微波熱療協(xié)同吉西他濱抑制人肺鱗癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡機(jī)制研究

楊洋 趙妍妍 馬勝林 楊道科

肺癌是世界上癌癥相關(guān)死亡的主要原因，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）約占肺癌的80%-85%[1]，肺鱗癌作為NSCLC常見(jiàn)的類型之一，經(jīng)過(guò)手術(shù)、放化療等治療后，其5年生存率仍低于15%[2]。最新美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network,NCCN）指南提出肺鱗癌的一線治療方案仍然是吉西他濱與鉑類藥物聯(lián)用，然而大多數(shù)患者接受了一線治療方案后常出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，進(jìn)而不可避免地使腫瘤發(fā)生進(jìn)展[3]。對(duì)于一線治療失敗的患者，NCCN指南推薦多西他賽作為肺鱗癌的二線治療，但由于多西他賽毒性反應(yīng)顯著，臨床用藥常常受到限制[4,5]。盡管分子靶向藥物和免疫治療在肺腺癌的治療中取得了重大作用，但對(duì)于肺鱗癌而言，目前尚無(wú)明確的靶向藥物治療。因此在新的有效藥物出現(xiàn)之前，如何提高肺鱗癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性或者發(fā)現(xiàn)新的聯(lián)合療法對(duì)臨床上提高患者的有效生存時(shí)間和生活質(zhì)量顯得尤為重要。

近年來(lái)，微波熱療因其安全有效、毒副作用小、患者耐受性好等優(yōu)點(diǎn)在臨床上被廣泛應(yīng)用，如：肝癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌等[6-11]，但單純的微波熱療往往難以取得顯著的治療效果，其常與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用以提高化療療效。臨床上，微波熱療聯(lián)合吉西他濱治療肺鱗癌雖已取得顯著療效，但具體的分子機(jī)制尚不明確。因此，本課題組自主研發(fā)了與臨床微波熱療原理一致的供基礎(chǔ)研究使用的微波熱療儀，以探索與吉西他濱藥物聯(lián)合使用對(duì)肺鱗癌細(xì)胞增殖抑制的影響及誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制，從而為肺鱗癌的精準(zhǔn)治療提供新的思路，為改善患者的不良預(yù)后探索新的方案。

1 材料和方法

1.1 主要儀器與試劑 微波熱療儀（專利號(hào)：CN204824903U）；FACSCanto II型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；SpectraMaxM3型全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司）；ChemiDoc XRS+型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%）、吉西他濱（法國(guó)禮來(lái)公司）、CCK-8（美國(guó)MCE公司）；熒光素異硫氰酸（FITC）標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD公司）；Caspase-3和Caspase-8活性檢測(cè)試劑盒（中國(guó)碧云天）；Caspase-3抑制劑（AC-DEVD）（中國(guó)碧云天）；兔抗人Bcl-2抗體（美國(guó)CST公司）、兔抗人Bax抗體（美國(guó)CST公司）、兔抗人p53抗體（美國(guó)CST公司）、兔抗人Caspase-3抗體（美國(guó)CST公司）、兔抗人Cleaved-Caspase-3抗體（美國(guó)CST公司）、兔抗人PARP抗體（美國(guó)CST公司）和鼠抗人β-actin抗體（美國(guó)Abcam公司）；辣根過(guò)氧化酶（HRP）標(biāo)記的二抗（Abbkine公司）等。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺鱗癌細(xì)胞株NCI-H1703及NCI-H2170均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)，兩株細(xì)胞以含10%滅活胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞鋪展覆蓋培養(yǎng)瓶底部面積80%時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化，待鏡下觀察收縮至圓形且脫落時(shí)，加入RPMI-1640培養(yǎng)液終止消化，1,000 rpm 5 min離心后，按適當(dāng)比例（1:3）進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 微波熱療儀輸出功率及溫度的控制說(shuō)明 本課題組研發(fā)的應(yīng)用于腫瘤基礎(chǔ)研究的微波熱療儀（專利號(hào)：CN204824903 U）是由一個(gè)433 MHz的微波源、微波輻射器、光纖溫度計(jì)探頭、溫度自動(dòng)控制系統(tǒng)以及數(shù)據(jù)記錄和顯示系統(tǒng)（計(jì)算機(jī)）組成。在微波熱療期間，通過(guò)兩個(gè)光纖溫度計(jì)探頭測(cè)量培養(yǎng)細(xì)胞的溫度以及周圍循環(huán)水的溫度。此溫度計(jì)探頭測(cè)溫精度在±0.2℃以內(nèi)，可以避免微波對(duì)測(cè)溫的干擾。溫度自動(dòng)控制系統(tǒng)可以通過(guò)增加輸出功率使溫度保持在預(yù)先設(shè)定的恒定值（±0.2℃以內(nèi)），微波輸出功率的范圍在50 w-200 w。

