氫分子通過(guò)激活自噬抑制C/EBP同源蛋白介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡*

田 華， 高聰聰， 鄭冠琳， 姚來(lái)彬， 焦 鵬， 楊娜娜， 孔雅茹， 姚樹(shù)桐, 4△， 秦樹(shù)存△

(泰山醫(yī)學(xué)院1動(dòng)脈粥樣硬化研究所， 山東省高校動(dòng)脈粥樣硬化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2生命科學(xué)學(xué)院，4基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 山東 泰安 271016;3泰山護(hù)理職業(yè)學(xué)院， 山東 泰安 271000)

易損斑塊形成和破裂是造成動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)病變晚期臨床急性癥狀的主要原因，而大量細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致易損斑塊形成，并影響其穩(wěn)定性的重要因素。對(duì)心性猝死患者冠脈粥樣斑塊的研究證實(shí)，斑塊內(nèi)的凋亡細(xì)胞主要為巨噬細(xì)胞，提示巨噬細(xì)胞凋亡與AS斑塊穩(wěn)定性密切相關(guān)。因此，目前有研究者認(rèn)為干預(yù)巨噬細(xì)胞的凋亡過(guò)程可能對(duì)阻止AS進(jìn)展及降低心腦血管病事件發(fā)生率具有重要意義[1]。文獻(xiàn)報(bào)道[2-3]和我們既往研究證實(shí)，氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)[4]可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)反應(yīng)，并上調(diào)C/EBP 同 源 蛋 白(C/EBP homologous protein，CHOP)表達(dá)，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡，降低AS斑塊穩(wěn)定性，而載脂蛋白A-I(apoli-poprotein,A-I,ApoA-I) 模擬肽D4F[5]、槲皮素[6]和蜂膠醇提物[7]可通過(guò)抑制 CHOP 表達(dá)減輕巨噬細(xì)胞凋亡。

氫分子(hydrogen,H2)是世界上最輕且最豐富的化學(xué)元素，具有抗氧化、抗炎和抗凋亡等生物學(xué)作用[8]，我們既往研究證實(shí), 氫分子可以減輕博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化[9]；抑制腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體1(lectin-like oxidized LDL receptor，LOX-1)表達(dá)，從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞[10]；降低高脂喂養(yǎng)的ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠的AS易感性[11]；抑制高脂喂養(yǎng)的LDL受體敲除(LDLR-/-)小鼠AS斑塊的ERS反應(yīng)，減少斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞凋亡，增加AS斑塊穩(wěn)定性[12]，但是氫分子對(duì)ERS凋亡途徑的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。

自噬是真核細(xì)胞利用溶酶體降解細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器及蛋白等大分子物質(zhì)的過(guò)程，常在營(yíng)養(yǎng)缺乏、組織缺氧、氧化應(yīng)激和DNA損傷等情況下被激活。機(jī)體可通過(guò)自噬回收利用內(nèi)源性細(xì)胞成分(氨基酸、游離脂肪酸和核苷酸)以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[13]。文獻(xiàn)報(bào)道巨噬細(xì)胞內(nèi)ox-LDL的蓄積會(huì)引起氧化應(yīng)激，進(jìn)而觸發(fā)AS斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的自噬，而自噬的激活可減輕AS病變，增強(qiáng)斑塊的穩(wěn)定性[14]。敲除斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞自噬關(guān)鍵基因——自噬相關(guān)基因5(auto-phagy-related gene 5，ATG5)后，細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激水平明顯增加，且自噬缺陷的凋亡細(xì)胞被吞噬細(xì)胞識(shí)別并清除的作用減弱，斑塊內(nèi)壞死核心增加，斑塊的穩(wěn)定性下降[15]。本課題組既往研究證實(shí)自噬通過(guò)抑制CHOP表達(dá)減輕ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡[16]，提示自噬反應(yīng)的激活可減緩AS進(jìn)展，增強(qiáng)斑塊穩(wěn)定性，其機(jī)制可能與調(diào)控ERS反應(yīng)有關(guān)。本研究在ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡模型的基礎(chǔ)上，研究氫分子對(duì)CHOP介導(dǎo)的ERS凋亡途徑的抑制作用，并探討其上游機(jī)制是否與激活自噬有關(guān)。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

ox-LDL購(gòu)自北京協(xié)生生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco；抗beclin-1、CHOP和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)多克隆抗體分別購(gòu)自Cell Signaling Technology和Santa Cruz；3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)、雷帕霉素(rapa-mycin，Rap)和兔抗β-actin多克隆抗體購(gòu)自Sigma；Alexa Fluor 488標(biāo)記驢抗兔IgG(H+L)購(gòu)自Molecular Probes;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG購(gòu)自北京中杉金橋；四甲基偶氮唑藍(lán)[3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT]購(gòu)自Genview;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物技術(shù)公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京凱基公司；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒購(gòu)自Pierce;PVDF膜購(gòu)自Millipore；其余試劑均為分析純產(chǎn)品。

