關(guān)于二羧酸-三羧酸鹽載體蛋白負(fù)調(diào)控黃瓜花葉病毒積累的初步研究

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(浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310018)

0 引 言

黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)是屬于黃瓜花葉病毒屬(Cucumovirus)的典型成員，作為模式病毒已用于病毒致病性、病毒與寄主互作和病毒進(jìn)化等方面的研究[1]。CMV是一種經(jīng)濟(jì)型重要的植物病毒，能侵染近1000種植物[2-3]。CMV是一種正義單鏈RNA病毒，其基因組是由三條正義單鏈RNA組成，按照大小依次命名為RNA1、RNA2和RNA3。CMV基因組每條RNA鏈的5’-端均具有帽子結(jié)構(gòu)，且3’-端具有類似tRNA的結(jié)構(gòu)(tRNA-like structure，TLS)[4-5]。RNA1是單順?lè)醋樱幋a具有甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域和解旋酶結(jié)構(gòu)域的1a蛋白。RNA2編碼含RNA聚合酶活性的2a蛋白，并通過(guò)其亞基因組RNA4A編碼具有沉默抑制作用的2b蛋白[6-7]。CMV 1a和2a蛋白負(fù)責(zé)CMV的復(fù)制。免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示CMV 1a和2a蛋白定位于植物的液泡膜，由此推斷CMV的復(fù)制場(chǎng)所為液泡膜[8]。RNA3編碼兩個(gè)開(kāi)放閱讀框(Open reading frame，ORF)，其5’端ORF編碼移動(dòng)蛋白(Movement protein，MP)，負(fù)責(zé)病毒的胞間移動(dòng)和長(zhǎng)距離移動(dòng)[9]。第二個(gè)ORF則通過(guò)其亞基因組RNA4編碼外殼蛋白(Coat protein，CP)，負(fù)責(zé)病毒基因組的包裝和參與病毒的長(zhǎng)距離移動(dòng)[10-11]。

植物內(nèi)源的二羧酸-三羧酸鹽載體蛋白(Dicarboxylate-tricarboxylate carrier，DTC)定位于線粒體膜和液泡膜，負(fù)責(zé)二羧酸鹽和三羧酸鹽的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[12]，參與氨基酸的初步合成、脂肪酸的代謝和類異戊二烯的生物合成等代謝途徑[13-15]。擬南芥僅編碼1個(gè)DTC基因，而煙草則編碼4個(gè)DTC基因，分別為NtDTC1、NtDTC2、NtDTC3和NtDTC4[16]。目前關(guān)于DTC蛋白的功能研究較少，尚未見(jiàn)有關(guān)該蛋白參與生物脅迫的報(bào)道。為了探索DTC蛋白在病毒侵染方面的是否具有一定作用，本文通過(guò)煙草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus, TRV)誘導(dǎo)的基因沉默和植物中瞬時(shí)過(guò)表達(dá)方法，分析本氏煙中NtDTC2下調(diào)表達(dá)與過(guò)表達(dá)對(duì)CMV編碼蛋白的積累量影響，初步確定NtDTC2在CMV侵染寄主中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑

Q5超保真DNA聚合酶購(gòu)于New England BioLabs公司、限制性內(nèi)切酶購(gòu)于Thermo Fisher Scientific公司、凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)于Axygen公司、RT-PCR試劑盒購(gòu)于天根生物科技有限公司、eGFP抗體購(gòu)于Santa Cruz biotechnology公司，常規(guī)生化試劑購(gòu)于上海生工生物技術(shù)有限公司和Sigma貿(mào)易有限公司。

1.2 材料

本氏煙(Nicotianabenthamiana)幼苗于植物生長(zhǎng)室中恒溫培養(yǎng)，溫度為25 ℃，光周期為16 h/8 h(光照/黑暗)，待幼苗培養(yǎng)至兩周以上用于農(nóng)桿菌浸潤(rùn)。

CMV基因組RNA1、RNA2、RNA3的侵染性克隆pCB301-R1、pCB301-R2和pCB301-R3為實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建和保存，構(gòu)建方法參考文獻(xiàn)[17]。增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, eGFP)替換2b ORF的侵染性克隆pCB301-R2-eGFP和eGFP替換CP ORF的侵染性克隆pCB301-R3-eGFP，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存。病毒誘導(dǎo)的基因沉默載體pTRV-RNA1(TRV1)、pTRV-RNA2(TRV2)由清華大學(xué)劉玉樂(lè)教授實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 植物總RNA提取