1.4 CCK-8法檢測(cè)微波熱療和吉西他濱對(duì)人肺鱗癌細(xì)胞株NCI-H1703和NCI-H2170細(xì)胞增殖的影響 微波熱療溫度設(shè)置對(duì)照組（不加任何熱處理僅放置于37℃ 5%CO2孵箱內(nèi)）、40℃、41℃、42℃、43℃共5組，作用時(shí)間分別為30 min、60 min、90 min；每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肺鱗癌細(xì)胞NCI-H1703和NCI-H2170，0.25%胰酶消化洗滌后用完全培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種至96孔板中，每孔100 μL，37℃、5%CO2中培養(yǎng)24 h后對(duì)照組更換培養(yǎng)液繼續(xù)37℃、5%CO2中培養(yǎng)，微波熱療組（40℃、41℃、42℃及43℃）更換培養(yǎng)液后分別給予不同溫度微波熱療處理30 min、60 min、90 min后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄掉培養(yǎng)液，然后每孔加入含10%CCK-8的RPMI-1640培養(yǎng)液100 μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中再繼續(xù)培養(yǎng)1 h-3 h，將培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀上，以450 nm為測(cè)定波長(zhǎng)，測(cè)定各孔的吸光度OD值并計(jì)算細(xì)胞增殖率，以80%增殖率左右的處理組作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的微波熱療組（MW）。

吉西他濱設(shè)100 μmol/L、50 μmol/L、25 μmol/L、12.5 μmol/L、6.25 μmol/L、3.125 μmol/L、1.56 μmol/L、0 μmol/L共8個(gè)濃度組，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，以CCK-8法（方法同1.5）測(cè)定細(xì)胞增殖率，計(jì)算藥物濃度的IC50以及70%左右增殖率的藥物濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的吉西他濱組（Gem）。

微波熱療和吉西他濱以不同序貫方式進(jìn)行處理：熱化同時(shí)進(jìn)行組（加藥后立即進(jìn)行熱療，Gem and MW），先熱療后化療組（微波熱療后間隔24 h再化療，MW then Gem）以及先化療后熱療組（化療24 h PBS洗凈后微波熱療，Gem then MW）。以CCK-8法測(cè)定各組細(xì)胞的增殖情況（方法同1.5），根據(jù)Veleriote法[11]判定熱化療聯(lián)合的相互作用類型。協(xié)同作用：[C]＜[E]；相加作用：[C]=[E]；次加作用：[E]＜[C]＜[H]或[E]＜[C]＜[D]；干擾作用：[D]＜[C]＜[H]。其中：[H]為熱療組的細(xì)胞存活率，[D]為化療組的細(xì)胞存活率，[C]為熱化療組的細(xì)胞存活率，[E]為熱化療聯(lián)合的預(yù)估細(xì)胞存活率，[E]=[H]×[D]。并選出最佳序貫方法用于后續(xù)研究。

