作為種子細(xì)胞在人工血管等組織工程中的運(yùn)用。