利用液氮將0.1 g葉組織研磨粉碎，然后加入1.0 mL RNA提取溶液(50 mmol/L pH值5.2 NaAC，10 mmol/L pH值8.0 EDTA 和1%SDS)，繼續(xù)研磨至勻漿。吸取勻漿至RNase-free的1.5 mL離心管中，加入等量的水飽和酚，渦旋混勻；在4 ℃，12000 r/min條件下離心6 min。之后吸取上清，按照3∶2的比例加入苯酚/氯仿混合液(1∶1混合)，渦旋混勻；在4 ℃，12000 r/min條件下離心6 min后，吸取上清，然后用3倍體積的無(wú)水乙醇和1/10體積的3 mol/L NaAC (pH值5.2)沉淀RNA。最后，用DEPC水溶解RNA，利用Nanodrop測(cè)定所提RNA的濃度和純度。

1.4 質(zhì)粒的構(gòu)建

通過(guò)常規(guī)的克隆方法構(gòu)建DTC2的VIGS沉默質(zhì)粒。實(shí)驗(yàn)方法為：利用oligo(dT)12作為反轉(zhuǎn)錄引物，逆轉(zhuǎn)錄合成本氏煙總RNA的cDNA，并用特異的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。RT-PCR具體步驟根據(jù)天根生物科技有限公司RT-PCR試劑盒提供的說(shuō)明。以合成的cDNA作為模板，利用VIGS引物對(duì)VIGS Nb-Dtc2 F/VIGS Nb-Dtc2 R(表1)擴(kuò)增片段DTC2 VIGS，經(jīng)過(guò)BamH I和SmaI消化后克隆至預(yù)先用相同限制性內(nèi)切酶處理的載體pTRV2，經(jīng)挑取單斑鑒定后提取質(zhì)粒pTRV2-DTC2。構(gòu)建瞬時(shí)過(guò)表達(dá)本氏煙DTC2的質(zhì)粒p35S-DTC2。具體構(gòu)建方法為：以本氏煙cDNA為模板，利用引物對(duì)Dtc2-OE-F/Dtc2-OE-R(表1)擴(kuò)增DTC2全長(zhǎng)編碼序列，經(jīng)EcoRI和BamH I消化后克隆至預(yù)先用相同限制性內(nèi)切酶處理的質(zhì)粒p35S-Flag-HA，獲得重組克隆質(zhì)粒p35S-DTC2。所有質(zhì)粒需經(jīng)序列測(cè)定以保證序列的準(zhǔn)確性。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，挑斑鑒定后，保存于-80 ℃。

表1 構(gòu)建質(zhì)粒的引物序列

1.5 農(nóng)桿菌浸潤(rùn)接種

取50 μL保存于-80 ℃的農(nóng)桿菌(含相應(yīng)的質(zhì)粒)于含有抗生素利福平(30 mg/L)、慶大霉素(50 mg/L)和卡那霉素(50 mg/L)的5 mL的LB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃搖床，220 r/min的條件下培養(yǎng)16 h對(duì)菌種進(jìn)行菌種活化和擴(kuò)大培養(yǎng)，離心收集各個(gè)農(nóng)桿菌的菌體，最后將菌液懸浮于浸潤(rùn)緩沖液(10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L MES和200 mmol/L乙酰丁香酮)中。利用分光光度計(jì)測(cè)量菌液在600 nm下的OD值，調(diào)整TRV1、TRV2-DTC2、TRV2菌液OD值為0.2，調(diào)整35S-DTC2、35S-Flag-HA、pCB301-R1、pCB301-R2、pCB301-R3、pCB301-R2-eGFP以及pCB301-R3-eGFP菌液OD值為0.5。按照TRV1與TRV2-DTC2、TRV1與TRV2的組合將菌液等體積混合。混合后的菌液于暗處放置2～3 h，通過(guò)注射器接種于4～5葉期本氏煙。CMV注射后5 d，在紫外燈下觀察GFP熒光，并拍照保存。

1.6 本氏煙總蛋白提取及Western blot檢測(cè)