細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組OD均值/對(duì)照組OD均值×100%。

1.5 克隆形成實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCI-H1703和NCI-H2170細(xì)胞，消化成單個(gè)細(xì)胞懸液后，以1×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于4組6孔板中（對(duì)照組、微波熱療組、吉西他濱組以及熱化聯(lián)合組），置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別進(jìn)行相應(yīng)處理后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周。2周后取出，棄去原培養(yǎng)液，以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2遍后用0.1%的甲醛固定20 min，再用結(jié)晶紫染液染色20 min。PBS洗干凈后晾干，以＞50個(gè)細(xì)胞為1個(gè)克隆，顯微鏡下拍照計(jì)算細(xì)胞克隆形成數(shù)目。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCI-H1703和NCI-H2170細(xì)胞，消化成單個(gè)細(xì)胞懸液后，以1×106個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于4組6孔板中（對(duì)照組、微波熱療組、吉西他濱組以及熱化聯(lián)合組），置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別進(jìn)行相應(yīng)處理后，倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 AnnexinV-FITC/雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCI-H1703和NCI-H2170細(xì)胞，消化成單個(gè)細(xì)胞懸液后以5×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于4組6孔板中（對(duì)照組、微波熱療組、吉西他濱組以及熱化聯(lián)合組），將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別進(jìn)行相應(yīng)處理，24 h后收集上清培養(yǎng)液，用胰酶消化細(xì)胞并收集。之后加入300 μL的Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒中的緩沖液、5 μL的Annexin V-FITC染液，輕輕混勻后，于2℃-8℃避光條件下培養(yǎng)15 min。再加入5 μL的PI，輕輕混勻，于2℃-8℃避光條件下培養(yǎng)5 min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞總凋亡率（%）。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 Caspase-3、Caspase-8活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8酶活性 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCI-H1703和NCI-H2170細(xì)胞，消化成單個(gè)細(xì)胞懸液后以5×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于4組6孔板中（陰性對(duì)照組、微波熱療組、吉西他濱組以及熱化聯(lián)合組），將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別進(jìn)行相應(yīng)處理，24 h后收集上清培養(yǎng)液，用胰酶消化細(xì)胞并收集。之后按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行處理，然后將培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀上，以405 nm為測(cè)定波長(zhǎng)，測(cè)定各孔的吸光度OD值，通過(guò)Bradford法測(cè)定各組細(xì)胞的蛋白濃度，然后與ρNA標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比計(jì)算出各組細(xì)胞中催化產(chǎn)生的ρNA。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 CCK-8法檢測(cè)AC-DEVD（Caspase-3抑制劑）對(duì)細(xì)胞增殖的影響 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCI-H1703和NCI-H2170細(xì)胞，消化成單個(gè)細(xì)胞懸液后以1×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于4組96孔板中（陰性對(duì)照組、AC-DEVD組、熱化聯(lián)合組以及AC-DEVD+熱化聯(lián)合組），將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別進(jìn)行相應(yīng)處理后以CCK-8法（方法同1.5）測(cè)定各組細(xì)胞增殖率。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCI-H1703和NCI-H2170細(xì)胞，消化成單個(gè)細(xì)胞懸液后以5×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于4組6孔板中（陰性對(duì)照組、微波熱療組、吉西他濱組以及熱化聯(lián)合組），將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后分別進(jìn)行相應(yīng)處理，24 h后提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)BCA法測(cè)定蛋白濃度，取20 μL總蛋白上樣，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入1:1,000稀釋的一抗于4℃孵育過(guò)夜，用緩沖液TBST洗膜3次，每次10 min。然后加入HRP標(biāo)記的二抗（1:5,000），于室溫條件下孵育2 h，再用緩沖液TBST洗膜3次，每次5 min。用超敏化學(xué)發(fā)光試劑顯影檢測(cè)，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行圖像采集，以目標(biāo)蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0和GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及繪圖。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 微波熱療聯(lián)合吉西他濱抑制人肺鱗癌細(xì)胞的增殖 首先，為了選擇合適的微波熱療條件，我們將微波熱療溫度設(shè)置對(duì)照組（37℃）、40℃、41℃、42℃、43℃共5組，作用時(shí)間分別為30 min、60 min、90 min，采用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖率。其結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，43℃ 30 min微波熱療組細(xì)胞增殖率稍有下降（P＜0.05）；41℃、42℃以及43℃ 60 min微波熱療組細(xì)胞增殖率都有所下降（P＜0.05或P＜0.001）；40℃、41℃、42℃以及43℃ 90 min微波熱療組細(xì)胞增殖率下降（P＜0.001或P＜0.01）；這表明隨著溫度的升高，作用時(shí)間的延長(zhǎng)，兩株細(xì)胞的增殖率也隨之下降（圖1A-B），后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇42℃作用60 min的微波熱療組處理兩株細(xì)胞；接著CCK-8結(jié)果顯示吉西他濱對(duì)兩株肺鱗癌細(xì)胞（NCI-H2170和NCI-H1703）的增殖率呈明顯的濃度依賴性降低，吉西他濱作用于兩株肺鱗癌細(xì)胞24 h后的IC50分別為8.89 μmol/L和44.18 μmol/L，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇5 μmol/L處理兩株細(xì)胞（圖1C-D）；最后，與單獨(dú)吉西他濱組對(duì)比，三種熱化序貫方式的增殖率都有所下降（P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1E-F）。根據(jù)Veleriote法[11]判斷出熱化同時(shí)組和先熱療后化療組為次加作用；而先化療后微波熱療組具有協(xié)同作用（表1和表2）。后續(xù)實(shí)驗(yàn)熱化聯(lián)合組采用先化療后熱療的序貫方式。