2 方法

2.1飽和氫培養(yǎng)基的制備 根據(jù)以往報(bào)道的方法進(jìn)行制備[17]，使用AYH-300型氫氣發(fā)生器(北京天雨澤科技有限公司)，在0.5 MPa壓力下，將純氫氣溶解于無(wú)菌DMEM培養(yǎng)基中，達(dá)到飽和水平持續(xù)4 h。所用飽和氫培養(yǎng)基均為每次使用前新鮮配制，以維持氫氣濃度不低于0.6 mmol/L。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 鼠源RAW264.7巨噬細(xì)胞和人源THP-1巨噬細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)。其中，RAW264.7巨噬細(xì)胞用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。處理前更換為無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基同步化12 h，然后隨機(jī)分為如下7組：(1) 正常對(duì)照(control)組；常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)；(2) 氫分子對(duì)照(H2)組：飽和含氫培養(yǎng)基培養(yǎng)；(3) ox-LDL組：常規(guī)培養(yǎng)基中加入100 mg/L ox-LDL；(4) 氫分子處理(H2+ox-LDL)組：飽和含氫培養(yǎng)基中加入100 mg/L ox-LDL；(5) 氫分子和3-MA同時(shí)處理(3-MA+H2+ox-LDL)組：飽和含氫培養(yǎng)基中先加入5 mmol/L 3-MA預(yù)處理1 h，再加入100 mg/L ox-LDL；(6) ox-LDL和Rap同時(shí)處理(Rap+ox-LDL)組：常規(guī)培養(yǎng)基中先加入3 μmol/L Rap預(yù)處理1 h，再加入100 mg/L ox-LDL；(7) 氫分子和Rap同時(shí)處理(Rap+H2+ox-LDL)組：飽和含氫培養(yǎng)基中先加入3 μmol/L Rap預(yù)處理1 h，再加入100 mg /L ox-LDL。人源THP-1巨噬細(xì)胞用含10%胎牛血清和L-谷氨酰胺(2 mmol/L)的RPMI-1640培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并用100 nmol/L佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)處理3 d,誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，然后隨機(jī)分為如下3組：(1) 正常對(duì)照(control)組:常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)；(2) ox-LDL組：培養(yǎng)基中加入100 mg/L ox-LDL；(3) 氫分子處理(H2+ox-LDL)組：飽和含氫培養(yǎng)基中加入100 mg/L ox-LDL。各組培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。

2.3細(xì)胞活力和 LDH活性的測(cè)定 細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板，按上述分組處理后，按既往報(bào)道的 MTT方法[7]檢測(cè)細(xì)胞活力，以正常對(duì)照組細(xì)胞活力為100%，其余各組細(xì)胞活力以其吸光度(A) 值占正常對(duì)照組A值的百分比表示。同時(shí)，按照LDH活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定培養(yǎng)基中LDH水平，進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞損傷程度。

2.4Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞按上述分組處理后，收集并重懸于500 μL上樣緩沖液中，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)室溫下避光孵育15 min，由流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson)分析測(cè)定細(xì)胞凋亡率?？偧?xì)胞凋亡率(%) =早期凋亡率(Annexin+/PI-)+晚期凋亡率(Annexin+/PI+)。

2.5Western blot分析 采用RIPA試劑提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。等量蛋白采用10% SDS-PAGE進(jìn)行分離，然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫封閉，分別加入兔抗beclin-1(1 ∶500)、CHOP(1 ∶200) 和β-actin(1 ∶1 000)多克隆抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，室溫下洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶山羊抗兔IgG孵育2 h，洗膜后用化學(xué)顯色底物 ECL進(jìn)行發(fā)光顯示，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海歐翔科學(xué)儀器有限公司)進(jìn)行圖像采集。采用Image-Pro Plus圖像分析軟件(Version 6.0，Media Cybernetics)分析蛋白條帶的積分吸光度(integral absorption，IA)值，以靶蛋白IA值/β-actinIA值的比值反映靶蛋白相對(duì)水平。