從0.2 g葉組織中提取植物總蛋白，具體操作方法參考文獻(xiàn)[18]。蛋白樣品需經(jīng)酶標(biāo)儀定量后，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。利用轉(zhuǎn)膜儀，在電壓100 V的條件下轉(zhuǎn)膜1 h，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。為了分析CMV編碼的eGFP的積累量，利用eGFP多克隆抗體進(jìn)行蛋白雜交檢測(cè)。結(jié)合一抗和二抗后，分別在TBST中洗膜三次，每次10 min，之后在TBS中洗膜10 min。利用ECL檢測(cè)膜并通過(guò)X射線膠片的放射自顯影來(lái)顯現(xiàn)蛋白的特異性條帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 pTRV2-DTC2重組克隆的構(gòu)建

從本氏煙中提取植物總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄得到本氏煙的cDNA，以cDNA為模板，利用VIGS Nb-Dtc2 F/VIGS Nb-Dtc2 R引物對(duì)擴(kuò)增DTC2 VIGS的DNA片段，片段預(yù)期大小約300 bp。PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖1(a)所示，PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增片段位于略高于250 bp條帶的位置處，其大小與預(yù)期片段大小相符。將PCR擴(kuò)增獲得的目的DNA片段經(jīng)BamH I和SmaI酶切，克隆至pTRV2載體，獲得pTRV2-DTC2重組質(zhì)粒，其電泳結(jié)果如圖1(b)所示。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定和測(cè)序，確定重組質(zhì)粒含有目的片段的插入，且序列未見(jiàn)任何的突變。

圖1 pTRV2-DTC2質(zhì)粒的構(gòu)建

2.2 pDTC2-OE質(zhì)粒的構(gòu)建

以本氏煙的cDNA為模板，利用Dtc2-OE-F/Dtc2-OE-R引物對(duì)擴(kuò)增DTC2的全長(zhǎng)cDNA，片段大小約800 bp，PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖2(a)所示。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物位于750～1000 bp條帶之間，與預(yù)期的片段大小相符。將PCR擴(kuò)增獲得的DTC2-OE片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamH I消化后，克隆至載體p35S-Flag-HA，獲得過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒p35S-DTC2。電泳檢測(cè)質(zhì)粒p35S-DTC2如圖2(b)所示，電泳圖顯示質(zhì)粒p35S-DTC2的大小與預(yù)期相符。質(zhì)粒經(jīng)PCR檢測(cè)和序列測(cè)定，確定為含有目的片段的陽(yáng)性克隆。

圖2 p35S-DTC2質(zhì)粒的構(gòu)建

2.3 TRV下調(diào)的DTC2 mRNA對(duì)CMV積累的影響

為了沉默本氏煙體內(nèi)的DTC2 mRNA，將TRV1和TRV2-DTC2混合注射入本氏煙葉片，并以混合注射TRV1和TRV2作為陰性對(duì)照。注射后12 d，在注射葉的上部葉片接種CMVΔ2b-eGFP。接種病毒5 d后，在紫外燈下觀察各個(gè)處理的綠色熒光，結(jié)果如圖3所示。與陰性對(duì)照組TRV2處理的植株相比，CMVΔ2b-eGFP在TRV2-DTC2處理的葉組織中呈現(xiàn)更強(qiáng)的綠色熒光。在接種病毒后5 d，采取病毒接種葉，并提取其總蛋白；以Rubisco為二磷酸核酮糖氧合酶，作為植物內(nèi)參蛋白用于確定蛋白的上樣量，通過(guò)Western blot檢測(cè)接種葉中eGFP的積累量，結(jié)果顯示：eGFP的積累量在TRV2-DTC2處理的葉組織中比對(duì)照組提高48%(圖4)，因此DTC2的下調(diào)表達(dá)促進(jìn)CMV攜帶的eGFP蛋白的積累，初步說(shuō)明DTC2對(duì)CMV侵染本氏煙具有負(fù)調(diào)控作用。