2.2 微波熱療聯(lián)合吉西他濱抑制人肺鱗癌細(xì)胞的克隆形成 克隆形成試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：處理組的克隆形成數(shù)與對(duì)照組相比都有下降，且熱化聯(lián)合組下降的更為明顯；熱化聯(lián)合組與單藥化療組相比，克隆形成數(shù)也明顯下降（P＜0.001）。其中NCI-H1703細(xì)胞株對(duì)照組、微波熱療組、吉西他濱組和熱化聯(lián)合組的克隆形成數(shù)分別為（182.67±5.86）個(gè)、（143.67±5.67）個(gè)、（137.00±5.00）個(gè)、（17.67±1.53）個(gè)；NCI-H2170細(xì)胞株克隆形成數(shù)分別為（187.67±7.09）個(gè)、（141.00±4.58）個(gè)、（125.00±5.57）個(gè)、（24.67±2.52）個(gè)（圖2）。

2.3 微波熱療聯(lián)合吉西他濱促進(jìn)人肺鱗癌細(xì)胞發(fā)生Caspase-3依賴性凋亡 首先倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化：兩株細(xì)胞的對(duì)照組其膜完整，細(xì)胞狀態(tài)良好，邊緣清晰；微波熱療組和吉西他濱組出現(xiàn)少量皺縮和空泡漂浮的細(xì)胞；熱化聯(lián)合組細(xì)胞皺縮脫落和空泡增多，其貼壁的細(xì)胞呈不規(guī)則生長(zhǎng)，邊緣模糊，折光率增高（圖3）。然后采用Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，其凋亡結(jié)果顯示：兩株細(xì)胞熱化聯(lián)合組對(duì)比其他三組，細(xì)胞總凋亡率顯著增加（P＜0.001）。其中NCI-H1703細(xì)胞株4組總凋亡率分別為（4.37±0.50）%、（16.57±5.68）%、（22.60±3.38）%、（45.63±1.33）%；NCI-H2170細(xì)胞株4組總凋亡率分別為（8.07±1.63）%、（13.47±3.84）%、（19.20±3.47）%、（65.01±6.07）%（圖4A）。接著采用Caspase-3、Caspase-8活性檢測(cè)試劑檢測(cè)各組細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8酶活性，其結(jié)果顯示：與其他三組相比，兩株細(xì)胞熱化聯(lián)合組Caspase-3酶活性表達(dá)量明顯上調(diào)（P＜0.01）（圖4Bb）；但與單獨(dú)化療組相比，兩株細(xì)胞熱化聯(lián)合組Caspase-8酶活性表達(dá)量無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖4Bc）。為更進(jìn)一步驗(yàn)證微波熱療聯(lián)合吉西他濱是否促進(jìn)人肺鱗癌細(xì)胞發(fā)生Caspase-3依賴性凋亡，采用CCK-8法檢測(cè)加入AC-DEVD（Caspase-3抑制劑）后熱化聯(lián)合組細(xì)胞的增殖情況，其結(jié)果顯示：加入AC-DEVD（Caspase-3抑制劑）后熱化聯(lián)合組細(xì)胞的增殖率高于熱化聯(lián)合組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）（圖4Bd）。

2.4 微波熱療聯(lián)合吉西他濱上調(diào)人肺鱗癌細(xì)胞中促凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 兩株細(xì)胞經(jīng)微波熱療、吉西他濱以及微波熱療聯(lián)合吉西他濱處理后應(yīng)用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況，其結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，兩株細(xì)胞微波熱療聯(lián)合吉西他濱組p53、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-PARP以及Bax蛋白明顯上調(diào)（P＜0.001），而PARP、Bcl-2蛋白明顯下調(diào)（P＜0.001）；與吉西他濱組相比，微波熱療聯(lián)合吉西他濱組p53、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-PARP蛋白明顯上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），而B(niǎo)cl-2蛋白下調(diào)（P＜0.001）（圖5）。