2.6免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)LC3的表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)于蓋有無(wú)菌蓋玻片的6孔培養(yǎng)板內(nèi)，處理后經(jīng)PBS潤(rùn)洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS潤(rùn)洗后以0.1% Triton X-100室溫處理5 min，10%驢血清封閉，滴加兔抗小鼠LC3的 I 抗(1 ∶100)，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS潤(rùn)洗后滴加Alexa Fluor 488標(biāo)記驢抗兔IgG(1 ∶ 1 000)，37 ℃孵育30 min，以DAPI復(fù)染細(xì)胞核(藍(lán)色)，PBS充分潤(rùn)洗后以抗淬滅劑封片。激光共聚焦顯微鏡(Nikon)下觀察，LC3陽(yáng)性表達(dá)呈綠色，呈顆粒狀聚集表明發(fā)生自噬反應(yīng)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用SNK法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 氫分子抑制ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞損傷

以100 mg/L ox-LDL處理RAW264.7細(xì)胞24 h可明顯誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，與對(duì)照組比較，細(xì)胞活力顯著降低，LDH漏出增加(P<0.01);而氫分子可明顯減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞損傷，與ox-LDL組相比，細(xì)胞活力增加，LDH漏出減少(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖1。

2 氫分子抑制ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡

ox-LDL處理組的RAW264.7細(xì)胞凋亡率較正常對(duì)照組明顯增加 (P<0.01)；而與ox-LDL 處理組比較，氫分子處理組細(xì)胞凋亡率顯著降低 (P<0.01)，見(jiàn)圖 2。

Figure 1. The effect of hydrogen on the injury of RAW264.7 macrophages induced by ox-LDL. Mean±SD.n=6.* P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05，##P<0. 01vsox-LDL group.

3 氫分子對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞beclin-1和CHOP蛋白表達(dá)的影響

Beclin-1和CHOP分別是自噬啟動(dòng)和ERS凋亡途徑的關(guān)鍵分子，Western blot結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，ox-LDL處理組RAW264.7細(xì)胞中beclin-1和CHOP表達(dá)水平均明顯增加(P<0.05或P<0.01)；與ox-LDL 處理組比較，氫分子處理組的beclin-1表達(dá)進(jìn)一步增加(P<0.01)，而CHOP的表達(dá)水平明顯下降(P< 0.01)，表明氫分子可增強(qiáng)ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬反應(yīng)，同時(shí)可抑制CHOP介導(dǎo)的ERS凋亡途徑，見(jiàn)圖3。

4 氫分子通過(guò)激活自噬抑制ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞損傷

為了進(jìn)一步明確氫分子可能通過(guò)誘導(dǎo)自噬而減輕ox-LDL所致的巨噬細(xì)胞凋亡，我們分別應(yīng)用自噬抑制劑3-MA和自噬誘導(dǎo)劑Rap處理RAW264.7細(xì)胞，觀察其對(duì)氫分子保護(hù)巨噬細(xì)胞的拮抗或促進(jìn)作用。結(jié)果顯示，氫分子對(duì)ox-LDL所致的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞活力降低的抑制作用可被3-MA所拮抗，而被Rap進(jìn)一步增強(qiáng)(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖 4。

Figure 2. The effect of hydrogen on the apoptosis of RAW264.7 macrophages induced by ox-LDL． Mean±SD.n=6.*P<0.05,** P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsox-LDL group.

Figure 3. The effect of hydrogen on the expression of beclin-1 and CHOP in RAW264.7 macrophages induced by ox-LDL. Mean±SD.n=3.*P<0.05,** P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsox-LDL group.

Figure 4. Hydrogen inhibited ox-LDL-induced injury of RAW264.7 macrophages by activating autophagy. A: the apoptotic rates were assayed by Annexin V-FITC/PI staining; B: the cell vability was measured by MTT assay.Mean±SD.n=6.* P<0.05,** P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsox-LDL group;&P<0.05,&&P<0.01vsH2+ox-LDL group.