圖3 紫外燈下觀察DTC2下調(diào)后CMVΔ2b-eGFP病毒產(chǎn)生的GFP熒光

圖4 Western雜交檢測(cè)DTC2下調(diào)對(duì)后CMVΔ2b-eGFP病毒蛋白積累量

2.4 DTC2的過(guò)量表達(dá)對(duì)CMV積累的影響

為了進(jìn)一步分析DTC2對(duì)CMV積累的負(fù)調(diào)控作用，本文通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)過(guò)表達(dá)方法，測(cè)定DTC2的過(guò)表達(dá)對(duì)CMV積累的影響。在同一葉片上注射3個(gè)浸潤(rùn)斑，分別為Mock(只接種浸潤(rùn)緩沖液)、Vector(35S-Flag-HA)和35S-DTC2。浸潤(rùn)3 d后，在原來(lái)的浸潤(rùn)斑的位置接種CMVΔCP-eGFP，Mock組仍只接種浸潤(rùn)緩沖液。病毒接種3 d后，在紫外燈下觀察綠色熒光的強(qiáng)度，結(jié)果如圖5所示。在Vector和35S-DTC2處理的區(qū)域均出現(xiàn)明顯的GFP綠色熒光，表明CMVΔCP-eGFP接種區(qū)域已有效地復(fù)制和翻譯。與對(duì)照Vector相比，過(guò)量表達(dá)DTC2蛋白的注射斑的綠色熒光相對(duì)較弱。病毒接種3 d后分別采取每個(gè)注射斑的葉片樣品，利用Western blot檢測(cè)eGFP的積累量。結(jié)果顯示，本氏煙中過(guò)量表達(dá)DTC2蛋白后，CMV攜帶的eGFP的積累量與對(duì)照組相比減少24%(圖6)，這表明DTC2對(duì)CMV確實(shí)具有一定的影響，進(jìn)一步說(shuō)明DTC2對(duì)CMV有一定的負(fù)調(diào)控作用。

圖5 紫外燈下觀察DTC2過(guò)表達(dá)對(duì)CMVΔCP-eGFP產(chǎn)生GFP熒光的影響

圖6 Western雜交檢測(cè)DTC2過(guò)表達(dá)對(duì)CMVΔCP-eGFP產(chǎn)生的GFP蛋白積累量的影響

3 討 論

就DTC蛋白的功能而言，除了跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)二羧酸鹽和三羧酸鹽的功能之外[15]，尚未有其它功能的報(bào)道。本文通過(guò)基因沉默和過(guò)表達(dá)本氏煙DTC2，初步確定DTC2負(fù)調(diào)控CMV的積累。寄主因子負(fù)調(diào)控病毒積累的途徑包括降低病毒RNA的翻譯和復(fù)制效率以及降低病毒RNA的體內(nèi)穩(wěn)定性。擬南芥編碼的RNA結(jié)合蛋白APUM5通過(guò)結(jié)合CMV RNA的3’UTR，抑制病毒RNA的翻譯，從而負(fù)調(diào)控病毒的積累[19]。siRNA介導(dǎo)的抗病毒沉默是降低CMV RNA穩(wěn)定性的主要途徑，但是，CMV通過(guò)其編碼的RNA沉默抑制子2b蛋白競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合siRNA，能有效地抑制寄主的抗病毒RNA沉默[20-21]。由于本氏煙DTC2與CMV的復(fù)制場(chǎng)所均位于液泡膜，本氏煙DTC2可能參與調(diào)控CMV的翻譯或復(fù)制。除了寄主的蛋白因子之外，膜脂質(zhì)也參與病毒的復(fù)制，并扮演重要的角色。磷脂酰乙醇胺(Phosphatidyl ethanolamine，PE)和卵磷脂(Phosphatidylcholine，PC)分別正調(diào)控番茄叢矮病毒(Tomatobushystuntvirus，TBSV)和雀麥花葉病毒(Bromemosaicvirus，BMV)的復(fù)制[22-23]。DTC介導(dǎo)的二羧酸鹽和三羧酸鹽的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能夠參與脂肪酸的代謝途徑[14-15]。因此，本氏煙DTC2的下調(diào)表達(dá)或過(guò)表達(dá)有可能影響植物體內(nèi)脂質(zhì)的合成代謝，從而間接地影響CMV的積累，關(guān)于DTC2調(diào)控CMV積累的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

本文通過(guò)構(gòu)建DTC2的沉默載體以及過(guò)表達(dá)載體，在本氏煙中下調(diào)表達(dá)或過(guò)表達(dá)DTC2后，Western blot分析CMV編碼的GFP量的變化，主要結(jié)論如下：

a) 本氏煙DTC2下調(diào)表達(dá)促進(jìn)CMVΔ2b-eGFP的積累；

b) 本氏煙DTC2過(guò)表達(dá)抑制CMVΔCP-eGFP的積累。

基于以上結(jié)果，初步確定本氏煙DTC2蛋白在植物中負(fù)調(diào)控CMV的積累，DTC2調(diào)控CMV侵染寄主植物的分子機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。