圖1 微波熱療和吉西他濱對(duì)兩株肺鱗癌細(xì)胞的增殖影響。A、B：不同溫度微波熱療作用不同時(shí)間對(duì)肺鱗癌細(xì)胞增殖影響；C、D：不同濃度吉西他濱對(duì)肺鱗癌增殖影響；E：微波熱療與吉西他濱不同序貫方式示意圖；F、G：不同序貫方式對(duì)細(xì)胞增殖的影響。與對(duì)照組相比，*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001；與吉西他濱組相比，#：P＜0.05，##：P＜0.01，###：P＜0.001。Fig 1 The effects of microwave hyperthermia and gemcitabine on the proliferation of two lung squamous cell carcinoma cells.A,B:Effects of microwave hyperthermia at different temperatures and different times on the proliferation of lung squamous cell carcinoma cells;C,D:Effects of different concentrations of gemcitabine on the proliferation of lung squamous cell carcinoma cells;E:Diagrams of different sequential methods;F,G:Proliferation of the two cells in different sequential ways.Compared with the control group,*:P＜0.05,**:P＜0.01,***:P＜0.001;compared with the gemcitabine group,#:P＜0.05,##:P＜0.01,###:P＜0.001.

3 討論

時(shí)至今日，肺癌依舊占據(jù)著世界癌癥發(fā)生率和死亡率的榜首，而我國(guó)肺癌發(fā)病率及死亡率也呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢(shì)。肺鱗癌作為肺癌常見(jiàn)的類型之一，發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已處于晚期，無(wú)法進(jìn)行手術(shù)治療，其5年生存率很低[12]，因此研究肺鱗癌新的抗腫瘤聯(lián)合療法顯得尤為重要。在本研究中，我們初步探討了微波熱療聯(lián)合吉西他濱在體外對(duì)肺鱗癌細(xì)胞株的增殖影響及誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制。

圖2 微波熱療聯(lián)合吉西他濱抑制兩株肺鱗癌細(xì)胞的克隆形成。A：克隆形成圖片；B：克隆數(shù)目統(tǒng)計(jì)柱狀分析。與對(duì)照組相比，***：P＜0.001；與吉西他濱組相比，###：P＜0.001。Fig 2 Microwave hyperthermia in combination with gemcitabine inhibits the clonal formation of both cells.A:Pictures of clone formation;B:The number of statistical clones under the microscope.Compared with the control group,***:P＜0.001;compared with the gemcitabine group,###:P＜0.001.