5 氫分子通過(guò)激活自噬抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞CHOP上調(diào)

LC3是自噬的另一個(gè)標(biāo)志分子，自噬發(fā)生后，LC3-I經(jīng)泛素樣加工修飾形成 LC3-II，進(jìn)而整合到自噬體膜中，在自噬體形成中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)LC3聚集情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，經(jīng)ox-LDL處理RAW264.7細(xì)胞24 h后，LC3顆?；奂黠@；氫分子可促進(jìn)ox-LDL的上述作用，且這種促進(jìn)作用可被3-MA減弱，而被Rap進(jìn)一步增強(qiáng)，見(jiàn)圖5A。

與LC3的結(jié)果一致，Western blot結(jié)果顯示，氫分子對(duì)ox-LDL所致beclin-1表達(dá)上調(diào)的促進(jìn)作用可被3-MA抑制(P<0.01)，而被Rap進(jìn)一步增強(qiáng)(P<0.01)。另外，氫分子對(duì)ox-LDL所致CHOP表達(dá)上調(diào)的抑制作用亦可被3-MA減弱(P<0.01)，而被Rap進(jìn)一步增強(qiáng)(P<0.01)，見(jiàn)圖5B。上述結(jié)果表明氫分子可通過(guò)誘導(dǎo)自噬減輕CHOP介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡。

6 氫分子對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的人源巨噬細(xì)胞THP-1凋亡及beclin-1和CHOP表達(dá)的影響

ox-LDL處理組THP-1巨噬細(xì)胞凋亡率較正常對(duì)照組明顯增加(P<0.01)；而與ox-LDL 處理組比較，氫分子處理組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖6A。Western blot結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，ox-LDL處理組細(xì)胞beclin-1表達(dá)有上升趨勢(shì)，CHOP表達(dá)水平明顯增加(P<0.01)；與ox-LDL 處理組比較，氫分子處理組beclin-1表達(dá)進(jìn)一步增加(P<0.01)，而CHOP表達(dá)水平明顯下降(P<0.01)，見(jiàn)圖6B，表明氫分子可增強(qiáng)自噬反應(yīng)，同時(shí)可抑制CHOP所介導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞凋亡。

討 論

巨噬細(xì)胞是在AS進(jìn)展，尤其是泡沫細(xì)胞和易損斑塊形成中起著關(guān)鍵作用的炎癥細(xì)胞。大量巨噬細(xì)胞凋亡不僅直接導(dǎo)致凋亡的平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞不能被有效吞噬，促進(jìn)脂質(zhì)核心的形成及增大，而且富含游離膽固醇的凋亡巨噬細(xì)胞通過(guò)釋放基質(zhì)降解蛋白酶損傷纖維帽，并產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-1β，引起繼發(fā)性炎癥反應(yīng)和壞死，從而促進(jìn)斑塊不穩(wěn)定[1]。我們既往研究證實(shí)了腹腔注射飽和含氫生理鹽水可以抑制ApoE-/-小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低血漿膽固醇和載脂蛋白B含量，并減輕AS斑塊中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)及炎癥因子表達(dá)，進(jìn)而抑制AS進(jìn)展[11]。本研究在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)氫分子可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞活力增加，LDH漏出減少及細(xì)胞凋亡率降低。

Figure 5. Hydrogen inhibited ox-LDL-induced CHOP upregulation by activating autophagy. A: immunofluorescence experiments showed LC3 visualized by Alexa Fluor 488 labeling (green) and nuclei stained with DAPI (blue). The representative fluorescent images captured using a laser scanning confocal microscope were showed. The scale bar = 20 μm. B: the protein expression of beclin-1 and CHOP was analyzed by Western blot. Mean±SD.n=6.* P<0.05,** P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsox-LDL group;△△P<0.01vsH2+ox-LDL group;▲▲P<0.01vsRap+ox-LDL group.

Figure 6. The effect of hydrogen on the apoptosis and the expression of beclin-1 and CHOP in THP-1-derived macrophages induced by ox-LDL. A: the ratio of apoptotic cells stained with Annexin V-FITC and PI was detected by flow cytometry analysis; B: the protein levels of beclin-1 and CHOP were determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,** P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsox-LDL group.

CHOP 又稱(chēng)生長(zhǎng)停滯和DNA損害誘導(dǎo)基因153(growth arrest and DNA damage-inducible gene 153，GADD153)，是介導(dǎo)ERS 相關(guān)凋亡途徑的關(guān)鍵分子之一。大量研究表明，CHOP介導(dǎo)AS粥樣斑塊中巨噬細(xì)胞凋亡，并與AS斑塊易損性密切相關(guān)[3, 18]。我們既往研究也證實(shí)，CHOP信號(hào)途徑介導(dǎo)ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡，而D4F、槲皮素和蜂膠醇提物可通過(guò)抑制該信號(hào)途徑減輕巨噬細(xì)胞凋亡[4-7]，表明CHOP介導(dǎo)的ERS相關(guān)凋亡途徑參與AS的發(fā)生發(fā)展，并有可能成為AS防治的重要靶點(diǎn)。另外我們?cè)贚DLR-/-小鼠AS模型上證實(shí)氫分子可通過(guò)抑制ERS和氧化應(yīng)激途徑減少粥樣斑塊中巨噬細(xì)胞凋亡，從而增加斑塊穩(wěn)定性[12]。本研究在體外實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)氫分子可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞CHOP表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而減輕巨噬細(xì)胞凋亡。