表1 Veleriote法判斷微波熱療與吉西他濱不同序貫方式聯(lián)合對(duì)NCI-H1703細(xì)胞的影響（細(xì)胞增殖率%）（Mean±SD,n=3）Tab 1 The effect of microwave hyperthermia and gemcitabine to NCI-H1703 by Veleriote method (cell proliferation%)(Mean±SD,n=3)

熱療對(duì)化療有明顯的協(xié)同促進(jìn)作用，熱療可以加快血流，增加血供，促進(jìn)化療藥物在腫瘤局部的積聚和攝取，并降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性。多數(shù)化療藥物最大增敏作用出現(xiàn)在熱化療同步進(jìn)行時(shí)[15]，但也有研究表明其最佳方案并不是熱化同步：丹麥Overgaard利用C3H小鼠乳腺癌研究Etoposide、Ifosphamide與熱療的體內(nèi)相互作用，結(jié)果顯示熱療與Etoposide或Ifosphamide聯(lián)用，對(duì)小鼠乳腺癌有明顯的腫瘤抑制作用，加熱前48 h注射Etoposide，治療效果增加1.5倍，獲得的最大效應(yīng)時(shí)間間隔長(zhǎng)于臨床常規(guī)聯(lián)合方案[16]。另有研究顯示吉西他濱體內(nèi)外試驗(yàn)其最大增敏作用出現(xiàn)在熱化療間隔前后24 h間[17-20]。本實(shí)驗(yàn)參考Satoko等[18]的序貫方法通過(guò)CCK-8法得出先化療后微波熱療對(duì)肺鱗癌的增殖抑制具有協(xié)同作用，為了更進(jìn)一步驗(yàn)證熱化聯(lián)合的協(xié)同作用我們進(jìn)行了克隆形成實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果與預(yù)期相符。

圖3 倒置顯微鏡下觀察肺鱗癌細(xì)胞株NCI-H1703（A）和NCI-H2170（B）處理后的形態(tài)學(xué)變化（200×）Fig 3 The morphological changes of lung squamous carcinoma cell lines NCI-H1703 (A) and NCI-H2170(B) were observed under an inverted microscope (200×)

表2 Veleriote法判斷微波熱療與吉西他濱不同序貫方式聯(lián)合對(duì)NCI-H2170細(xì)胞的影響（細(xì)胞增殖率%）（Mean±SD,n=3）Tab 2 The effect of microwave hyperthermia and gemcitabine to NCI-H2170 by Veleriote method (cell proliferation%)(Mean±SD,n=3)

圖4 微波熱療聯(lián)合吉西他濱誘導(dǎo)肺鱗癌細(xì)胞發(fā)生Caspase-3依賴性細(xì)胞凋亡。A：Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩株細(xì)胞的總凋亡率；B：a、b、c、d分別代表兩株細(xì)胞總凋亡率、Caspase-3活性檢測(cè)結(jié)果、Caspase-8活性檢測(cè)結(jié)果及Caspase-3抑制劑（AC-DEVD）對(duì)肺鱗癌細(xì)胞增殖影響。與對(duì)照組相比，*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001；與吉西他濱組相比，###：P＜0.001。Fig 4 Microwave hyperthermia in combination with gemcitabine induces Caspase-3 dependent apoptosis in lung squamous cell carcinoma.A:Annexin V-FITC/PI double staining flow cytometry was used to detect the total apoptosis rate of the two cells;B:a,b,c,d respectively represent the total apoptosis rate of two cells,Caspase-3 activity results,Caspase-8 activity results and Caspase-3 inhibitor (AC-DEVD) on lung squamous cell carcinoma cell proliferation.Compared with the control group,*:P＜0.05,**:P＜0.01,***:P＜0.001;compared with the gemcitabine group,###:P＜0.001.