自噬是保持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要過(guò)程，可以被饑餓、病原入侵和氧化應(yīng)激等誘導(dǎo)。自噬始于雙層膜自噬體結(jié)構(gòu)形成，稱(chēng)為吞噬泡。自噬體在延伸過(guò)程中包裹脂滴、蛋白質(zhì)聚集體和受損細(xì)胞器等胞內(nèi)物質(zhì)，并逐步延伸、成熟，形成自噬體，當(dāng)其與溶酶體融合時(shí)，可轉(zhuǎn)變?yōu)閱螌幽そY(jié)構(gòu)的自噬溶酶體。溶酶體的酸性環(huán)境及大量水解酶使物質(zhì)變性水解，進(jìn)一步降解為被細(xì)胞循環(huán)利用的代謝產(chǎn)物[19]。脂質(zhì)過(guò)載的泡沫細(xì)胞是導(dǎo)致炎性反應(yīng)和斑塊進(jìn)展的主要原因。巨噬細(xì)胞自噬不足使大量泡沫細(xì)胞聚集，脂質(zhì)清除缺陷，膽固醇的流出減少[20]，細(xì)胞內(nèi)聚集受損的線(xiàn)粒體，造成細(xì)胞內(nèi)活性氧水平上升，并激活炎癥因子，造成DNA損傷，最終導(dǎo)致泡沫細(xì)胞凋亡，進(jìn)而增加斑塊破裂的風(fēng)險(xiǎn)。巨噬細(xì)胞自噬作為一種代償機(jī)制，能夠減輕上述因素對(duì)斑塊的不良影響[21-22],提示自噬作為一種細(xì)胞自穩(wěn)態(tài)調(diào)控機(jī)制，可能對(duì)AS進(jìn)展具有延緩作用。近期關(guān)于氫分子調(diào)控自噬的文獻(xiàn)報(bào)道并不一致，一方面富氫液可以通過(guò)激活自噬減輕帶狀皰疹后神經(jīng)痛大鼠的機(jī)械痛敏和炎癥因子的釋放[23]，飽和氫鹽水通過(guò)抑制ERS并增強(qiáng)自噬而對(duì)新生小鼠缺氧缺血性腦損傷起到神經(jīng)保護(hù)作用[24]；另一方面，氫水可有效抑制反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)造成的海馬組織超微結(jié)構(gòu)、氧化應(yīng)激損傷及細(xì)胞自噬現(xiàn)象[25]，飽和氫鹽水可降低心肌細(xì)胞自噬，減輕老年大鼠心肌缺血再灌注損傷[26]。對(duì)于這些現(xiàn)象，我們推測(cè)可能與氫分子在不同疾病模型中對(duì)自噬的調(diào)控作用及機(jī)制不同有關(guān)。我們既往研究證實(shí)，ox-LDL可經(jīng)ERS途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬，而一定程度的自噬又可以通過(guò)抑制CHOP表達(dá)而減輕ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[16]，提示自噬對(duì)CHOP介導(dǎo)的ERS凋亡途徑可能具有調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氫分子可進(jìn)一步上調(diào)ox-LDL誘導(dǎo)的自噬標(biāo)志分子beclin-1表達(dá)，并促進(jìn)LC3聚集，且該作用可被自噬抑制劑3-MA減弱，而被自噬誘導(dǎo)劑Rap增強(qiáng)。另外，氫分子對(duì)ox-LDL所致的RAW264.7巨噬細(xì)胞凋亡和細(xì)胞活力降低及CHOP上調(diào)的抑制作用也可被3-MA拮抗，而被Rap促進(jìn)；在ox-LDL誘導(dǎo)的人源 THP-1巨噬細(xì)胞凋亡模型上也觀察到氫分子不僅可抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡和CHOP上調(diào)，也可使beclin-1表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，提示氫分子可通過(guò)上調(diào)巨噬細(xì)胞自噬抑制CHOP介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究表明氫分子可通過(guò)抑制CHOP表達(dá)減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡，其上游機(jī)制可能是通過(guò)激活自噬實(shí)現(xiàn)的。