癌細(xì)胞活性的降低往往與抗腫瘤方法誘導(dǎo)其凋亡密切相關(guān)，Caspase半胱氨酸蛋白酶家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，處于級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游的Caspase-3被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，多種凋亡刺激信號(hào)的傳遞均匯聚于Caspase-3，它的活化代表著細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段[23]。我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)微波熱療和吉西他濱對(duì)兩株肺鱗癌細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)微波熱療聯(lián)合吉西他濱總凋亡率顯著提高。接著通過(guò)Caspase-3、Caspase-8活性檢測(cè)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)微波熱療聯(lián)合吉西他濱組Caspase-3酶活性比單獨(dú)化療組明顯提高，而Caspase-8無(wú)明顯變化，這表明其誘導(dǎo)凋亡途徑主要依賴于Caspase-3。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)PARP即聚（ADP-核糖）聚合酶成為Caspase-3的重要切割底物，可加速凋亡進(jìn)程[24]。目前研究得最多、最詳細(xì)的凋亡途徑是由p53蛋白介導(dǎo)的。p53主要可上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)或者下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，激活下游的促凋亡基因來(lái)誘發(fā)凋亡[21,22]。已有研究表明先熱療（水浴）后吉西他濱治療NSCLC可上調(diào)Caspase-3蛋白從而誘導(dǎo)其凋亡[17]，然而微波熱療聯(lián)合化療誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究甚少。本實(shí)驗(yàn)首次利用自主研發(fā)的微波熱療儀與吉西他濱聯(lián)合探索其誘導(dǎo)肺鱗癌凋亡的機(jī)制，我們發(fā)現(xiàn)先吉西他濱后微波熱療作用于肺鱗癌細(xì)胞后與單獨(dú)化療相比，p53蛋白明顯上調(diào)，并可發(fā)生Caspase-3的活化及PARP切割，表明其抑制肺鱗癌細(xì)胞的活性可能與誘導(dǎo)Caspase-3依賴性凋亡密切相關(guān)。

綜上所述，本研究從細(xì)胞和分子層面初步探討了微波熱療協(xié)同鹽酸吉西他濱抑制肺鱗癌細(xì)胞NCI-H2170和NCI-H1703的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，潛在的機(jī)制可能與啟動(dòng)P53通路，使PARP蛋白活化，激活Caspase-3依賴性凋亡途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而發(fā)揮其抑制癌細(xì)胞增殖的作用。但要進(jìn)一步應(yīng)用于臨床，還有待于從動(dòng)物層面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖5 微波熱療聯(lián)合吉西他濱對(duì)肺鱗癌細(xì)胞中的p53、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、PARP、Cleaved-PARP、Bax、Bcl-2表達(dá)的影響。A：蛋白電泳圖；B、C：不同凋亡蛋白表達(dá)的柱狀分析圖。與對(duì)照組相比，*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001；與吉西他濱組相比，#：P＜0.05，##：P＜0.01，###：P＜0.001。Fig 5 The effects of microwave hyperthermia in combination with gemcitabine on the expressions of p53,Caspase-3,Cleaved-Caspase-3,PARP,Cleaved-PARP,Bax and Bcl-2 in lung squamous cell carcinoma cells.A:Protein electrophoresis;B,C:Columnar analysis of different apoptotic proteins.Compared with the control group,*:P＜0.05,**:P＜0.01,***:P＜0.001;compared with the gemcitabine group,#：P＜0.05，##：P＜0.01，###：P＜0.001.